王玉柱 蔣巍巍, 劉文舒 路晶晶 唐艷強(qiáng) 肖海紅 郭小澤 李思明

(1. 江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所, 南昌 330200; 2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院, 成都 611130)

中華鱉(Trionyx sinensis), 隸屬于龜鱉目(Tesudines), 鱉科(Trionychidae), 鱉屬(Trionyx)。作為一種重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種, 中華鱉在我國湖南、湖北、江西、江蘇等多省份均有分布, 全國商品鱉年產(chǎn)量達(dá)37萬噸以上[1]。近年來, 隨著中華鱉養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和集約化養(yǎng)殖模式的推廣, 養(yǎng)殖密度過高、生產(chǎn)管理和病害防治技術(shù)落后等問題引發(fā)中華鱉細(xì)菌性疾病頻頻暴發(fā)[2], 給養(yǎng)殖戶帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前, 中華鱉常見的細(xì)菌性疾病有嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)、遲緩愛德華菌(Edwardsiella tarda)等致病菌引起的敗血癥、腐皮病、疥瘡病、白底板病等病癥[3—6], 然而, 在中華鱉病害的研究過程中, 仍不斷有致病菌的新型癥狀和新型致病菌被發(fā)現(xiàn)[7,8]。

按蚊伊麗莎白菌(Elizabethkingia anophelis), 隸屬于黃桿菌科(Flavobacteriaceae), 伊麗莎白菌屬(Elizabethkingia); 2011年, Peter K?mpfer等[10]首 次從岡比亞瘧蚊腸道中分離鑒定并命名[9]。按蚊伊麗莎白菌被認(rèn)為是條件致病菌, 自該菌被發(fā)現(xiàn)以來,在中國、柬埔寨、丹麥、美國等全世界多個(gè)國家和地區(qū)報(bào)道了其感染人類的案例[11—15], 能夠引起人類敗血癥、腦膜炎等疾病。值得注意的是, 按蚊伊麗莎白菌對(duì)多種抗生素具有較強(qiáng)耐藥性[16], 并且根據(jù)基因組學(xué)分析, 其具有潛在的大規(guī)模暴發(fā)能力和全球快速傳播能力[17]。

2021年10月, 江西省撫州市南豐縣某中華鱉養(yǎng)殖基地暴發(fā)鱉大規(guī)模傳染性病害, 癥狀表現(xiàn)為行動(dòng)遲緩, 頸部腫大, 有腹水, 并伴有腸道出血, 嚴(yán)重者可致死。為探究該中華鱉傳染病的病原, 我們以瀕死中華鱉作為樣本, 從中華鱉肝臟、脾臟中分離出一株優(yōu)勢(shì)菌群, 經(jīng)人工回歸感染試驗(yàn)證實(shí)其具有致病能力。對(duì)該致病菌進(jìn)行形態(tài)觀察、生理生化鑒定和16S RNA基因序列測定, 認(rèn)定該分離株為按蚊伊麗莎白菌。進(jìn)一步, 我們對(duì)該致病菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)和全基因組測定, 并對(duì)其毒力因子進(jìn)行了分析,以期為中華鱉養(yǎng)殖過程中預(yù)防和治療相關(guān)病害提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

患病中華鱉和人工回歸感染試驗(yàn)用鱉從江西省撫州市南豐縣某中華鱉養(yǎng)殖基地獲得。

1.2 致病菌分離純化

用75%濃度酒精對(duì)瀕死病鱉進(jìn)行體表消毒, 在無菌環(huán)境下解剖, 取部分肝臟、脾臟組織磨成勻漿,用滅菌棉簽蘸取組織勻漿, 劃線接種在LB固體培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)上。將培養(yǎng)基封口膜密封后, 轉(zhuǎn)移至28.5℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。在培養(yǎng)結(jié)束后, 用滅菌接種環(huán)挑取培養(yǎng)基中優(yōu)勢(shì)菌落的單菌落, 接種至新的LB培養(yǎng)基上, 再次在28.5℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h, 連續(xù)純化3次后, 得到目標(biāo)菌株EJX2021。現(xiàn)保存于江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所和中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢),保藏編號(hào)為CCTCC NO: M 2022507。

1.3 分離株的鑒定

形態(tài)學(xué)觀察將凍存EJX2021菌株室溫復(fù)蘇, 在無菌環(huán)境下進(jìn)行LB培養(yǎng)基劃線培養(yǎng), 封口膜密封后轉(zhuǎn)移至28.5℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。選定獨(dú)立菌落進(jìn)行觀察, 記錄菌落的形狀、大小、顏色、表面特征, 透明度等表型特征。用滅菌接種環(huán)將單菌落挑至滅菌LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。將部分菌液送至武漢塞維爾生物科技有限公司進(jìn)行革蘭氏染色觀察和掃描電鏡觀察。

16S RNA基因序列測定將上文部分菌液3000 r/min離心5min, 后棄上清, 只保留細(xì)菌沉淀。用無菌PBS吹打重懸, 再次離心。重復(fù)2遍后, 收集細(xì)菌沉淀, 移送至北京擎科(湖南)生物科技有限公司進(jìn)行16S RNA基因序列測定。將測定序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中進(jìn)行Nucleotide BLAST對(duì)比檢索, 并利用MEGA 7軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

生理生化特性測定生理生化特征指標(biāo)選定參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》。生理生化鑒定管采購自青島海博生物技術(shù)有限公司, 具體操作方法按照說明書進(jìn)行。

1.4 人工回歸感染實(shí)驗(yàn)

人工回歸感染試驗(yàn)選取50只幼鱉(50±5) g, 隨機(jī)分為5組, 每組10只, 置于暫養(yǎng)箱(72 cm×53 cm×42 cm)內(nèi)。將EJX2021菌株活化后利用“麥?zhǔn)媳葷岱ā睂⒕合♂尀?×107、1×108、5×108和2.5×109CFU/mL待用, 分別給5組鱉注射200 μL的各濃度稀釋菌液和無菌生理鹽水, 連續(xù)觀察15d。每天觀察并記錄中華鱉的死亡情況, 并對(duì)瀕死病鱉進(jìn)行組織切片觀察和半數(shù)致死劑量(LD50)計(jì)算。

1.5 組織病理學(xué)觀察

在1.2和1.4步驟基礎(chǔ)上, 對(duì)健康鱉和人工回歸感染試驗(yàn)瀕死病鱉進(jìn)行解剖, 取肝、脾、肺、腸組織后分別放入4%多聚甲醛溶液固定, 移送武漢塞維爾生物科技有限公司進(jìn)行組織HE染色觀察。

1.6 毒力因子分析

將上文收集的部分細(xì)菌沉淀移送至深圳微科盟科技集團(tuán)有限公司進(jìn)行全基因組測序。應(yīng)用CAMS&PUMC病原生物學(xué)研究所毒力因子數(shù)據(jù)庫(Virulence factors of pathogenic bacteria, VFDB)(http://mgc.ac.cn/cgi-bin/VFs/v5/main.cgifunc=VFanalyzer)的VFanalyzer在線工具對(duì)毒力因子進(jìn)行篩選。

1.7 抗生素藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

選取23種常規(guī)抗生素用常規(guī)紙片擴(kuò)散法(Kirby-Bauer)進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。在無菌條件下, 將分離株菌液調(diào)制成1個(gè)麥?zhǔn)蠁挝粷舛? 用涂布器將200 μL菌液均勻涂布在LB培養(yǎng)皿(90 mm)上, 每個(gè)培養(yǎng)皿貼放3片藥敏紙片(采購自杭州微生物試劑有限公司)。用封口膜將培養(yǎng)皿封口后倒置在恒溫培養(yǎng)箱中28.5℃培養(yǎng)24h, 培養(yǎng)結(jié)束后測量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)觀察分離株在LB營養(yǎng)瓊脂平板上28.5℃培養(yǎng)24h后, 菌落形態(tài)如圖1A所示。分離株形態(tài)呈現(xiàn)白色或微黃色橢圓形, 表面濕潤、光滑,中間隆起, 邊緣整齊, 呈半透明狀, 直徑1—2 mm(圖1A)。經(jīng)過革蘭氏染色后, 分離株呈現(xiàn)紅色長桿狀, 判定革蘭氏陰性菌(圖1B)。通過掃描電鏡觀察, 菌體直徑約0.65 μm, 成熟個(gè)體長度約1.45—1.65 μm, 兩端鈍圓, 菌毛密集, 無鞭毛( 圖1C)。

圖1 分離株菌落形態(tài)、革蘭氏染色及掃描電鏡結(jié)果Fig. 1 Colony morphology, Gram staining and SEM results of the isolates

16S RNA基因序列測定測序結(jié)果表明,EJX2021菌株16sRNA基因片段大小為1282 bp (Gen-Bank: OL989210.1)?；蛐蛄性贜CBI數(shù)據(jù)庫中的Nucleotide BLAST對(duì)比檢索結(jié)果顯示, 其與按蚊伊麗莎白菌的16S RNA基因序列(GenBank: AP022313.1、CP046080.1和CP071545.1)相似度為99.92%。選取部分與EJX2021菌株BLAST對(duì)比檢索結(jié)果相似的菌株和常見水產(chǎn)致病菌株基因序列, 利用MEGA7軟件對(duì)EJX2021菌株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。結(jié)果顯示, EJX2021菌株與按蚊伊麗莎白菌同屬一個(gè)分支。

圖2 EJX2021菌株基于16S RNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of EJX2021 strain based on 16S RNA gene sequence

生理生化特性測定EJX2021菌株的生理生化特征如表1所示。按蚊伊麗莎白菌的生理生化指標(biāo)在《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》等鑒定手冊(cè)中無記錄, 因此EJX2021菌株生理生化特征指標(biāo)的選擇參考黃桿菌屬細(xì)菌鑒定指標(biāo)進(jìn)行測定。結(jié)果顯示:糖(醇、苷)發(fā)酵試驗(yàn)中, EJX2021菌株對(duì)X-甲基-D-葡萄糖苷、衛(wèi)矛醇半固體呈陽性反應(yīng); 對(duì)D-阿拉伯糖醇、D-甘露糖、D-山梨醇、L-鼠李糖、阿東醇、阿拉伯糖、半乳糖、甘露醇、海藻糖、肌醇、麥芽糖、蜜二糖、木糖、乳糖、葡萄糖、水楊苷、松三糖、纖維二糖、蔗糖、淀粉等均呈陰性反應(yīng)。在明膠和甘油生化試驗(yàn)中, EJX2021菌株可使明膠生化管呈陽性, 甘油生化試驗(yàn)呈陰性。此外, VP (伏普試驗(yàn))、ONPG (β-半乳糖苷酶試驗(yàn))、硫化氫試驗(yàn)、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、氧化酶、苯丙氨酸脫氨酶、丙二酸鹽、唾液酸鹽等測定均呈陰性, 硝酸鹽、尿素酶測定呈陽性。

表1 EJX2021菌株的生理生化鑒定Tab. 1 Physiological and biochemical identification of EJX2021 strain

2.2 人工回歸感染實(shí)驗(yàn)

如圖3所示, 中華鱉腹腔注射不同濃度EJX 2021菌株后, 2×107、1×108、5×108和2.5×109CFU/mL注射菌液濃度的15d死亡率分別為10%、40%、70%和100%。2.5×109CFU/mL組在第11天時(shí), 鱉全部死亡。利用改良寇氏法[18]計(jì)算EJX2021菌株LD50(表2), LD50=lg-1(Xk-i(∑p-0.5))=1.62×108CFU/mL。95%置信區(qū)間為lg-1{[Xk-i(∑p-0.5)]±1.96×108CFU/mL。即EJX2021菌 株 在15d內(nèi) 的LD50為1.62×108CFU/mL, 95%置信區(qū)間為(0.78—3.37)×108CFU/mL。

表2 EJX2021菌株回歸感染試驗(yàn)結(jié)果Tab. 2 Results of EJX2021 strain regression infection test

圖3 不同濃度EJX2021菌株感染中華鱉死亡曲線Fig. 3 Death curves of Trionyx sinensis infected with EJX2021 strain at different concentrations

2.3 組織病理學(xué)觀察

如圖4所示，經(jīng)EJX2021菌株回歸感染后, 鱉腸道、肺臟、脾臟、肝臟等組織出現(xiàn)不同程度病變。回歸感染后腸管組織發(fā)生腫脹, 腸壁明顯變厚;腸絨毛變化表現(xiàn)在杯狀細(xì)胞增多, 腸上皮柱狀細(xì)胞排列松散, 細(xì)胞紋狀緣不明顯或缺失?；貧w感染的肺組織可見肺泡壁明顯纖維化, 肺泡壁上皮細(xì)胞的細(xì)胞核溶解或消失, 肺泡腔內(nèi)有炎癥滲出物?；貧w感染的脾臟組織可觀察到巨噬細(xì)胞數(shù)量增多, 細(xì)胞質(zhì)空泡變性, 細(xì)胞核核仁減少; 淋巴細(xì)胞體積增大,胞核淡染?；貧w感染肝臟組織的肝小葉中央靜脈可見瘀血, 個(gè)別肝細(xì)胞發(fā)生壞死。

圖4 EJX2021菌株感染中華鱉組織病理學(xué)變化(HE染色)Fig. 4 Histopathological changes of Trionyx sinensis infected with EJX2021 strain (HE staining)

2.4 毒力因子分析

如表3所示，預(yù)測毒力基因共246個(gè), 相關(guān)毒力因子分類包括黏附(Adherence)、分泌系統(tǒng)(Effector delivery system)、外毒素(Exotoxin)、胞外酶(Exoenzyme)、莢膜(Capsule)、運(yùn)動(dòng)性(Motility)、營養(yǎng)和代謝(Nutritional/Metabolic factor)、抗逆性(Stress survival)、競爭優(yōu)勢(shì)(Antimicrobial activity/Competitive advantage)、信號(hào)調(diào)控(Regulation)、炎癥通路(Immune modulation; Inflammatory signaling pathway)、生物膜生成(Biofilm formation)、免疫調(diào)節(jié)(Immune modulation)、入侵(Invasion)、補(bǔ)體逃逸(Complement evasion/Serum resistance)和其他等16大類。

表3 EJX2021菌株毒力基因預(yù)測Tab. 3 Virulence gene prediction of EJX2021strain

2.5 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

如表4所示，在23種抗生素藥物中, EJX2021菌株對(duì)6種敏感(多西環(huán)素、米諾環(huán)素、卡那霉素、哌拉西林、恩諾沙星和氟苯尼考), 2種中度敏感(頭孢曲松和頭孢哌酮), 其余15種耐藥。

表4 23種抗生素對(duì)EJX2021菌株的敏感性試驗(yàn)結(jié)果Tab. 4 Sensitivity test results of 23 antibiotics to EJX2021strain

3 討論

3.1 致病菌的分離與鑒定

伊麗莎白菌屬細(xì)菌形態(tài)學(xué)特征明顯, 通常呈兩端鈍圓的桿狀, 大小約0.5 μm×(1.0—2.5) μm, 革蘭氏染色呈陰性; 菌落形態(tài)特征呈圓形隆起、半透明或透明。邊緣清晰, 表面光滑[19]。在本試驗(yàn)中, EJX 2021菌株與伊麗莎白菌屬細(xì)菌形態(tài)學(xué)特征一致。伊麗莎白菌屬設(shè)立較晚, 現(xiàn)包含了6個(gè)菌種。分別是Kim等[19]在2005年從黃桿菌屬(Chryseobacterium)中重新分類的米爾伊麗莎白菌(Elizabethkingia miricola)和腦膜膿毒性伊麗莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica), K?mpfer等[20]在2011年發(fā)現(xiàn)的按蚊伊麗莎白菌[9]和2015年發(fā)現(xiàn)的Elizabethkingia endophytica(后 經(jīng) 證 實(shí),Elizabethkingia endophytica歸類于按蚊伊麗莎白菌[21]), Nicholson等[22]在2018年 發(fā) 現(xiàn) 的Elizabethella bruuniana、Elizabethella ursingii和Elizabethella occulta?！冻Ｒ娂?xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[23]《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[24]等快速鑒定手冊(cè)成書早于伊麗莎白菌屬的設(shè)立, 因此, 參照細(xì)菌生理生化特征作為按蚊伊麗莎白菌的鑒定手段有較大局限性。本試驗(yàn)參考黃桿菌屬等細(xì)菌生理生化特征鑒定指標(biāo), 對(duì)EJX2021菌株進(jìn)行部分生理生化指標(biāo)鑒定, 結(jié)果顯示其對(duì)多數(shù)糖、苷、醇類物質(zhì)不能利用, 對(duì)X-甲基-D-葡萄糖苷、衛(wèi)矛醇等可利用; 可利用明膠, 不可利用甘油; 此外, EJX2021菌株還可分解硝酸鹽、產(chǎn)生尿素酶。細(xì)菌的16S RNA基因片段的保守性很高, 且在不同種間存在相對(duì)變異區(qū), 在微生物鑒定時(shí)具有快速、高效和準(zhǔn)確的特點(diǎn)[25]。所以, 測定16S RNA基因序列和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的方法成為微生物鑒定的常用手段。在本試驗(yàn)結(jié)果中, EJX2021菌株和6株按蚊伊麗莎白菌位于系統(tǒng)進(jìn)化樹的同一分支(Bootstrap值為94), 證明EJX2021菌株和按蚊伊麗莎白菌屬于同一物種。因此, 通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定, 確認(rèn)EJX2021菌株為按蚊伊麗莎白菌。

按蚊伊麗莎白菌廣泛分布在自然環(huán)境中[26], 自從2011年發(fā)現(xiàn)以來, 其持續(xù)被報(bào)道引起肺炎、菌血癥、新生兒腦膜炎等人類臨床醫(yī)學(xué)病癥[27,28], 被認(rèn)為是醫(yī)院等環(huán)境中的重要條件致病菌[29]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中, 伊麗莎白菌屬的米爾伊麗莎白菌和腦膜膿毒性伊麗莎白菌導(dǎo)致蛙類等水產(chǎn)動(dòng)物病害的報(bào)道屢見不鮮[30,31], 但是按蚊伊麗莎白菌感染水產(chǎn)動(dòng)物的現(xiàn)象沒有報(bào)道。本研究首次發(fā)現(xiàn)了按蚊伊麗莎白菌感染中華鱉。在早期按蚊伊麗莎白菌屬的研究中, 對(duì)其生理生化鑒定手段缺乏, 基因序列對(duì)比已有伊麗莎白菌屬基因序列和相關(guān)報(bào)道, 往往引起伊麗莎白菌屬物種菌種鑒定的不準(zhǔn)確判斷[32], 這可能是按蚊伊麗莎白菌在水產(chǎn)動(dòng)物上報(bào)道較少的原因之一。

3.2 EJX2021菌株感染中華鱉組織病理學(xué)觀察

組織病理學(xué)觀察能夠直接、準(zhǔn)確地反映器官、組織和細(xì)胞的病理學(xué)變化, 是研究自然發(fā)生和實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)疾病形態(tài)特征和病變程度的最可靠、敏感和全面的測定方法之一[33]。關(guān)于按蚊伊麗莎白菌引起的動(dòng)物機(jī)體病理學(xué)觀察報(bào)道較少, 本試驗(yàn)觀察顯示, 按蚊伊麗莎白菌可造成中華鱉腸道、肺臟、脾臟和肝臟等組織器官不同程度的病理損傷。水產(chǎn)動(dòng)物的細(xì)菌性感染往往呈現(xiàn)綜合性病癥,會(huì)引起肝、腸等部位細(xì)胞變性、組織崩潰、形成炎癥[34]。腸道、肺臟、肝臟、脾臟等是機(jī)體重要的免疫和代謝器官, 持續(xù)感染造成的組織器官漸進(jìn)性損傷, 可能會(huì)引起中華鱉的呼吸障礙、營養(yǎng)吸收障礙、體液循環(huán)障礙等功能性障礙, 嚴(yán)重可致死[35]。按蚊伊麗莎白菌引起的組織器官病變可能是導(dǎo)致人工回歸感染中華鱉死亡的原因之一, 有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.3 EJX2021菌株的致病性

中華鱉致病菌種類繁多, 致病力各不相同。前人實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證, 蘇云金芽孢桿菌(Trionyx sinensis)在10—15 g中華鱉上的LD50為1×104.87—105.30CFU/mL[36], 蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)在200 g中華鱉上為4.91×106CFU/mL[37], 遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)在150 g中 華 鱉 上 為2.45×106CFU/mL[38], 摩氏摩根菌(Morganella morganii)在4—6 g中華鱉上為1×107.24CFU/mL[39], 奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)在150 g中華鱉上為1×107.83CFU/mL[40],嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)在500 g中華鱉上為1.5×108CFU/mL[41], 弗氏檸檬酸桿菌(Pelodiscus sinensis)在30 g中華鱉上為9.3×104CFU/g[6]。在本試驗(yàn)中, 按蚊伊麗莎白菌在50 g中華鱉上的LD50為1.62×108CFU/mL。與上述常見致病菌相比,本研究中按蚊伊麗莎白菌對(duì)中華鱉的致死能力較弱。但是, 按蚊伊麗莎白菌不同亞種在不同地域環(huán)境中的毒性還缺乏研究支撐, 其對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的潛在危險(xiǎn)性仍不容忽視。

自從2011年被發(fā)現(xiàn)以來, 按蚊伊麗莎白菌在全球至少有4次以上的中到大規(guī)模暴發(fā), 然而, 人們對(duì)按蚊伊麗莎白菌的認(rèn)識(shí)仍不夠全面[42]。利用全基因組學(xué)對(duì)按蚊伊麗莎白菌毒力因子進(jìn)行預(yù)測有助于我們深入了解和解釋其致病機(jī)制和臨床表現(xiàn)。Perrin等[43]對(duì)美國威斯康星州在2015—2016年暴發(fā)的細(xì)菌感染中分離的按蚊伊麗莎白菌樣本進(jìn)行毒力因子預(yù)測, 結(jié)果顯示人源按蚊伊麗莎白菌株含有67個(gè)毒力基因, Teo等[44]在新加坡暴發(fā)疫情的按蚊伊麗莎白菌中預(yù)測得到關(guān)于脂多糖合成、鐵載體合成、血紅素?cái)z取等分類毒力基因共216個(gè)。本試驗(yàn)對(duì)比VFDB數(shù)據(jù)庫, 預(yù)測得到按蚊伊麗莎白菌的毒力基因246個(gè), 共16類。前人研究結(jié)果顯示按蚊伊麗莎白菌的毒力因子涉及莢膜構(gòu)成、脂多糖和脂質(zhì)生物合成代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、分泌系統(tǒng)、應(yīng)激反應(yīng)等多個(gè)方面[45]。細(xì)菌莢膜是位于細(xì)胞壁外的一層物質(zhì), 對(duì)細(xì)菌在動(dòng)物機(jī)體中的依附、入侵和免疫逃避等有重要影響, 是引發(fā)腦膜炎等病癥的主要細(xì)菌毒力因素[46]。Perrin等[43]在威斯康星州樣本中發(fā)現(xiàn)了5類莢膜蛋白合成有關(guān)的基因, 本研究中發(fā)現(xiàn)了25個(gè)莢膜相關(guān)毒力基因。另外, 本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)按蚊伊麗莎白菌中檢測到的部分毒力因子是許多致病菌的共同特征。例如,katG和zmp1因子能夠參與應(yīng)激反應(yīng)和結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的發(fā)病過程[47,48],IlpA誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子在創(chuàng)傷弧菌引起的敗血病中起重要作用[49],clpP、tuf、rmla和dnak等毒力基因在一種擬香味類香味菌(Myroides odoratimimus)中可能參與了機(jī)體的入侵和防御等步驟[50]。同時(shí), 我們還在按蚊伊麗莎白菌的毒力基因中發(fā)現(xiàn)了巨噬細(xì)胞感染和存活所需要的Mip蛋白[51]編碼基因。本研究對(duì)中華鱉源按蚊伊麗莎白菌毒力因子的預(yù)測顯示, 該菌株具有比人類臨床按蚊伊麗莎白菌更多且與人類致病菌高度重合的毒力因子群體, 表明中華鱉源按蚊伊麗莎白菌可能具有人類致病潛力。

3.4 EJX2021菌株的藥敏特性

水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中抗生素的不合理使用往往導(dǎo)致水體致病菌出現(xiàn)廣泛耐藥性[52]。為檢驗(yàn)EJX2021菌株的耐藥特征, 本試驗(yàn)采用23種常見抗生素進(jìn)行藥敏試驗(yàn), 結(jié)果顯示EJX2021菌株對(duì)四環(huán)素類的多西環(huán)素、米諾環(huán)素抗生素敏感, 對(duì)氨基糖苷類的卡那霉素敏感, 對(duì)β-內(nèi)酰胺類的哌拉西林敏感, 對(duì)喹諾酮類的恩諾沙星和氟苯尼考敏感; 對(duì)頭孢菌素類的頭孢曲松和頭孢哌酮中度敏感; 對(duì)其他15種抗生素不敏感。本試驗(yàn)結(jié)果與Pavel等[53]、王小龍等[54]的研究有較大差異, Pavel等[53]在俄羅斯產(chǎn)牛奶中分離出的按蚊伊麗莎白菌對(duì)哌拉西林、卡那霉素均不敏感; 王小龍等[54]在蘇州地區(qū)肺部感染者體內(nèi)分離得到的按蚊伊麗莎白菌對(duì)頭孢曲松、頭孢哌酮、哌拉西林敏感, 對(duì)米諾環(huán)素中度敏感, 對(duì)卡那霉素、多西環(huán)素不敏感。上述結(jié)果說明EJX2021菌株為多重耐藥菌株, 且在不同環(huán)境中篩選出了耐藥性差異; 并且, 隨著按蚊伊麗莎白菌新品系不斷產(chǎn)生[55], 其耐藥性可能隨之增強(qiáng)。因此, 根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果判定按蚊伊麗莎白菌的治療方法顯得尤為重要。