蔣家睿,樊祥埼,鄭學(xué)玲

(河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院,河南 鄭州,450001)

小麥面筋蛋白,俗稱谷朊粉或活性小麥面筋[1],是小麥粉的重要組成部分,約占小麥粉的13%。面筋蛋白具有優(yōu)良的黏彈性、吸水性、延展性和薄膜成型性等[2],憑借這些物理特性,面筋蛋白被廣泛應(yīng)用于食品和飼料工業(yè)中。以食品行業(yè)為例,在我國古代就有食用面筋蛋白制成的食品的慣例,如素雞、香腸、肉凍等,隨著現(xiàn)代科技發(fā)展,人們對面筋蛋白也有了更加充分的認(rèn)知,于是面筋蛋白作為食品添加劑被廣泛應(yīng)用于各類食品制造中。有研究證明,在制作面條時(shí)加入面筋蛋白可以有效地改善其蒸煮品質(zhì),且可以提升其抗拉強(qiáng)度與韌性[3]。除此之外,人造肉作為一個(gè)新興領(lǐng)域,面筋蛋白也在其中起到相當(dāng)?shù)淖饔?MASTROMATTEO等[4]發(fā)現(xiàn)面筋蛋白獨(dú)特的形成網(wǎng)絡(luò)的能力可以促進(jìn)人造肉所用蛋白的組織化,張丙虎[5]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)面筋蛋白可以改善人造肉的質(zhì)構(gòu)特性。

小麥制粉工藝中將小麥胚乳粉碎后進(jìn)行重組,分為前路粉、中路粉和后路粉,前路粉主要來自于小麥胚乳芯部的物料,后路粉主要來自小麥胚乳外部的物料。國內(nèi)外已有不少對前中后路粉的相關(guān)研究,賈祥祥等[6]發(fā)現(xiàn),前路粉的水分、灰分、降落數(shù)值等顯著高于后路粉,而灰分和蛋白質(zhì)含量則是后路粉顯著高于前路粉;李巍[7]發(fā)現(xiàn)從前路粉到后路粉的白度呈下降趨勢,吸水率則是呈上升趨勢。出于經(jīng)濟(jì)因素考慮,我國目前小麥谷朊粉的生產(chǎn)主要采用中后路粉,面條、饅頭等蒸煮類面食食品主要采用前路和中路的小麥粉。本文通過對小麥生產(chǎn)線前、中、后路不同出粉部位的小麥粉分離出的面筋蛋白進(jìn)行特性測定與差異化分析,明確小麥前中后路粉的面筋蛋白差異規(guī)律性,為工業(yè)中谷朊粉生產(chǎn)的原料選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

某面粉廠生產(chǎn)線基礎(chǔ)粉：AF1、AF2、AF3、ABZ(AF1為前路粉,AF2為中路粉,AF3、ABZ為后路粉);Tris、甘氨酸、EDTA二鈉、5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)[5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid),DTNB]、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、磷酸緩沖液(pH=7)、溴酚藍(lán),以上試劑均為分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

JHMZ型針式和面機(jī),北京東方孚德科技發(fā)展中心;冷凍干燥機(jī),北京亞星儀科科技發(fā)展有限公司;馬弗爐,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;FossKjeltec8400全自動(dòng)凱氏定氮儀,福斯分析儀器公司;恒溫水浴振蕩器,金壇市華峰儀器有限公司;DL-5-B離心機(jī),上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;紫外分光光度計(jì),上海奧析科學(xué)儀器有限公司;哈克RS6000流變儀,德國Haake公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 制樣

面筋蛋白的制備參考徐小青等[8]的方法并稍加修改,取30 g面粉與15 mL蒸餾水放置和面機(jī)中和面3 min,和面完成后置于室溫醒發(fā)25 min,醒發(fā)完成后用足量蒸餾水揉洗面團(tuán),并將蒸餾水中的面團(tuán)碎片收集重新加入面團(tuán),如此反復(fù)直至揉洗后的蒸餾水清澈無渾濁且加入碘液后碘液不變藍(lán)。將洗出的濕面筋置于冰柜冷凍10 h后在放入冷凍干燥機(jī)里干燥36 h,再將干燥完成的面筋用研磨磨成粉過100目篩即得樣品,樣品放于5 ℃環(huán)境下保存。

1.3.2 基本理化指標(biāo)

水分的測定參考GB 5009.3—2016方法;灰分的測定參考GB 5009.4—2016方法;蛋白質(zhì)的測定參考GB 5009.5—2016方法;吸水率的測定參考GB/T 21924—2008方法;面筋指數(shù)的測定參考LS/T 6102—1995方法。

1.3.3 游離巰基

參考LUO等[9]的方法并稍加修改。先制備Tris-Gly緩沖液(取5.214 g Tris、3.378 g甘氨酸與0.744 5 g EDTA二鈉溶于一定量蒸餾水再定容至500 mL),取50 mL Tris-Gly緩沖液加入0.2 g DTNB混勻制得DTNB溶液,再稱量2.5 g SDS溶于100 mL Tris-Gly緩沖液得到SDS-Tris-Gly緩沖液。取50 mg面筋蛋白溶于6 mL SDS-Tris-Gly緩沖液中于水浴振蕩器反應(yīng)70 min(反應(yīng)期間每10 min取出樣品并渦旋振蕩30 s),再于2 000×g的條件下離心15 min,取1 mL離心后上清液加入50 μL DTNB,反應(yīng)30 min后,在412 nm處測定吸光度(空白組設(shè)為蒸餾水)。游離巰基含量計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：A412為空白組在412 nm處測得的吸光度;C取8 mg/mL,代表蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.3.4 表面疏水性

參考CHELHI等[10]的方法并稍加修改,取15 mg面筋蛋白置于1.5 mL 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液中(pH 7.0)中充分混勻,再加入300 μL 1 mg/mL溴酚藍(lán)指示劑于渦旋振蕩器上振蕩2 min,之后于4 000×g的條件下離心10 min,取上清液再稀釋至10 mL,用酶標(biāo)儀在595 nm下測其吸光度(空白組設(shè)為蒸餾水)。溴酚藍(lán)結(jié)合量計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：A空為空白組在595 nm處測得的吸光度,A樣為樣品在595 nm處測得的吸光度。

1.3.5 麥谷蛋白大聚體(glutenin macropolymer,GMP)

參考任佳影等[11]的方法并加以修改,取0.5 g面筋蛋白溶于10 mL 1.5 g/100 mL SDS提取液,于室溫條件下置于水浴振蕩器振蕩1 h,在9 000×g條件下離心15 min,棄去上清液,重復(fù)上述步驟一次。得到的沉淀使用自動(dòng)凱氏定氮儀測定蛋白質(zhì)含量。

1.3.6 流變學(xué)特性

按照1.3.1節(jié)的方法制取濕面筋,再將濕面筋放置于哈克流變儀2個(gè)35 mm平行板之間,板間間隙設(shè)置為1 mm。濕面筋安置好后掛掉溢出的濕面筋,再用礦物油封存間隙四周,靜置5 min后開始頻率掃描與蠕變回復(fù)。頻率掃描參數(shù)設(shè)置為溫度(25±0.1) ℃;固定應(yīng)力15 Pa;頻率范圍0.1～10 Hz,蠕變回復(fù)參數(shù)設(shè)置為溫度(25±0.1) ℃;固定應(yīng)力15 Pa;蠕變時(shí)間300 s;恢復(fù)時(shí)間600 s。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)匯總于Excel 2021進(jìn)行整理,使用Origin2022 64bit進(jìn)行繪圖,IBM SPSS20進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥前中后路粉面筋蛋白基本理化指標(biāo)分析

表1是小麥前中后路粉的基礎(chǔ)理化指標(biāo)。由表1可知,前中后路粉面筋蛋白的灰分與蛋白含量呈現(xiàn)上升趨勢,吸水率、白度與面筋指數(shù)總體呈現(xiàn)下降趨勢。這可能是因?yàn)榛曳治镔|(zhì)主要集中在小麥麩皮處,而前路粉主要是由小麥胚乳部分研磨而成,灰分物質(zhì)在小麥粉分離面筋蛋白時(shí)不溶于水,故后路粉面筋蛋白灰分含量顯著高于前路粉面筋蛋白。前中后路粉面筋蛋白的蛋白含量呈現(xiàn)上升趨勢,這是因?yàn)樾←湻鄣牡鞍踪|(zhì)主要集中在小麥顆粒的胚乳與糊粉層中,其胚乳蛋白含量由內(nèi)到外逐步增加,蛋白品質(zhì)逐步下降[12],且后路粉研磨過程中會(huì)摻有表皮等雜質(zhì)導(dǎo)致后路粉面筋蛋白含量顯著高于前路粉面筋蛋白。面筋蛋白的面筋強(qiáng)度是指小麥粉濕面筋在離心力的作用下通過一定孔徑篩板后篩下物與原濕面筋質(zhì)量之比,它體現(xiàn)了該面筋蛋白的強(qiáng)度,在制粉過程中,后路粉經(jīng)過多次研磨,其面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可能遭到破壞,因此面筋指數(shù)低于前路粉。

表1 小麥前中后路粉面筋蛋白基本理化指標(biāo) 單位：%

2.2 小麥前中后路粉面筋蛋白游離巰基含量分析

小麥面筋蛋白中的麥谷蛋白和麥醇溶蛋白主要依靠二硫鍵來維持結(jié)構(gòu)[13-14],而蛋白質(zhì)中二硫鍵與游離巰基是相互轉(zhuǎn)換的關(guān)系,游離巰基含量增多說明二硫鍵發(fā)生了斷裂,蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞,蛋白質(zhì)空間穩(wěn)定性下降,所以游離巰基可以作為觀測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的一個(gè)重要指標(biāo)[15]。不同出粉點(diǎn)對小麥面筋蛋白的游離巰基含量影響如圖1所示,圖中的a、b、c、d標(biāo)注代表了前中后路粉的游離巰基含量依次顯著性增加(P=0.014<0.05)。這說明在出粉點(diǎn)靠前的條件下,面筋蛋白更容易聚集,二硫鍵數(shù)量增多,空間結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定,而經(jīng)過多次篩選聚集研磨的后路粉蛋白質(zhì)品質(zhì)沒有前路粉蛋白質(zhì)品質(zhì)高,且后路粉中的麥谷蛋白含量沒有前路粉高[16],故游離巰基含量增多,這也與SUTTON等[17]的研究結(jié)果相符合。

圖1 小麥前中后路粉面筋蛋白游離巰基含量

2.3 小麥前中后路粉面筋蛋白表面疏水性分析

蛋白質(zhì)的表面疏水性是指暴露在蛋白質(zhì)分子表面且可以鍵合疏水鍵團(tuán)的數(shù)量[18],其與蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特性、加工方法以及條件有關(guān)。表面疏水性可以體現(xiàn)出蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的穩(wěn)定性,反映出分子間相互作用的強(qiáng)度,一般來說,表面疏水性越強(qiáng)蛋白質(zhì)空間穩(wěn)定性越差。此外,表面疏水性還可以體現(xiàn)出蛋白質(zhì)的變性程度[19]。本次實(shí)驗(yàn)采用更適合溶解度低的溴酚藍(lán)法,溴酚藍(lán)結(jié)合量越多,代表面筋蛋白的表面疏水性越強(qiáng)。前中后路粉的表面疏水性差異如圖2所示,圖中a、b、c、d標(biāo)注說明了4種面粉面筋蛋白的表面疏水性依次增加且樣品間均存在極顯著性差異(P=0.00<0.01),AF1粉面筋蛋白表面疏水性最弱,表明了其蛋白表面疏水基團(tuán)數(shù)量最少,空間結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定,這是因?yàn)榍奥贩勖娼畹鞍准兌雀唠s質(zhì)少,而ABZ粉面筋蛋白表面疏水性最強(qiáng)是因?yàn)榕c后路粉相比,前路粉會(huì)經(jīng)過多次研磨,機(jī)械運(yùn)動(dòng)破壞了蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu),使得蛋白質(zhì)之間的疏水相對作用下降,蛋白質(zhì)分子鏈展開,疏水基團(tuán)暴露出來,并且后路粉面筋蛋白中還可能存在其他諸如麩皮等雜質(zhì)影響了其表面疏水性。

圖2 小麥前中后路粉面筋蛋白表面疏水性差異

2.4 小麥前中后路粉面筋蛋白GMP分析

麥谷蛋白可以根據(jù)分子質(zhì)量分為高分子質(zhì)量亞基和低分子質(zhì)量亞基,麥谷蛋白亞基通過二硫鍵相互作用集聚而成的聚合體被稱為GMP[20],它是面筋蛋白物理特性的主要決定因素,其數(shù)量和特性與蛋白質(zhì)的流變特性密切相關(guān)。前中后路粉面筋蛋白GMP含量如圖3所示,前中后路粉GMP含量呈下降趨勢,其中AF1粉與AF2粉雖符合下降趨勢但是趨勢不明顯,AF3粉與ABZ粉下降趨勢極顯著,這是因?yàn)槌龇埸c(diǎn)靠前的面粉中的蛋白質(zhì)雖然含量較少,但是蛋白純度高質(zhì)量好,麥谷蛋白聚合程度高,而出粉點(diǎn)靠后的面粉由于多次磨粉機(jī)械運(yùn)動(dòng),GMP發(fā)生解聚導(dǎo)致GMP含量下降,此外GMP含量可以側(cè)面說明該蛋白質(zhì)二硫鍵數(shù)量與游離巰基含量變化,當(dāng)GMP含量下降時(shí)反映了該蛋白二硫鍵數(shù)量下降,游離巰基含量增多,這與游離巰基實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。

圖3 小麥前中后路粉面筋蛋白GMP含量

2.5 小麥前中后路粉面筋蛋白流變學(xué)特性分析

2.5.1 小麥前中后路粉面筋蛋白頻率掃描分析

在流變學(xué)實(shí)驗(yàn)中,G′代表儲(chǔ)能模量,它可以反映該物質(zhì)的彈性,G″代表損耗模量,它可以反映該物質(zhì)的黏性。小麥前中后路粉面筋蛋白流變學(xué)特性差異如圖4-a和圖4-b所示,隨著頻率的上升,無論是儲(chǔ)能模量還是損耗模量,前中后路粉面筋蛋白均呈現(xiàn)上升趨勢,其中AF1粉面筋蛋白的儲(chǔ)能模量和損耗模量最大,AF2、AF3、ABZ三種粉面筋蛋白依次降低,這說明了4種面筋蛋白里AF1的黏彈性最大,ABZ的黏彈性最小,間接說明了AF1粉的面筋蛋白麥谷蛋白與麥醇溶蛋白含量高質(zhì)量好,面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定,ABZ粉面筋蛋白面筋質(zhì)量最差。損耗正切角tanδ是損耗模量與儲(chǔ)能模量的比值,它可以反映該物質(zhì)的流動(dòng)性,tanδ越小,說明該物質(zhì)流動(dòng)性越差,物質(zhì)組分中的高聚物占比越大[21],從圖4-c可以看出AF1～ABZ粉面筋蛋白的損耗正切角隨著頻率上升基本呈現(xiàn)上升趨勢,其中ABZ最大,AF1最小,4種面筋蛋白均小于1,說明了4種面筋蛋白均彈性大于黏性,且AF1面筋蛋白流動(dòng)性最差,高聚物GMP含量最高,ABZ面筋蛋白流動(dòng)性最好,高聚物GMP含量最低,這也與GMP測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。

a-儲(chǔ)能模量;b-損耗模量;c-損耗正切角圖4 小麥前中后路粉面筋蛋白儲(chǔ)能模量、損耗模量與損耗正切角隨頻率變化曲線圖

2.5.2 小麥前中后路粉面筋蛋白蠕變恢復(fù)分析

小麥面筋蛋白的蠕變恢復(fù)分為2個(gè)階段,第一階段是面筋蛋白受作用于它的外力影響發(fā)生一定形變,這一階段被稱為蠕變階段,第二階段是是外力撤銷后面筋蛋白形變量隨時(shí)間變化,這一階段被稱為恢復(fù)階段。面筋蛋白的蠕變回復(fù)特性可以體現(xiàn)出其黏彈特性,在該實(shí)驗(yàn)中,樣品的彈性越大,其越不容易發(fā)生形變且越容易恢復(fù)到最小形變量,即樣品的彈性與它的最大形變量呈反比[22]。4種面筋蛋白的蠕變回復(fù)曲線如圖5所示,AF1粉面筋蛋白的最大形變量與不可恢復(fù)形變量明顯低于ABZ粉面筋蛋白,由此可知,前路粉面筋蛋白的彈性最好,后路粉面筋蛋白彈性最差,這也與頻率掃描結(jié)果相吻合。

圖5 小麥前中后路粉面筋蛋白蠕變恢復(fù)曲線

3 結(jié)論與展望

本實(shí)驗(yàn)通過對同種小麥不同出粉點(diǎn)面粉的面筋蛋白進(jìn)行基本理化指標(biāo)測定,同時(shí)對其結(jié)構(gòu)特性與流變學(xué)特性進(jìn)行評(píng)測,發(fā)現(xiàn)不同粉路面粉的面筋蛋白的組分分布以及空間結(jié)構(gòu)特性存在一定規(guī)律性顯著差異,前中后路粉面筋蛋白的灰分與蛋白含量呈現(xiàn)上升趨勢,而吸水率與面筋指數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢,4種面筋蛋白游離巰基數(shù)量與表面疏水性由前路到后路依次增加,而GMP含量則是后路粉面筋蛋白顯著低于前路粉面筋蛋白。在流變學(xué)實(shí)驗(yàn)中,前路粉面筋蛋白的儲(chǔ)能模量與損失模量均顯著高于后路粉面筋蛋白,在蠕變回復(fù)階段后路粉面筋蛋白最大形變量與不可恢復(fù)形變量顯著高于前路粉面筋蛋白。

目前國內(nèi)外對系統(tǒng)粉的研究主要集中在不同粉路制品的差異性分析中,而對不同粉路面筋蛋白的研究較少,小麥前路粉蛋白質(zhì)主要集中在其胚乳部分,而小麥后路粉蛋白質(zhì)主要集中在小麥籽粒的糊粉層中,故在制作小麥面制品時(shí),選用前路粉制作的面制品其蛋白品質(zhì)要優(yōu)于原料為后路粉的制品但經(jīng)濟(jì)性并無優(yōu)勢。因此在實(shí)際生產(chǎn)加工過程中,可以依據(jù)前中后路粉的面筋蛋白差異性,在滿足質(zhì)量與經(jīng)濟(jì)需求的前提下為最終制品選用較為適合的原料粉。