俞兆斌,朱麗霞,2*

1(塔里木大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,新疆 阿拉爾,843300);2(南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 阿拉爾,843300)

4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮(4-hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanone,HDMF),又名菠蘿酮,稀溶液呈草莓味,濃溶液則是焦糖香味[1]。HDMF及其甲氧基衍生物、乙氧基衍生物、β-吡喃葡萄糖苷及其丙二?；苌锞言谒需b定[2]。在加熱、非加熱、發(fā)酵的食品中均可以檢測(cè)出HDMF[3]。HDMF在水中的閾值是0.03 mg/L、空氣中閾值是0.1 mg/L、在pH值為3.2的10%水醇溶液中閾值是5 μg/L[4],較低的閾值及宜人的風(fēng)味特征,被用作調(diào)味劑[5]。環(huán)狀二羰基衍生物的平面烯醇氧基的結(jié)構(gòu)特征,使得HDMF與其類(lèi)似物具有焦糖風(fēng)味[6](圖1)。

1-呋喃酮;2-麥芽酚;3-甲基環(huán)戊烯稀酮;4-五元環(huán)氫鍵環(huán)狀化合物圖1 含有α-二酮體稀醇結(jié)構(gòu)的物質(zhì)[6]

呋喃酮類(lèi)化合物以其官能團(tuán)分為3(2H)-呋喃酮和2-(5H)-呋喃酮兩大類(lèi),其中3(2H)-呋喃酮中包括：5-甲基-4-羥基-3(2H)-呋喃酮[5-methy-4-hydroxy-3(2H)-furanone,HMF]、2,5-二甲基-4-羥基-3(2H)-呋喃酮(HDMF)、2,5-二甲基-4-甲氧基-3(2H)-呋喃酮[2,5-dimethyl-4-methoxy-3(2H)-furanone,DMMF]、5-(或2)-乙基-2-(或5)-甲基-4-羥基-3(2H)-呋喃酮[5-(or 2)ethyl-2-(or 5)-methy-4-hudroxy,3(2H)-furanone,EMHF]、2,5-二甲基-2,4-二羥基-3(2H)-呋喃酮,2-(5H)-呋喃酮包括蘆巴內(nèi)酯、乙氧基呋喃酮、抗壞血酸、紅細(xì)胞抗壞血酸等[7]。HDMF依據(jù)氧存在的形式,表現(xiàn)出氧化或促氧化特性[8],是食品中已知的促氧化劑,通過(guò)銅離子還原為亞銅離子產(chǎn)生超氧自由基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫和羥基自由基,是DNA鏈斷裂和8-羥基-2′-脫氧鳥(niǎo)苷形成的原因[8],具有與抗壞血酸相當(dāng)?shù)目寡趸钚訹7]。HDMF可保護(hù)人類(lèi)紅細(xì)胞膜和低密度脂蛋白免受鐵誘導(dǎo)的氧化修飾,抑制色素沉著,具有抗感染活性[8];抑制人血漿脂質(zhì)氧化,對(duì)眼睛晶狀體組織中超氧化物有抗氧化作用,抑制白內(nèi)障[9];對(duì)革蘭氏菌、真菌具有抗菌活性,誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)海藻糖積累,破壞血清誘導(dǎo)的菌絲形態(tài)[10]。HMF、HDMF、DMMF是良好的抗致癌劑,HDMF可降低由苯并[α]芘誘導(dǎo)的大鼠前胃腫瘤發(fā)生率和數(shù)量[11]。據(jù)最新研究,大鼠吸入HDMF可降低收縮壓、心率及血漿氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平[12]。人體吸入HDMF可以降低憤怒-敵意、緊張-焦慮、疲勞-慣性情緒;降低額葉皮層閃爍頻率和氧合血紅蛋白,具有鎮(zhèn)靜、生理放松作用[13]。

綜上,HDMF為廣泛存在于自然界的天然活性功能物質(zhì),重要的工業(yè)香料。通過(guò)對(duì)其生物與非生物合成途徑的國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道進(jìn)行綜述,為HDMF健康、綠色的工業(yè)生產(chǎn)、食品加工中的風(fēng)味調(diào)控等提供綜合性知識(shí)。

1 化學(xué)法合成HDMF

HDMF化學(xué)合成底物有糖,羧酸和羧酸酯、呋喃、不飽和醇類(lèi)、醛酮的衍生物等(表1),其中常見(jiàn)的有鼠李糖、酒石酸、乳酸乙酯和丙酮醛等。

表1 呋喃酮化學(xué)合成主要原料[6]Table 1 Main raw materials for the chemical synthesis of furanone[6]

表2 合成HDMF的微生物Table 2 Microorganisms that synthesise HDMF

化學(xué)合成在工業(yè)中應(yīng)用還需克服原料成本高、不同合成工藝差異較大等技術(shù)難題。在國(guó)內(nèi),化學(xué)合成HDMF的方法為：乳酸乙酯與α-溴代丙酸乙酯在強(qiáng)堿性溶液中發(fā)生烷氧基化反應(yīng),中間產(chǎn)物在含有金屬鈉的甲苯溶劑發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng),再催化氧化得到HDMF,具有原料廉價(jià)、易得的優(yōu)點(diǎn),但烷基化以及縮合反應(yīng),反應(yīng)條件嚴(yán)苛[14]。在國(guó)外合成HDMF主要是由瑞士芬美意公司(FIRMENICH)提供,丙酮醛在乙酸水溶液中,由鋅粉提供還原電子,經(jīng)過(guò)Pinacol偶聯(lián)反應(yīng)得到3,4-二羥基-2,5-己二酮,再用Na2HPO4調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)得到HDMF,反應(yīng)體系中含有多羰基,很難控制Witting反應(yīng)制備相應(yīng)的烯烴[15]。

2 美拉德反應(yīng)形成呋喃酮

美拉德反應(yīng)可以形成HDMF(圖2)。在含有糖的溶液中,己糖、6-脫氧糖和戊糖通過(guò)2,3-烯醇化、β-消去反應(yīng)、形成3-脫氧酮糖、再進(jìn)行分子內(nèi)環(huán)化和脫水反應(yīng)降解為HDMF[16](藍(lán)色標(biāo)注)。在含有己糖和氨基酸的食品中,HDMF通過(guò)美拉德反應(yīng)形成,葡萄糖經(jīng)過(guò)阿姆德分子重排、2,3-烯醇化形成脫氧酮,裂解為羥基丙酮和乳醛,再通過(guò)羥醛縮合反應(yīng)、環(huán)化形成乙酰福爾馬林,再被還原成HDMF,其中乙酰福爾馬林、雙乙酰福爾馬林和二氫二乙酰福爾馬林為重要中間體[17](紅色標(biāo)注)。3-脫氧酮糖裂解形成甲基乙二醛,再經(jīng)過(guò)Cannrizzaro反應(yīng)形成羥基丙酮,異構(gòu)為端羥基醇,通過(guò)與2-氧代丙醇反應(yīng)生成2,5-二氧代-3,4-二羥基己烷,繼而環(huán)化、β-消除水形成HDMF[17]。在面包中,HDMF前驅(qū)物質(zhì)是酵母細(xì)胞內(nèi)水溶性的1,6-二磷酸-D-果糖(D-fructose-1,6-diphosphate,FDP)在烘培中生成,其推測(cè)是C6的磷酸根離子移除之后,2,3-烯醇化形成乙酰福爾馬林,繼而形成HDMF,磷酸根離子、維生素C可以促進(jìn)其轉(zhuǎn)化[18]。環(huán)境溫度為30 ℃時(shí)合成HDMF的效率最高,緩沖液的pH、化學(xué)性質(zhì)對(duì)酶活性影響較小。在含有FDP和NADPH的溶液中,NADPH向碳水化合物非酶氫化轉(zhuǎn)移,可化學(xué)轉(zhuǎn)化形成HDMF,重要的中間體為乙酰福爾馬林[19](綠色標(biāo)注)。

圖2 美拉德反應(yīng)形成呋喃酮物質(zhì)轉(zhuǎn)化路線(xiàn)圖

3 酶催化形成呋喃酮

在工業(yè)中以FDP為底物,利用三步酶法生產(chǎn)HDMF(圖3)[20]。醛縮酶和磷酸三酯異構(gòu)酶處理含有D- 1,6-二磷酸果糖和D-乳醛的溶液時(shí),形成6-脫氧果糖-1-磷酸(圖5),D-1,6-二磷酸果糖在1,6-二磷果糖-酸醛縮酶(兔肌肉醛縮酶)的作用下裂解為磷酸二羥丙酮和D-磷酸甘油醛,而磷酸丙糖異構(gòu)酶可以促進(jìn)D-磷酸甘油醛與磷酸二羥丙酮相互轉(zhuǎn)化,磷酸二羥丙酮在含有乳醛的堿性溶液中經(jīng)醛縮酶作用發(fā)生羥醛縮合反應(yīng)形成6-脫氧-D-果糖(D-乳醛)或6-脫氧-L-山梨糖(L-乳酸醛)與哌啶在80 ℃條件下加熱20 h形成HDMF[21]。

圖3 酶法合成呋喃酮物質(zhì)轉(zhuǎn)化路線(xiàn)圖[20]

4 植物中酶促反應(yīng)生成游離與結(jié)合態(tài)的呋喃酮

最早發(fā)現(xiàn)HDMF是草莓的特征香氣物質(zhì)之一。尚未發(fā)現(xiàn)HDMF在草莓果實(shí)中較為完整的植物代謝合成途徑[22],但已取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展(圖4)：草莓果實(shí)中HDMF及其糖苷衍生物是由D-果糖和6-磷酸-D-果糖形成HDMF的甲氧化合物,醌氧化還原酶(FaQR)和烯酮氧化還原酶(FaEO)將其轉(zhuǎn)化為HDMF,通過(guò)葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶和丙二酰轉(zhuǎn)移酶生成HDMF葡萄糖苷衍生物[23]。其中,HDMF的碳架直接來(lái)源于D-果糖、FDP通過(guò)生物美拉德反應(yīng)生成的1-脫氧果糖或6-脫氧果糖,而非醛縮酶切割成2個(gè)C3單元[24]。草莓果實(shí)基因和菠蘿、番茄中發(fā)現(xiàn)的是同源基因,與高等植物生長(zhǎng)素誘導(dǎo)型蛋白編碼基因高度相似[23]。在草莓中合成HDMF的基因只在果實(shí)細(xì)胞中表達(dá),在后熟期大量積累[24]。草莓中存有呋喃酮葡萄糖醛酸和呋喃酮丙二酸葡糖苷,兩者未在葡萄中鑒定,但葡萄中含有HDMF苷元,Muscat Bailey A、V.labrusca(Bailey) xV.vinifera(Muscat Hamburg)的雜交葡萄,HDMF前驅(qū)物質(zhì)與草莓中呋喃酮前驅(qū)物質(zhì)相似,主要為mesifuran及其吡喃葡萄糖苷,在基因水平上UGT85K14葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因調(diào)控呋喃酮的糖基化[25]。

圖4 植物合成呋喃酮的路線(xiàn)圖[22]

5 微生物合成呋喃酮的可能途徑

5.1 微生物發(fā)酵釋放結(jié)合態(tài)HDMF

在發(fā)酵果汁中,微生物可釋放結(jié)合態(tài)HDMF(圖4)。不同葡萄品種的葡萄酒中HDMF從微量到3.5 mg/L不等,結(jié)合態(tài)香氣的釋放是其重要來(lái)源之一,葡萄酒中通過(guò)β-葡萄糖苷的果膠水解酶提高HDMF濃度。結(jié)合態(tài)HDMF有葡萄糖苷、呋喃酮-丙二?；?葡萄糖苷等[26],研究表明磷酸己糖異構(gòu)酶參與D-果糖轉(zhuǎn)化釋放結(jié)合態(tài)HDMF,參與的微生物有釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、貝氏絲孢酵母(Trichosporonbaileyi)[22];HDMF-葡萄糖醛酸存在于草莓果實(shí)中,β-葡萄糖苷酶可能是參與反應(yīng)的生物酶[27]。

5.2 微生物以美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物為底物合成HDMF

20世紀(jì)90年代已經(jīng)證明美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物可以促進(jìn)微生物生成HDMF。在單獨(dú)加熱后的L-鼠李糖溶液、濕熱滅菌的D-葡萄糖、酵母膏、蛋白胨培養(yǎng)基(YPG)中接種莢膜畢赤酵母(Pichiacapsulata)生長(zhǎng)4 d,均沒(méi)HDMF;而將單獨(dú)加熱的L-鼠李糖加入濕熱滅菌的YPG中,接種莢膜畢赤酵母(P.capsulata)生長(zhǎng)4 d后,檢測(cè)出HDMF,L-鼠李糖濃度增加HDMF生成量也增加,推測(cè)添加L-鼠李糖的YPG加熱后可以形成酵母菌合成HDMF的底物[28]。深色麥芽汁中檢測(cè)到HDMF,而淡色麥芽汁中未檢出,釀酒酵母(S.cerevisiae)發(fā)酵淺色和深色麥芽汁均生成HDMF[29]。shoyu-koji糖化汁(mugi-miso)中添加還原糖后加熱均產(chǎn)生HDMF,再接入魯氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)發(fā)酵,HDMF含量均有不同程度增加,其中D-鼠李糖可促進(jìn)美拉德反應(yīng)產(chǎn)生HDMF(125.5 mg/L)和酵母菌(T.dermatis)發(fā)酵生成HDMF(131.2 mg/L),高于其他糖類(lèi)誘導(dǎo)生成HDMF(美拉德反應(yīng)≤6 mg/L,酵母菌發(fā)酵≤8 mg/L);通過(guò)監(jiān)測(cè)發(fā)酵過(guò)程中各還原糖濃度、HDMF濃度、褐變度,作者推測(cè)酵母菌可將美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物(C6-1-脫氧核糖)轉(zhuǎn)化為HDMF(圖5),到目前僅是推測(cè),缺乏直接證據(jù)。將單一氨基酸和單一糖(核糖和半乳糖)混合液加熱(121 ℃,15 min)后,再添加至高壓蒸汽滅菌后的YPG中,魯氏酵母(Z.rouxii)發(fā)酵生成HDMF約1 mg/L[30]。在YPG中添加5%的D-果糖生成HDMF含量為1.8 mg/L,6-脫氧-L-甘露糖和6-脫氧核糖,經(jīng)濕熱滅菌后,接入魯氏接合酵母進(jìn)行發(fā)酵,分別生成5 mg/L和18 mg/L[31]。在慕薩萊思發(fā)酵過(guò)程中,通過(guò)果實(shí)的酶解和酸解釋放結(jié)合態(tài)呋喃酮,HDMF含量不斷增加。模擬葡萄汁滅菌后接入本土釀酒酵母(S.cerevisiae)發(fā)酵,均可產(chǎn)生HDMF,證明在慕薩萊思發(fā)酵過(guò)程中,微生物既降解葡萄汁中結(jié)合態(tài)呋喃酮,同時(shí)又代謝葡萄汁濃縮過(guò)程中美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物生產(chǎn)HDMF[32]。

圖5 微生物合成呋喃酮的可能代謝途徑

乳酸菌可以利用美拉德產(chǎn)物而生成HDMF,但無(wú)明確的代謝途徑報(bào)道。在含酵母膏和蛋白胨的培養(yǎng)基中,添加半乳糖和谷氨酸鈉、核糖和谷氨酸,培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)濕熱滅菌和0.22 μm膜過(guò)濾除菌,再乳酸乳球菌亞種(Lactococcuslactissubsp.Cremoris)發(fā)酵,均生成HDMF,濕熱滅菌培養(yǎng)基中HDMF的生成量分別是膜過(guò)濾除菌的9倍與3.3倍,說(shuō)明乳酸菌可以將美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為HDMF[33]。瑞士乳桿菌(L.helveficu)和德氏乳桿菌(L.delbrueckii)在乳清粉水懸浮液上培養(yǎng)7 d后,HDMF濃度分別為0.60 mg/L和0.45 mg/L,佛氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii)產(chǎn)生量為0.08 mg/L[34]。利用植物乳桿菌(L.amylolyticus)發(fā)酵麥芽汁飲品,HDMF為其關(guān)鍵風(fēng)味化合物之一。在濃縮葡萄汁中接入拜耳結(jié)合酵母(Z.bailii)、畢赤克魯維酵母(P.kluyveri)和釀酒酵母(S.cerevisiae)混菌發(fā)酵,30 d后檢測(cè)到發(fā)酵液中HDMF含量為172.30 mg/L[35]。在濃縮葡萄汁中接入野生型釀酒酵母發(fā)酵,14 d后HDMF含量為54.055 mg/L[36]。

5.3 微生物利用FDP代謝合成HDMF途徑

微生物在添加不同糖類(lèi)的培養(yǎng)基中生成HDMF的含量存在差異。在YPG中添加單磷酸糖(6-磷酸-D-葡萄糖、1-磷酸-D-果糖和6-磷酸-D-果糖),魯氏接合酵母生成少量HDMF(1.9～3.8 mg/L),而添加FDP,生成HDMF含量為52 mg/L[31]。在13°Bé麥汁中添加不同糖類(lèi)均可生成HDMF,其中添加FDP生成HDMF含量為45.6 mg/L,其他含量為14～17 mg/L[39],當(dāng)添加FDP濃度為100 g/L時(shí),HDMF的產(chǎn)量最高達(dá)到98 mg/L[43]。FDP作為唯一碳源并不能直接生成HDMF,而是酵母菌以FDP為底物的次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生,其完整代謝途徑不清楚,但已明確FDP先經(jīng)化學(xué)途徑轉(zhuǎn)化為1-脫氧-2,3-己二酮糖-6-磷酸,再由魯氏接合酵母細(xì)胞壁中生物酶合成HDMF[44]。

魯氏接合酵母在高濃度NaCl的YPG中加入D-果糖進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)D-果糖可提高魯氏接合酵母在糖酵解途徑(EMP)和磷酸戊糖(PPP)途徑中初級(jí)代謝產(chǎn)物及相關(guān)基因表達(dá),包括調(diào)節(jié)磷酸二羥丙酮的FBA基因,對(duì)應(yīng)酶活性與HDMF濃度相關(guān)[45]。作者沒(méi)有將可能的關(guān)鍵底物進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),關(guān)鍵底物可能是D-果糖的加熱(包括濕熱滅菌)非酶褐變或生物非酶褐變反。目前報(bào)道D-果糖轉(zhuǎn)化為HDMF的生物途徑主要有2種：一種是D-果糖在培養(yǎng)基中一起加熱,再微生物發(fā)酵形成HDMF,底物可能是D-果糖加熱過(guò)程中形成的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物,但尚無(wú)清晰的代謝途徑[31];另一種是在草莓成熟過(guò)程中作為HDMF的碳骨架來(lái)源,D-果糖通過(guò)生物美拉德反應(yīng)生成1-脫氧果糖或6-脫氧果糖[24]。

綜上表明,莢膜畢赤酵母,魯氏接合酵母,釀酒酵母,乳酸菌可以在不同糖類(lèi)培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)生HDMF,其生成量依據(jù)微生物、糖、氮源、美拉德反應(yīng)程度(色度)、厭氧與好氧、滲透壓等產(chǎn)生差異。目前微生物生成HDMF,初步明確微生物可釋放植物中結(jié)合態(tài)呋喃酮,或通過(guò)代謝美拉德中間產(chǎn)物生成途徑,轉(zhuǎn)化生產(chǎn)HDMF,或可能有其他代謝途徑(細(xì)菌代謝未加熱處理的培養(yǎng)物)可生成HDMF。不論哪種代謝途徑,均無(wú)完整而清晰的代謝途徑,極大限制了微生物合成HDMF的深入研究。

6 結(jié)論與展望

本文對(duì)HDMF的生物與非生物合成途徑進(jìn)行了全面綜述。目前,化學(xué)合成已成為工業(yè)合成主要途徑;植物合成代謝和美拉德反應(yīng)生成途徑較為清晰,揭示農(nóng)產(chǎn)品和食品加工形成HDMF的途徑,但目前沒(méi)有開(kāi)發(fā)應(yīng)用的報(bào)道;微生物合成HDMF具有綠色、低成本等優(yōu)勢(shì),但微生物合成HDMF的研究滯后,初步表現(xiàn)為釋放結(jié)合態(tài)HDMF較為清晰,酵母菌、乳酸菌等多種菌株發(fā)現(xiàn)可以利用FDP、美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物等為其可能的代謝底物,但代謝途徑不清晰。

隨著食品風(fēng)味科學(xué)的興起,關(guān)鍵香氣鑒定技術(shù)廣泛應(yīng)用,對(duì)食品風(fēng)味的形成實(shí)施精準(zhǔn)控制。對(duì)于傳統(tǒng)加熱后再發(fā)酵生成HDMF的食品,可以通過(guò)熱加工賦予該食品焦糖類(lèi)風(fēng)味,但由于美拉德反應(yīng)的復(fù)雜性,難以實(shí)現(xiàn)食品風(fēng)味的精細(xì)化控制。隨著我國(guó)綠色經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,HDMF市場(chǎng)需求的不斷增加,化學(xué)合成的HDMF難以滿(mǎn)足價(jià)廉、低污染、安全、高效的需求,也無(wú)法滿(mǎn)足人們對(duì)天然食材消費(fèi)增長(zhǎng)的需求。在植物中可以通過(guò)代謝途徑及關(guān)鍵酶調(diào)控生成HDMF,草莓植株進(jìn)行分子育種與栽培控制,可將HDMF的代謝通路進(jìn)行基因編輯等技術(shù)手段進(jìn)行改良,提高產(chǎn)量[];在富含HDMF植物中運(yùn)用現(xiàn)代分離提純技術(shù)提取HDMF;通過(guò)生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)高效價(jià)的HDMF,但合成周期長(zhǎng)、成本高、操作難度大,應(yīng)用范圍窄。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的HDMF香韻較好、品質(zhì)較高,具有不受環(huán)境限制等優(yōu)點(diǎn),是合成HDMF的新趨勢(shì),但需要對(duì)微生物合成HDMF的底物、代謝途徑、關(guān)鍵酶系、調(diào)控基因及優(yōu)良菌株等基礎(chǔ)性工作做深入研究。