劉小雨 龐樹朝 江楊楊 王麗欣

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心,天津 300193)

心血管疾病發(fā)病率逐年上升,2019年在農(nóng)村和城市中心血管疾病分別占中國居民死因的46.74%和44.26%,中國正面臨人口老齡化和代謝危險因素的雙重壓力,心血管疾病負(fù)擔(dān)仍將持續(xù)增加[1]。冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是心血管疾病患病率和死亡率最高的疾病之一,動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的發(fā)生和發(fā)展涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖、巨噬細(xì)胞脂質(zhì)過載形成泡沫細(xì)胞等多種機制。線粒體是一種高度動態(tài)的細(xì)胞器,其不斷地進行分裂與融合的動態(tài)平衡過程被稱為“線粒體動力學(xué)”。在各種因素影響下,線粒體動力學(xué)極易失衡,尤其是分裂異常所導(dǎo)致的線粒體功能障礙與AS的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。調(diào)控線粒體分裂的蛋白包括動力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)、線粒體分裂蛋白1以及線粒體分裂因子等,其中起關(guān)鍵作用的是Drp1。有研究[2]表明敲除Drp1可抑制凋亡蛋白胱天蛋白酶3活化,減輕血管內(nèi)皮功能損傷;相反,Drp1的過表達則可升高內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species ,ROS)水平,加速AS進展。由此可見Drp1在AS過程中扮演著重要角色,而Drp1如何參與AS的病理發(fā)展卻鮮有關(guān)注,現(xiàn)就Drp1介導(dǎo)AS進展具體機制及靶向Drp1治療AS現(xiàn)狀進行綜述。

1 線粒體結(jié)構(gòu)

線粒體是一種存在于大多數(shù)真核細(xì)胞中的半自主細(xì)胞器,具有雙層膜結(jié)構(gòu),即高滲性的線粒體外膜和低滲性的線粒體內(nèi)膜。前者是線粒體最外層單位膜,厚度為6～7 nm,包含分選和組裝機器復(fù)合體、線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶復(fù)合體及孔蛋白3個整合蛋白家族,主要負(fù)責(zé)線粒體的信號傳遞;后者是線粒體外膜內(nèi)側(cè)的單位膜,其向內(nèi)折疊形成嵴,從而增加內(nèi)膜面積,使更多的反應(yīng)能在內(nèi)膜上進行[3]。線粒體嵴通過嵴連接與線粒體內(nèi)膜連接,且嵴上錨定著呼吸鏈電子傳遞鏈復(fù)合物蛋白和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)合酶,其通過氧化磷酸化作用產(chǎn)生ATP,為細(xì)胞的正常代謝活動提供能量[4]。線粒體外膜與粒體內(nèi)膜又將細(xì)胞器分為線粒體基質(zhì)和膜間空間,線粒體基質(zhì)包含許多生物分子,如參與三羧酸循環(huán)、脂肪酸氧化和氨基酸降解等生化反應(yīng)的酶、線粒體DNA、線粒體RNA和線粒體核糖體等[4-5]。

2 線粒體動力學(xué)

線粒體不僅是真核生物的“能量工廠”,還是機體代謝樞紐和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)平臺,在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)、磷脂合成、ROS生成和維持、鐵硫簇合物的生物合成和固有免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過程中扮演重要角色[6-7]。線粒體功能受線粒體動力學(xué)的操控,主要包括線粒體融合和線粒體分裂。前者不僅可對線粒體受損部分進行動態(tài)修復(fù),而且使細(xì)胞器共享蛋白質(zhì)、線粒體DNA等代謝物。相反,當(dāng)線粒體受到不可逆損傷并對細(xì)胞產(chǎn)生潛在有害性時,則發(fā)生線粒體分裂,即將受損的線粒體分割成小的球形細(xì)胞器,進而在線粒體自噬下進行分離和消化以維持健康的線粒體網(wǎng)絡(luò)[8]。

3 Drp1的結(jié)構(gòu)與活性調(diào)控

線粒體分裂是細(xì)胞產(chǎn)生線粒體的重要方式,也是清除受損線粒體、維持線粒體正常功能的重要手段,該過程主要由Drp1介導(dǎo)。Drp1是一種廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)中的鳥苷三磷酸(guanosine triphosphate,GTP)酶蛋白,其以多種可變剪接變體的形式表達于哺乳動物的心臟、骨骼肌、腦、腎和睪丸中[9]。Drp1由4個結(jié)構(gòu)域組成:C端GTP酶效應(yīng)結(jié)構(gòu)域、可變結(jié)構(gòu)域、螺旋中間結(jié)構(gòu)域和N端GTP酶結(jié)構(gòu)域[10]。由于Drp1缺乏與脂質(zhì)相互作用的普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域,其只能通過線粒體分裂蛋白1、線粒體分裂因子、線粒體動力蛋白49/51等相關(guān)銜接蛋白才能從細(xì)胞膜被運送至線粒體外膜進行寡聚化,形成一個內(nèi)徑約為20 nm的螺旋環(huán),并轉(zhuǎn)運至分裂位點,以GTP依賴性方式收縮細(xì)胞器,最終母體細(xì)胞器分成兩個子體,完成線粒體分裂全過程[11]。此外,Bcl-2腺病毒/E1B 19kD相互作用蛋白3、髓樣細(xì)胞白血病-1以及含F(xiàn)UN14結(jié)構(gòu)域蛋白1也被證明可招募Drp1到線粒體外膜,啟動線粒體分裂[12]。

Drp1介導(dǎo)的線粒體分裂受多種翻譯后修飾(post-translational modification,PTM)的嚴(yán)格調(diào)控,例如磷酸化、SUMO化、泛素化、棕櫚?；蛠喯貂；?。這些PTM主要位于Drp1可變結(jié)構(gòu)域,在Drp1的激活、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)之間的相互作用、GTP酶活性以及細(xì)胞質(zhì)和線粒體外膜之間的轉(zhuǎn)運中發(fā)揮重要作用[13]。磷酸化是Drp1最典型的PTM之一,目前已鑒定了許多磷酸化位點:Ser579、Ser40、Ser585、Ser44、Ser592、Ser656、Ser616、Ser637和Ser693等。其中Ser616的磷酸化是促進Drp1定位到線粒體外膜的關(guān)鍵,該過程由Rho相關(guān)蛋白激酶、蛋白激酶Cδ、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2、鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ催化[11]。值得一提的是,雙特異性磷酸酶6可獨立于細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2對Ser616進行去磷酸化,不過此作用在氧化條件下會被去SUMO化修飾破壞[14]。Drp1的SUMO化包括兩種途徑:一種是線粒體錨定蛋白連接酶依賴的SUMO1修飾;另一種是Sentrin/SUMO特異性蛋白酶依賴的去SUMO2/3修飾,去SUMO2/3修飾不僅可促進線粒體分裂、鈣攝取、細(xì)胞色素C的釋放,還可激活線粒體自噬。相反,Drp1進行SUMO2/3修飾和去SUMO1修飾則可抑制ATP生成,提高受損線粒體比例[13,15]。

4 Drp1是AS的重要驅(qū)動因素

Drp1與一氧化氮(nitric oxide,NO)、ROS、鈣離子水平和細(xì)胞凋亡等因素密切相關(guān),而這些因素穩(wěn)態(tài)失衡可引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷、VSMC的增殖和遷移、巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子以及介導(dǎo)的膽固醇逆轉(zhuǎn)運障礙等AS的相關(guān)病理特征出現(xiàn)(見圖1)。

圖1 Drp1參與AS的機制

4.1 Drp1與內(nèi)皮細(xì)胞

內(nèi)皮細(xì)胞可通過膜受體感知血流動力學(xué)變化并分泌血管活性因子,維持血管穩(wěn)態(tài)。NO是內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮依賴性舒張功能的關(guān)鍵刺激因子,過表達的ROS不僅可干擾內(nèi)皮細(xì)胞的NO信號轉(zhuǎn)導(dǎo),增加血管壁張力,而且可使內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞間連接丟失,內(nèi)皮通透性增強,促使AS的形成[16-17]。由此可見,ROS過量及NO不足是導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的首要原因,而抑制Drp1的表達可拮抗這一過程。抑制Drp1的表達會降低煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4水平,并提高主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中NO水平,防止內(nèi)皮損傷[18];反之,Drp1的過表達可促進線粒體ROS產(chǎn)生,過量的ROS又可通過激活c-Jun氨基端蛋白激酶信號通路增強Drp1磷酸化,使內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)線粒體分裂過度,從而形成惡性循環(huán),導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞死亡[19]。此外,內(nèi)皮細(xì)胞衰老及其誘發(fā)的炎癥反應(yīng)也是AS的誘導(dǎo)因素之一,Drp1亦參與了此環(huán)節(jié)。Forrester等[20]在腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),抑制Drp1的活性或表達可抑制核因子κB激活、血管細(xì)胞黏附分子-1表達以及這些促炎因子誘導(dǎo)的白細(xì)胞黏附。

4.2 Drp1與VSMC

平滑肌細(xì)胞位于血管中膜,是構(gòu)成血管壁組織結(jié)構(gòu)和維持血管張力的主要細(xì)胞類型。VSMC在各種調(diào)節(jié)因子的刺激下發(fā)生表型轉(zhuǎn)換、異常增殖,進而形成纖維帽,導(dǎo)致內(nèi)膜增生,促進AS的形成。VSMC的增殖和遷移依賴于肌動蛋白細(xì)胞骨架和肌球蛋白運動功能的重組,此過程的大部分能量均由線粒體提供,且多項研究表明Drp1作為線粒體動力學(xué)中至關(guān)重要的一員,與VSMC的增殖和遷移、表型轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。一方面,過表達的Drp1導(dǎo)致其Ser616磷酸化增加,與線粒體外膜結(jié)合加快,進而影響VSMC的能量代謝和表型轉(zhuǎn)變、促進VSMC的增殖和遷移;離體的主動脈環(huán)測定也證明了抑制Drp1對VSMC具有顯著的抗增殖作用和抗遷移效應(yīng)[8,21]。另一方面,Drp1的表達下調(diào)可抑制VSMC向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化,緩解血管鈣化[22]。值得一提的是,Drp1還是啟動線粒體自噬的關(guān)鍵蛋白,盡管線粒體自噬通常在VSMC穩(wěn)態(tài)中起積極作用,但有研究[23]表明上調(diào)Drp1的表達和下調(diào)線粒體融合蛋白1、線粒體融合蛋白2、視神經(jīng)萎縮蛋白1的表達可協(xié)助線粒體自噬,加速VSMC的增殖。

4.3 Drp1與巨噬細(xì)胞

巨噬細(xì)胞是機體固有免疫系統(tǒng)中重要細(xì)胞成分,其通過清道夫受體識別并吞噬脂質(zhì),形成泡沫細(xì)胞,構(gòu)成纖維斑塊,并在各種趨化因子作用下向不同方向極化,調(diào)節(jié)炎癥因子比例,介導(dǎo)AS全程[24]。多項研究證明Drp1的表達水平可影響巨噬細(xì)胞參與的炎癥反應(yīng)、膽固醇逆轉(zhuǎn)運及細(xì)胞凋亡過程。其一,下調(diào)Drp1表達可抑制Toll樣受體2/4、糖原合酶激3β介導(dǎo)的核因子κB途徑及核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3途徑,下調(diào)巨噬細(xì)胞的巨噬細(xì)胞經(jīng)典活化型/替代活化型比率,降低腫瘤壞死因子-α等促炎介質(zhì)水平[25-27]。其二,抑制巨噬細(xì)胞中Drp1介導(dǎo)的線粒體分裂可下調(diào)CD36的表達、上調(diào)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1的表達,促進膽固醇外流[28]。其三,抑制Drp1的表達可減少CD137信號誘導(dǎo)的凋亡巨噬細(xì)胞的數(shù)量,減輕斑塊負(fù)擔(dān)[29]。盡管以上各種證據(jù)均指向Drp1水平與巨噬細(xì)胞的促AS性呈正相關(guān),仍有相反觀點提出,即Drp1可加快巨噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的持續(xù)清除。Wang等[30]發(fā)現(xiàn)將凋亡細(xì)胞添加至巨噬細(xì)胞后,Drp1的表達迅速增加,吞噬溶酶體降解凋亡細(xì)胞尸體及鈣依賴性囊泡運輸速度加快;相反,在Drp1表達缺陷的巨噬細(xì)胞中,線粒體鈣大量流失,胞葬功能受損,病灶處凋亡細(xì)胞堆積。

5 靶向Drp1可作為潛在的治療AS途徑

大量研究表明靶向Drp1日益成為治療AS的新興方向。線粒體分裂抑制劑1(mitochondrial division inhibitor-1,Mdivi-1)是Drp1的小分子活性抑制劑,其通過抑制PTM以及線粒體膜轉(zhuǎn)位抑制Drp1與線粒體膜相互作用。研究[31]表明牙齦卟啉單胞菌具有促AS作用,而Mdivi-1可成功阻斷該厭氧菌導(dǎo)致的Drp1(Ser616)磷酸化、線粒體ROS積累、線粒體膜電位及ATP水平降低。此外,Mdivi-1還具有降脂、抑制血管鈣化之功效。在AS小鼠模型中,Mdivi-1不僅可減緩血管鈣化,還有抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重塑、維持肝臟蛋白穩(wěn)態(tài)的作用,故Rogers等[32]將Mdivi-1定義為新型小分子前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9抑制劑。Fang等[33]發(fā)現(xiàn)Mdivi-1可降低線粒體分裂頻率,顯著拮抗氧化低密度脂蛋白對VSMC線粒體形態(tài)和功能造成的損傷,抑制VSMC泡沫化。然而,Bordt等[34]對Mdivi-1的特異性提出了質(zhì)疑,他們發(fā)現(xiàn)Mdivi-1可通過不依賴于Drp1途徑抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合體1。不過此觀點尚存在爭議,因為Aishwarya等[35]在暴露于Mdivi-1及敲除Drp1的大鼠心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)呼吸鏈復(fù)合體1的水平也同樣下降。因此需更多的大型動物模型研究來驗證Mdivi-1的潛在目標(biāo)效應(yīng)。

除了Mdivi-1,還有一些激素、中藥及其提取物被證明可通過Drp1依賴性途徑減緩AS進程。最新研究[36]發(fā)現(xiàn),補陽還五湯可通過調(diào)節(jié)AMP活化蛋白激酶/Drp1途徑減少線粒體分裂來抑制AS。補骨脂異黃酮是補骨脂的主要活性成分,其可通過調(diào)節(jié)mTOR/Drp1信號級聯(lián)反應(yīng)抑制血小板衍生生長因子誘導(dǎo)的VSMC增殖和遷移,減輕ApoE基因缺陷小鼠的AS病變[37];冬青素A是毛冬青的主要活性成分,其可通過核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2途徑促進蛋白酶體亞基β5型的表達,降低Drp1水平,改善內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[38]。褪黑素及鳶尾素這兩種激素被證明均可通過AMP活化蛋白激酶/Drp1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制VSMC向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化,減弱動脈血管鈣化[22,39]。CDGSH鐵硫結(jié)構(gòu)域1是一種鐵硫線粒體外膜蛋白,其依賴Drp1途徑才能發(fā)揮降低血清低密度脂蛋白膽固醇、甘油三酯水平和降低AS面積的作用[40]。

6 總結(jié)與展望

Drp1的表達在AS進展中起重要作用,相關(guān)機制目前主要集中于其與內(nèi)皮細(xì)胞受損、VSMC增殖和遷移及巨噬細(xì)胞的關(guān)系。其一,表達增加的Drp1通過促進氧化應(yīng)激、抑制NO信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促進內(nèi)皮細(xì)胞損傷,并以多種方式促進內(nèi)皮細(xì)胞衰老。其二,過表達的Drp1既可通過調(diào)控能量代謝、表型轉(zhuǎn)化及線粒體自噬促進VSMC的增殖和遷移,又可促進VSMC向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化、緩解血管鈣化。其三,表達缺陷的Drp1可通過促進巨噬細(xì)胞向替代活化型方向極化、抑制炎癥因子表達以抑制局部炎癥反應(yīng),還可促進膽固醇外流及減少凋亡的巨噬細(xì)胞數(shù)量。然而,有學(xué)者提出表達缺陷的Drp1會削弱巨噬細(xì)胞在胞葬過程中降解內(nèi)化的凋亡細(xì)胞的能力,因此如何把握好且利用巨噬細(xì)胞有效的胞葬作用是通過Drp1減緩AS的未來研究方向。此外,Mdivi-1及部分中藥提取物被證明依賴于Drp1途徑減緩AS進程,不過Mdivi-1的下游靶點尚存在爭議,仍需不斷探索。相信隨著研究的不斷深入,Drp1可作為AS治療靶點,開辟新的領(lǐng)域。