昝子葉 柯 飛 趙威山 鄒 紅 王桂堂 吳山功

(1. 中國科學院水生生物研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水養(yǎng)殖病害防控重點實驗室, 水產(chǎn)品種創(chuàng)制與高效養(yǎng)殖重點實驗室(中國科學院), 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

近年來, 隨著養(yǎng)殖密度不斷提高, 加之種質(zhì)退化、水環(huán)境污染加劇、病原微生物大量滋生, 養(yǎng)殖水產(chǎn)動物疾病頻繁發(fā)生, 給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失, 因此疾病防治受到越來越多的重視[1]?？股氐然瘜W藥物是疾病防治的常用藥物, 然而這些化學藥物的使用會產(chǎn)生耐藥性及藥物殘留問題[2]。疫苗可以預防傳染病暴發(fā), 又不會導致細菌的耐藥性及藥物殘留, 因而成了未來魚病防治的重要發(fā)展方向[3]。但傳統(tǒng)注射和浸泡疫苗有諸多不便, 口服的方式更加方便快捷。不過, 動物的胃腸道環(huán)境制約了口服疫苗的研發(fā)及使用, 因此亟須尋找高效的抗原呈遞平臺。

芽孢桿菌(Bacillusspp.)是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的益生菌, 不僅能改善養(yǎng)殖環(huán)境、減少疾病發(fā)生, 還能促進水產(chǎn)動物的生長發(fā)育[4,5]。芽孢桿菌也是異源蛋白表達的安全宿主(Generally Recognized As Safe), 已被開發(fā)為成熟的蛋白表達系統(tǒng)[6]。芽孢桿菌的芽孢對高溫、酸堿環(huán)境、裂解酶和多種化學物質(zhì)等具有很強的抗逆性, 因此可利用芽孢的衣殼蛋白(如CotC、CotB和CotG等), 在芽孢的內(nèi)生過程中, 將異源抗原穩(wěn)定地展示在芽孢表面, 構(gòu)建芽孢表面展示系統(tǒng), 使其成為口服疫苗抗原遞送的理想平臺[7]?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)是迄今為止研究最為清楚的芽孢桿菌, 目前枯草芽孢桿菌芽孢表面展示(Bacillus subtilisSpore Surface Display)已成功地用于藥物或抗原的呈遞[8]、工業(yè)酶類的展示[9]、環(huán)境污染物的監(jiān)測與降解[10]、化學物質(zhì)和重金屬物質(zhì)的生物吸附[11,12]及生物傳感器的構(gòu)建[13]等多個領域。

芽孢表面展示基因工程口服疫苗能夠克服傳統(tǒng)疫苗在胃腸道中易受到胃酸和消化酶作用而降解的弊端, 將抗原穩(wěn)定呈遞到腸道, 發(fā)揮更加高效的免疫性能[14]。因而, 芽孢桿菌芽孢表面展示系統(tǒng)引起了科研人員的廣泛興趣。目前芽孢桿菌芽孢表面展示系統(tǒng)已被用于畜禽[15—17]及水產(chǎn)動物[18—20]疫苗開發(fā), 本文介紹了水產(chǎn)動物疫苗研發(fā)中芽孢桿菌芽孢和感受態(tài), 以及芽孢表面展示系統(tǒng), 并特別介紹了芽孢作為口服疫苗載體在預防水產(chǎn)動物細菌病、病毒病和寄生蟲病方面的研究與應用現(xiàn)狀,以期為水產(chǎn)動物高效穩(wěn)定口服疫苗的開發(fā)提供參考。

1 芽孢桿菌特殊形態(tài)結(jié)構(gòu)

芽孢桿菌是一類好氧或兼性厭氧、能產(chǎn)生抗逆性內(nèi)生芽孢的革蘭氏陽性菌, 菌體呈桿狀, 有鞭毛。芽孢桿菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)對其生長繁殖以及適應特殊環(huán)境具有非常重要的作用。芽孢和感受態(tài)這兩種特殊形態(tài)結(jié)構(gòu)是芽孢桿菌在長期的自然進化過程中形成的生存適應能力, 也是細胞高度有序的遺傳調(diào)控的結(jié)果[21]。在枯草芽孢桿菌生長發(fā)育后期, 當環(huán)境中出現(xiàn)密度增加、營養(yǎng)物質(zhì)匱乏等生存壓力時, 芽孢桿菌會通過激活鞭毛運動、分泌抗生素和大量水解酶等方式減輕環(huán)境壓力, 但若未產(chǎn)生太大效果, 其中50%—70%的細胞將進入芽孢形成途徑, 而進入芽孢形成途徑中的少數(shù)細胞(≤20%)會進入感受態(tài)形成途徑[22—24]。

芽孢對極端溫度、壓力、酸堿環(huán)境、紫外線、輻射和多種化學物質(zhì)等有很強的抗逆性[25—27],強抗逆性主要基于成熟芽孢的“新結(jié)構(gòu)”, 這些結(jié)構(gòu)被兩層膜分隔為3個同心小室, 呈現(xiàn)出同心殼層形式的多層結(jié)構(gòu); 由外向內(nèi)包括芽孢外壁(Exosporium)、芽 孢 衣 殼(Spore coat)、外 膜(Outer membrane)、皮層(Cortex)、生殖細胞壁(Germ cell wall)、內(nèi)膜(Inner membrane)及芽孢核心(Spore core), 其中核心中貯存遺傳物質(zhì)DNA, 芽孢衣殼作為芽孢桿菌芽孢表面展示的重要結(jié)構(gòu), 主要由內(nèi)層衣殼(Inner spore coat)和外層衣殼(Outer spore coat)構(gòu)成[28—31](圖1)。

感受態(tài)是細胞的一種瞬時生理狀態(tài), 此時, 細胞能從環(huán)境中攝取外源DNA分子[32]。通常在對數(shù)生長期后期, 枯草芽孢桿菌能形成自然感受態(tài)細胞[33],但群體中僅有10%的細胞可以分化形成感受態(tài), 因此轉(zhuǎn)化效率一般比較低。芽孢桿菌感受態(tài)的形成首先受到群感效應(Quorum sensing)和情景選擇(Episodic Selection)的限制, 然后受到一種二元信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)的精密調(diào)控, 復雜的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)保證了機體特異感受態(tài)信息素(ComX和CSF)被適當激活,進而刺激感受態(tài)形成[34—36]。

2 芽孢表面展示系統(tǒng)

首個芽孢表面展示系統(tǒng)由Isticato等[37]于2001年構(gòu)建, 通過將破傷風毒素C片段(Tetanus Toxin Fragment C, TTFC)中459個氨基酸片段與枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白CotB融合, 轉(zhuǎn)化后在淀粉酶基因amyE處發(fā)生同源重組, 最終將TTFC抗原展示在芽孢表面, 開發(fā)了一種新型高效的抗原呈遞模式。芽孢表面展示系統(tǒng)具有很多獨特的優(yōu)勢: (1)可展示分子量較大外源蛋白和多聚體外源蛋白[38]; (2)外源蛋白隨芽孢的內(nèi)生而展示, 不需要跨越細胞膜[39,40];(3)有一套完整消耗ATP的分子伴侶體系, 幫助外源蛋白快速正確折疊, 使其保持原有空間構(gòu)象和生物活性[28,41]; (4)芽孢抗逆性擴大了外源蛋白的應用范圍, 可抵抗高溫、強酸堿和輻射等不良環(huán)境長時間存活[42,43]。因此基因工程技術與芽孢表面展示系統(tǒng)相結(jié)合, 構(gòu)建重組型芽孢表面展示系統(tǒng)的研究受到了科研人員越來越多的關注。

一個完整的芽孢表面展示系統(tǒng)主要由宿主菌、錨定蛋白和表達載體三個部分組成。此外, 連接肽能夠提高表面展示效率, 也常常被用于芽孢表面展示系統(tǒng)中。

2.1 宿主菌

目前芽孢表面展示常用宿主菌有蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)[44]、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)[45]和枯草芽孢桿菌[37]三種?？莶菅挎邨U菌是目前研究最多的代表菌種, 已在農(nóng)業(yè)、工業(yè)等領域被廣泛使用[46—49]。蘇云金芽孢桿菌是農(nóng)業(yè)上重要的生物防治菌株[50]。與另外兩種宿主菌相比, 枯草芽孢桿菌具有很多優(yōu)勢: (1)研究最早且最深入, 基因組注釋信息清楚, 已建立完善遺傳操作體系; (2)芽孢結(jié)構(gòu)研究較深入, 解析最全面[51,52];(3)不含毒素, 是公認安全且可直接食用的微生物,目前已作為益生菌在人類和其他動物中廣泛使用[53]。

枯草芽孢桿菌168菌株是最早被發(fā)現(xiàn)可在自然狀態(tài)下形成感受態(tài), 并實現(xiàn)外源DNA轉(zhuǎn)化的芽孢桿菌菌株[54]?；谶@一發(fā)現(xiàn), Anagnostopoulos與Spizizen[55]于1960年建立了168菌株感受態(tài)細胞的化學制備體系, 為枯草芽孢桿菌的分子遺傳操作奠定了基礎。1997年日本和歐洲的幾個實驗室聯(lián)合完成了Bacillus subtilis168菌株基因組的全基因組測序[56]。近年來, 研究人員對枯草芽孢桿菌遺傳轉(zhuǎn)化和表達系統(tǒng)進行了更加深入的研究, 越來越多枯草芽孢桿菌工程菌株, 如WB600、WB700和WB800等的出現(xiàn), 為芽孢表面展示系統(tǒng)的研究與應用提供了更多的可能性。但目前芽孢表面展示系統(tǒng)宿主菌的選擇還是比較有限, 還應該挖掘更多適應不同環(huán)境的菌種(株), 如地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的益生菌, 以地衣芽孢桿菌作為宿主菌, 可能實現(xiàn)在展示特定外源蛋白的同時, 還能夠作為益生菌發(fā)揮益生功能。

2.2 錨定蛋白

芽孢表面展示所使用的錨定蛋白一般是芽孢衣殼蛋白, 在選擇衣殼蛋白時需要考慮其位置和豐度, 以實現(xiàn)較好的表面展示效率。已報道的可用作錨定蛋白的芽孢衣殼蛋白包括CotB、CotC、CotG、CotX、CotY、CotZ和OxdD等, 其中CotB、CotC和CotG三種衣殼蛋白是目前研究最多且深入的, 它們位于芽孢外衣殼層, 其位置和豐度都保證了展示的外源蛋白與外界環(huán)境有高水平的接觸[57]。

CotB是首個應用于芽孢表面展示系統(tǒng)以展示外源蛋白的衣殼蛋白, 其與外源蛋白通過C端、N端和中間融合三種方式融合, 以不同的長度(包括全部氨基酸序列或N端部分氨基酸序列), 均可將有活性的外源蛋白成功展示在芽孢表面[37,58]。目前CotB已成功用于多種抗原和酶類的表面展示, 如炭疽芽孢桿菌的保護性抗原PA[59]、艱難梭菌(Clostridium difficile)的鞭毛帽蛋白FliD[60]和酯酶[61]等?；贑otC的芽孢表面展示均使用其全長氨基酸序列,C端和N端融合方式均可實現(xiàn)表面展示[62—64]。目前CotC已成功用于多種酶類的表面展示, 如尿素酶A亞基UreA[65]、乙醇脫氫酶[42]和β-半乳糖苷酶[66]等, 可顯著提升酶對惡劣環(huán)境的耐受能力。基于CotG的表面展示均以CotG的完整氨基酸序列作為錨定蛋白, 大部分以C端融合的方式進行。Kim等[38]通過CotG將四聚體外源蛋白鏈霉親和素成功展示到芽孢表面。目前CotG已涉及單體、二聚體和四聚體等外源蛋白表面展示, 如N-乙基神經(jīng)氨酸醛縮酶[67]、ω-轉(zhuǎn)氨酶[68]、腈水解酶[69]等。

此外, 其他錨定蛋白如CotX、CotY、CotZ和OxdD, 已成為后起之秀。以綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)作為報告基因, CotX作為錨定蛋白, 李倩等[70]觀察到重組芽孢表面發(fā)出綠色熒光,證明CotX可作為錨定蛋白進行表面展示。類似地,將增強型綠色熒光蛋白(Enhanced Green fluorescent protein, EGFP)與錨定蛋白CotY通過C端融合的方式, 可以成功將其展示在芽孢表面[71]。而CotZ是位于更接近芽孢表面的外衣殼蛋白, 利于外源蛋白充分展示在芽孢表面, Negri等[61]以CotZ為錨定蛋白, 成功在芽孢表面展示鞭毛蛋白FliD。值得關注的是, OxdD是目前報道的唯一可作為錨定蛋白的芽孢內(nèi)衣殼蛋白, 植酸酶與OxdD通過C端融合的方式, 成功地將植酸酶展示在芽孢表面并具有相應的酶活性[72]。

越來越多的可用于芽孢表面展示的衣殼蛋白的發(fā)現(xiàn), 為提高表面展示效率提供了新的思路, 利用多種衣殼蛋白同時展示同一種外源蛋白或不同種外源蛋白, 增加表面展示的外源蛋白數(shù)量和種類,是值得進一步探索的方向, 將為芽孢表面展示系統(tǒng)研究與應用提供更多的可能性。

2.3 表達載體

芽孢表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建可以通過基因重組(圖2)和非基因重組兩種方法進行[73]。

圖2 基因重組法構(gòu)建芽孢表面展示系統(tǒng)示意圖Fig. 2 Schematic representation of spore surface display system constructed by genetic recombination strategy

通過基因重組方法構(gòu)建時使用的質(zhì)粒有兩種,整合型和游離型[74]。整合型質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入感受態(tài)細胞后, 與枯草芽孢桿菌基因組發(fā)生重組, 目的基因整合到基因組中, 后在特定啟動子作用下開始表達[75]。整合策略有單交換和雙交換兩種, 其中雙交換是目前研究中使用最多的。構(gòu)建雙交換整合型載體時, 選擇的同源臂多為破壞后不影響芽孢桿菌正常生長的基因, 如lacA、scaA、gltA、trpC、amyE和pyrD等[8,76,77,78]; 同源臂的長度至少為400—500 bp,才能發(fā)生有效重組[79]。淀粉酶基因amyE是使用最多的同源臂基因, 整合后因外源基因的插入使amyE被破壞, 宿主菌失去分解淀粉的能力。游離型質(zhì)粒攜帶目的基因轉(zhuǎn)化進入枯草芽孢桿菌感受態(tài)細胞后可進行獨立復制與表達[74]。使用游離型載體構(gòu)建表面展示系統(tǒng)操作簡單, 轉(zhuǎn)化率相對較高, 但質(zhì)粒遺傳不穩(wěn)定, 容易隨著宿主菌的分裂增殖而丟失,給后續(xù)實驗帶來一定的風險[80]。因此, 尋找遺傳穩(wěn)定不易丟失的穿梭型質(zhì)粒是未來探究的方向。非基因重組方法是將純化的外源蛋白與芽孢共同培養(yǎng), 由于兩者之間存在靜電和疏水作用可相互結(jié)合,最后吸附于芽孢表面, 或使用交聯(lián)劑將它們固定在孢子表面, 最終發(fā)揮作用[81,82]。

總之, 無論是基因重組方法, 還是非基因重組的方法, 都可以將外源目的蛋白展示在芽孢表面, 進而發(fā)揮作用。表面展示效率是系統(tǒng)構(gòu)建的關鍵, 容易在體外得到大量純化的外源蛋白, 可先通過基因重組方法將其展示到芽孢表面, 再利用非基因重組方法, 將外源蛋白吸附于芽孢表面, 兩種方法結(jié)合將更多的外源蛋白展示于芽孢表面, 提高表面展示效率。

2.4 連接肽

在錨定蛋白和外源蛋白之間插入合適的連接肽, 可使錨定蛋白和外源蛋白之間形成空間位阻,利于兩者正確進行空間折疊, 保證表面展示外源蛋白的活性[83]。GGGGS和EAAAK是目前常用的兩種連接肽[84,85]。連接肽(GGGGS)n(n≤6), 由于甘氨酸含量高, 使其柔軟易彎曲, 因此也被稱為柔性連接肽[84]。但柔性連接肽存在一些弊端, 過于柔軟導致融合蛋白整體易對折靠攏形成二聚體, 導致外源蛋白活性下降。隨后研究人員在兩種綠色熒光蛋白之間引入了能形成α-螺旋結(jié)構(gòu)的(EAAAK)n(n=2—5)序列, 該序列可有效控制兩種蛋白間的距離, 減少功能域之間的干擾, 也被稱為剛性連接肽[85]。其后, Huang等[86]將柔性連接肽GGGGS (F)和剛性連接肽EAAAK (R)結(jié)合形成RRRRR、FFFFF及FFFRR三種連接肽, 進一步構(gòu)建酸性磷酸酶-綠色熒光蛋白融合蛋白PhoC-GFP, 比較分析發(fā)現(xiàn)連接肽的靈活性可以有效調(diào)節(jié)PhoC-GFP的活性, 在使用FFFRR連接肽時, PhoC-GFP的酶活性最高。綜上所述, 適當?shù)乩眠B接肽可一定程度上提升外源蛋白展示的穩(wěn)定性和高效性, 在構(gòu)建芽孢表面展示系統(tǒng)時加入連接肽是非常有必要的。

3 芽孢表面展示系統(tǒng)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用

從動物福利、經(jīng)濟成本和方便程度等角度考慮, 口服接種是水產(chǎn)動物較理想的免疫接種方式[87]?？诜庖咧饕峭ㄟ^刺激魚體腸道黏膜系統(tǒng)來產(chǎn)生免疫應答反應, 但口服后抗原會受到高濃度胃酸和腸道蛋白酶的作用而被破壞, 免疫原性降低, 保護效果不佳, 這是阻礙水產(chǎn)動物口服疫苗發(fā)展的主要原因[88,89]。研究表明, 芽孢桿菌芽孢可以作為免疫佐劑, 還可作為疫苗的呈遞載體[90]。在具有適應性免疫系統(tǒng)的脊椎動物中, 芽孢能被腸道中特異性上皮細胞微褶細胞攝取, 與Peyer氏斑中的淋巴細胞和抗原提呈細胞發(fā)生相互作用, 刺激機體產(chǎn)生免疫應答; 在不具有適應性免疫系統(tǒng)的無脊椎動物中, 芽孢能夠刺激細胞吞噬作用和非特異性免疫保護[91—93]。芽孢具有強抗逆性, 因此芽孢表面展示系統(tǒng)可作為口服疫苗抗原遞送的理想平臺, 目前芽孢表面展示系統(tǒng)已經(jīng)在預防水產(chǎn)動物細菌性疾病、病毒性疾病和寄生蟲病方面有相關報道(表1)。

表1 芽孢表面展示系統(tǒng)在水產(chǎn)疫苗研發(fā)中的研究進展Tab. 1 Research progress of spore surface display systems in aquatic vaccine development

3.1 細菌病疫苗

羅非魚鏈球菌病是嚴重威脅羅非魚(Oreochromis mossambicus)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的一類疾病, 發(fā)病率和死亡率高, 造成嚴重的經(jīng)濟損失[94]。致病的病原菌有無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)和海豚鏈球菌(Streptococcus iniae), 其中無乳鏈球菌是主要病原, 屬于鏈球菌科(Streptococcace),鏈球菌屬(Streptococcus), 而Sip蛋白是位于大部分無乳鏈球菌表面的一種蛋白, 具有高度保守性[95]。Yao等[96]利用衣殼蛋白CotC在芽孢表面展示Sip蛋白, 用重組芽孢GC5-Sip口服灌胃免疫羅非魚, 發(fā)現(xiàn)GC5-Sip組血清中存在Sip特異性抗體, 脾臟和腸道中免疫相關基因TNF-α、TGF-β、MHC-I和T-bet的表達水平顯著提高。攻毒試驗后GC5-Sip對無乳鏈球菌感染的相對保護率(Relative Percentage Survival,RPS)達到41.7%, 表明重組芽孢GC5-Sip可誘導魚體的細胞免疫和體液免疫反應, 在一定程度上保護羅非魚免受無乳鏈球菌感染。

弧菌病是水產(chǎn)養(yǎng)殖中最嚴重的細菌性疾病之一, 能感染各種淡水和海水魚類、蝦類和雙殼類動物, 引起出血性敗血癥, 死亡率高, 制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展[97]?；【鷮?Vibriospp.)細菌, 如副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)和哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)等均可引起弧菌病[98]。外膜蛋白OmpK是致病性弧菌的共同抗原, Gon?alves等[19]利用衣殼蛋白CotY在芽孢表面成功展示OmpK蛋白, 以重組芽孢CotY-OmpK浸泡免疫斑馬魚(Danio rerio)幼魚,V.parahaemolyticus或V.anguillarum感染斑馬魚后, 幼魚存活率分別提高了40%和85%; 繼而口服免疫歐洲齒舌鱸(Dicentrarchus labrax)幼魚,V.anguillarum感染鱸后, 結(jié)果CotY-OmpK組幼魚存活率從60%提高至87%, 表明芽孢可以作為弧菌病口服疫苗載體, 提高魚類感染致病弧菌后的存活率。

目前雖然可以使用滅活疫苗或者減毒活疫苗預防細菌性疾病, 但這些疫苗主要通過注射方式來進行接種, 使用極不方便。如果利用非基因重組的方式, 將滅活疫苗吸附于芽孢表面, 芽孢作為免疫佐劑, 將滅活疫苗呈遞到水生動物腸道, 進而發(fā)揮更加高效、安全、快捷的免疫保護效果, 將能夠大大降低水生動物細菌性疾病的發(fā)病率。

3.2 病毒病疫苗

草魚出血病 草魚出血病是危害我國草魚(Ctenopharyngodon idella)養(yǎng)殖行業(yè)最嚴重的一種病毒性疾病, 患病草魚死亡率高達70%—80%, 幾乎每年都會造成巨大的經(jīng)濟損失[99]。該病病原是草魚呼腸孤病毒(Grass Carp Reovirus, GCRV), 隸屬呼腸孤病毒科(Reoviridae), 水生呼腸孤病毒屬(Aquareovirus), 不僅能感染草魚, 而且還能感染其他經(jīng)濟魚類; 病毒的11個基因片段共編碼13個蛋白, 包括7個結(jié)構(gòu)蛋白(VP4、VP7和VP56等)和6個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS31、NS38和NS80等)[100]。

任鵬麗[101]構(gòu)建重組芽孢CotC-VP4并口服免疫草魚, 以注射珠江水產(chǎn)研究所商品化減毒活疫苗為陽性對照組, 基礎飼料為陰性對照組。研究發(fā)現(xiàn),與陰性對照相比, CotC-VP4組血清中特異性IgM抗體水平和腎臟中免疫相關細胞因子IgM和TLR22表達水平顯著升高, 表明CotC-VP4可使魚體產(chǎn)生一定的抗病毒免疫效應, 在病毒入侵時提供保護作用,但免疫保護效果不及陽性對照組顯著。Jiang等[102]也構(gòu)建了重組芽孢CotC-VP4口服疫苗并免疫草魚,以注射商品GCRV減毒疫苗為陽性對照, 基礎飼料為陰性對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與陰性對照相比, CotC-VP4可誘導腸黏液中特異性IgZ抗體水平升高, 多個免疫相關基因的表達水平顯著上調(diào); 在GCRV攻毒后,CotC-VP4組草魚存活率為57%, RPS 47%, 表明該重組芽孢可觸發(fā)魚體免疫反應, 提高草魚抗GCRV感染的能力, 但整體保護效果低于陽性對照組(存活率達89%)。

Chen等[103]利用魚源枯草芽孢桿菌GC5菌株,構(gòu)建重組芽孢CotC-VP4和CotC-NS38, 經(jīng)口灌服免疫草魚后, 發(fā)現(xiàn)均提高了草魚抗GCRV感染的能力。進一步研究發(fā)現(xiàn), CotC-VP4主要通過誘導IgT轉(zhuǎn)錄水平上調(diào), 引發(fā)魚體特異性抗體反應; 而CotCNS38通過誘導炎癥反應和主要組織相容性復合物(MHC)的表達, 最終保護草魚免受GCRV感染。Sun等[104]分別以淀粉酶基因amyE和芽孢萌發(fā)必需基因cwlJ為整合位點, 構(gòu)建重組芽孢ΔamyECotB-VP7和ΔcwlJCotB-VP7。在口服免疫草魚后, 各實驗組均可誘導血清中特異性IgM抗體水平、腎臟中免疫相關基因IL-1β、TNF-α、MHCII和CD4L的表達水平上調(diào), 在感染GCRV后, ΔamyECotB-VP7和ΔcwlJCotB-VP7的RPS分別達到28.09%和50.66%。但ΔcwlJCotB-VP7可引發(fā)草魚更高的免疫反應水平,可能是因為其一直處于芽孢狀態(tài), 可持續(xù)呈遞抗原[104]。而Gao等[105]將編碼VP56蛋白的基因分成4個片段,篩選得到最佳抗原VP56-2, 繼而構(gòu)建重組芽孢CotC-VP56-2并口服免疫草魚。結(jié)果顯示, CotCVP56-2誘導了脾臟和頭腎中更高的特異性IgM抗體水平, 以及免疫相關細胞因子IL-1β、TNF-α、IFN1和MHC-Ⅱ的轉(zhuǎn)錄表達, 在感染GCRV后, 腎臟和脾臟組織中病變范圍明顯縮小, 病毒載量降低, 有效保護草魚抗GCRV感染。

大口黑鱸蛙虹彩病毒病大口黑鱸蛙虹彩病毒病會在短時間內(nèi)造成大口黑鱸(Micropterus salmoides)暴發(fā)疾病并大規(guī)模死亡, 導致大口黑鱸養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)遭受重大經(jīng)濟損失[106]。該病由大口黑鱸蛙虹彩病毒(Largemouth bass virus, LMBV)引起, LMBV屬于虹彩病毒科(Iridoviridae), 蛙病毒屬(Ranavirus),其MCP蛋白對于病毒顆粒的組裝和誘導免疫反應至關重要[107]。Wang等[20]利用衣殼蛋白CotC表面展示MCP, 構(gòu)建重組芽孢CotC-LMBV, 口服免疫大口黑鱸后發(fā)現(xiàn), CotC-LMBV組鱸血清中特異性IgM抗體水平顯著升高, 脾臟中免疫相關基因CD4-1、IgM、IL-6和IFN-γ表達水平顯著上調(diào); 攻毒試驗表明, CotC-LMBV組鱸的存活率提高, RPS達45.0%,表明鱸的先天性和適應性免疫被激活, 以提供免疫保護作用。

魚類病毒性神經(jīng)壞死癥魚類病毒性神經(jīng)壞死癥, 作為世界動物衛(wèi)生組織(Office International Des épizooties)必報的傳染病之一, 危害多種海水和淡水魚類, 感染后幼魚的死亡率高達80%—100%[108]。該病的病原為神經(jīng)壞死病毒(Nervous Necrosis Virus, NNV)[109], 其主要衣殼蛋白MCP是保守的, 在病毒侵襲和復制中發(fā)揮重要作用[110]。Mai等[111]構(gòu)建重組芽孢CotC-MCP, 口服免疫石斑魚(Epinephelusssp.)幼魚, 發(fā)現(xiàn)CotC-MCP組腎臟中免疫相關基因TNF-α、IL-1β、MHCI、IgD和IgM的轉(zhuǎn)錄水平均顯著提高, 在感染試驗后, CotC-MCP組幼魚相對存活率達88.89%, 對照組成活率為0, 說明展示的MCP發(fā)揮了很好的免疫保護效果。

對蝦白斑綜合征對蝦白斑綜合征是嚴重危害對蝦(Penaeus)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的病毒性疾病之一, 會引起對蝦暴發(fā)性死亡, 該病病原為白斑綜合征病毒(White Spot Syndrome Virus, WSSV), 屬線頭病毒科(Nimaviridae), 白斑病毒屬(Whispovirus)[112]。VP26和VP28蛋白是WSSV兩種最主要的囊膜蛋白,約占囊膜蛋白的60%[113]。

Ning等[114]構(gòu)建重組芽孢CotB-VP28和CotCVP28, 口服免疫克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)后, 進行感染試驗, 發(fā)現(xiàn)重組芽孢組克氏原螯蝦的存活率均提高, RPS分別為37.9%和44.8%。這是首次在水生無脊椎動物中使用芽孢表面展示系統(tǒng), 所展示的抗原都有免疫保護效果, 但免疫保護效果的高低與錨定蛋白的選擇相關。而后Nguyen等[115]構(gòu)建重組芽孢CotB-VP28, 口服免疫南美白對蝦(Litopenaeus vannamei)后, 發(fā)現(xiàn)CotB-VP28組超氧化物歧化酶和酚氧化酶活性均有增加的趨勢, 表明對蝦的先天免疫反應在一定程度上被激發(fā)。Pham等[116]也構(gòu)建重組芽孢CotB-VP28, 口服免疫斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon), 發(fā)現(xiàn)CotB-VP28誘導血液中產(chǎn)生更多的總血細胞、透明細胞和顆粒細胞, 以及血清中更高的酚氧化酶活性(1.26倍); 在病毒感染后,CotB-VP28組對蝦存活率達75%, 表現(xiàn)出更強的免疫保護效果。此外, Valdez等[93]構(gòu)建了重組芽孢CotC-VP26和CotC-VP28, 口服免疫南美白對蝦, 感染試驗發(fā)現(xiàn)CotC-VP26和CotC-VP28芽孢可保護100%和90%的幼蝦免受WSSV感染, 顯示VP26具有更強的免疫保護效果。

以上研究表明, 利用芽孢表面展示系統(tǒng)展示病毒抗原片段, 對于病毒的感染具有一定的保護效果,但保護效果低于直接注射減毒疫苗, 可能是由于目前的研究展示的病毒抗原較單一。此外, 胃腸道環(huán)境對疫苗的破壞、接種的疫苗難以突破黏膜屏障、抗原呈遞細胞對芽孢表面展示抗原的識別效率低, 這些因素都會影響到疫苗的免疫保護效果。每一個病毒顆粒都有很多的不同抗原片段, 若將多個抗原蛋白通過多個錨定蛋白同時進行表面展示,并使用連接肽以減少不同抗原蛋白相互之間的干擾, 將可能提高表面展示效率, 刺激機體產(chǎn)生更強的免疫反應。

3.3 寄生蟲病疫苗

華支睪吸蟲(Clonorchis sinensis)是重要的魚源性人畜共染寄生蟲, 能夠引起華支睪吸蟲病, 嚴重危害人類和動物的健康[117,118]。華支睪吸蟲的生活史包括成蟲、蟲卵、毛蚴、胞蚴、雷蚴、尾蚴、囊蚴及后尾蚴等階段, 其中當尾蚴遇到合適的第二中間宿主(一些淡水魚或蝦)時, 可寄生其體內(nèi)并形成囊蚴[119]。

華支睪吸蟲的半胱氨酸蛋白酶(CsCP)與其孵化、營養(yǎng)獲取、免疫逃避等密切相關[120], Tang等[121]構(gòu)建重組芽孢CotC-CP, 口服免疫草魚, 發(fā)現(xiàn)CotCCP組血清、膽汁、腸黏液和體表黏液中特異性IgM抗體水平顯著提高, 低密度尾蚴(50尾/每尾魚)感染試驗發(fā)現(xiàn)CotC-CP芽孢可提供100%的保護率, 表明重組CotC-CP芽孢可預防囊蚴的形成和感染。烯醇化酶(CsENO)是華支睪吸蟲行寄生生活時, 宿主與病原體相互作用的表面受體[122]。Jiang等[123]構(gòu)建重組芽孢CotC-CsENO, 口服免疫草魚, 發(fā)現(xiàn)CotCCsENO誘導血清、腸黏液和體表黏液中特異性IgM抗體水平提高, 脾臟、頭腎和后腸中多個免疫相關基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào), 表明CotC-CsENO芽孢可誘導體液免疫、細胞免疫及全身和局部的黏膜免疫, 為草魚提供免疫保護。華支睪吸蟲副肌球蛋白(CsPmy)是蠕蟲類寄生蟲的一種參與肌肉生理收縮和免疫調(diào)節(jié)的多功能分子[124], 也是囊蚴階段囊壁的重要組成部分[125], Sun等[18]構(gòu)建重組芽孢CotC-CsPmy, 在口服免疫草魚后, 發(fā)現(xiàn)CotC-CsPmy可誘導血清、膽汁、腸黏液和體表黏液中特異性IgM抗體水平顯著上調(diào), 以及脾臟和頭腎中IgM、IgZ、IL-8和TNF-α的mRNA水平顯著提高, 感染試驗發(fā)現(xiàn), 每克魚肉中囊蚴數(shù)量明顯減少, 表明CotC-CsPmy重組芽孢可預防尾蚴粘附或入侵草魚, 進而影響囊蚴的形成。

目前芽孢表面展示系統(tǒng)在寄生蟲病方面的研究還局限在華支睪吸蟲一種寄生蟲上, 對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物危害嚴重的寄生蟲如小瓜蟲、三代蟲等, 尚未涉及。將重要寄生蟲病原的抗原蛋白展示到芽孢表面, 用于預防魚類寄生蟲的感染, 將能夠降低寄生蟲病的發(fā)病率。

4 展望

盡管芽孢表面展示系統(tǒng)在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面的應用還不是很多, 但目前在重要的細菌[96]、病毒[104]和寄生蟲[18]病原中的研究已表明其作為口服疫苗抗原遞送平臺的優(yōu)勢及可行性。我國水產(chǎn)養(yǎng)殖動物品種眾多, 重要病原也很多, 如嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、鱖傳染性脾腎壞死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus)、桃拉綜合征病毒(Taura syndrome virus)、小瓜蟲(Ichthyophthirius)和三代蟲(Gyrodactylus)等[126—128]。未來可針對重要病原, 利用芽孢表面展示系統(tǒng)開發(fā)更多的水產(chǎn)動物口服疫苗, 提供一種新型高效的病害防控手段。另外, 提高抗原呈遞效率和免疫保護效果也是未來的研究方向之一。影響抗原的呈遞效率的因素很多, 包括錨定蛋白的定位和特性、展示的抗原蛋白的性質(zhì)、連接方式、表達載體的類型及連接肽的種類等[129], 都可以進行優(yōu)化以提高抗原呈遞效率。也可以利用多個不同的錨定蛋白, 在芽孢衣殼表面展示多種不同的抗原, 制備多價重組抗原疫苗?？梢酝ㄟ^優(yōu)化免疫時間、免疫次數(shù)和免疫接種量[130], 以及優(yōu)化抗原片段(尋找高特異性和高敏感性的抗原)等方法提高免疫保護。目前所使用的宿主菌多數(shù)為工程菌株, 雖然遺傳操作容易,但水生動物消化道環(huán)境未必適合其定植, 會影響免疫保護效果, 因此發(fā)掘更多水產(chǎn)動物來源的益生芽孢桿菌[87], 構(gòu)建重組芽孢, 表面展示重要病原的抗原片段, 不但能提供免疫保護, 還可以發(fā)揮益生菌的作用。有效的口服疫苗除了在遞送部位提供黏膜局部免疫, 還應該誘導全身系統(tǒng)免疫。深入研究表面展示口服疫苗進入水產(chǎn)養(yǎng)殖動物消化道后發(fā)揮作用的機制, 開發(fā)高效安全的口服疫苗對預防魚病的發(fā)生, 減少化學藥物的使用, 促進我國水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的綠色健康發(fā)展非常必要。