黃可承,包建強(qiáng),2,3*,張星高,鄭穩(wěn),莊文靜,宮萱

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海,201306)2(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室,上海,201306) 3(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海,201306)

膠原蛋白作為動(dòng)物體結(jié)締組織的主要結(jié)構(gòu)蛋白,占動(dòng)物體蛋白總量的30%[1],是決定人體組織結(jié)構(gòu)強(qiáng)度的主要因素[2]。膠原蛋白與人體組織修復(fù)、創(chuàng)口愈合聯(lián)系密切,憑借良好的生物相容性低免疫原性在食品、藥品、醫(yī)療產(chǎn)業(yè)中廣泛應(yīng)用。

中華鱉(Trionyxsinensis)也稱為甲魚,具有高蛋白、低脂肪等優(yōu)點(diǎn),鱉肉不僅味道鮮美,鱉甲、裙邊皆有不同的食療保健作用,是廣受消費(fèi)者好評(píng)的滋補(bǔ)品[3]。作為我國(guó)淡水養(yǎng)殖的特色產(chǎn)品之一,在近五年的時(shí)間里,中華鱉的年養(yǎng)殖量一直保持在30萬 t以上,并有著持續(xù)上升的趨勢(shì)[4]。年養(yǎng)殖量的上升將形成大規(guī)模、大密度鱉類飼養(yǎng)環(huán)境。在這種條件下容易引發(fā)中華鱉相互攻擊,造成中華鱉的死亡。鱉死亡后,鱉體內(nèi)的組氨酸會(huì)在微生物的作用下迅速產(chǎn)生組胺,食用后會(huì)造成組胺中毒,所以死亡后的中華鱉往往被當(dāng)作廢料丟棄,大大降低了中華鱉的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。而在以往對(duì)鱉類副產(chǎn)物的研究中發(fā)現(xiàn),背甲[5]、裙邊[6]均可作為良好的膠原蛋白提取原料,為這一現(xiàn)狀提供了新思路。如果能有效提取死亡中華鱉中膠原蛋白等營(yíng)養(yǎng)成分,將會(huì)對(duì)有效減少水產(chǎn)品資源的浪費(fèi)以及對(duì)環(huán)境的污染。

本實(shí)驗(yàn)在中華鱉副產(chǎn)物研究的基礎(chǔ)上,通過檸檬酸和胃蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶的不同提取方式,從中華鱉凍干粉中提取酸溶性膠原(acid-soluble collagen,ASC)和4種酶溶性膠原(enzyme-soluble collagen,ESC)。對(duì)5種膠原蛋白的氨基酸組成、微觀結(jié)構(gòu)、熱穩(wěn)定性、氣味物質(zhì)進(jìn)行比較分析,旨在減少中華鱉資源流失的同時(shí)擴(kuò)大鱉源膠原蛋白的應(yīng)用范圍,為中華鱉加工業(yè)發(fā)展提供實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中華鱉由寧波鳴鳳養(yǎng)殖場(chǎng)提供,選用雌、雄鱉各500只,質(zhì)量為670～710 g,去除內(nèi)臟后,剩余組分低溫冷凍研磨成粉,貯存于-80 ℃中;檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、酸性蛋白酶(700 000 U/g)、木瓜蛋白酶(200 000 U/g)、胃蛋白酶(250 000 U/g)、風(fēng)味蛋白酶(30 000 U/g),上海麥克林股份有限公司;NaCl、異丙醇等均為分析純,國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SU5000熱場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡,日本日立公司;DSC8500差式掃描量熱儀,美國(guó)PeekinElmer公司;17-3930小型垂直電泳儀,美國(guó)Bio-Rad公司;iS10 傅里葉變換紅外光譜儀,美國(guó)Thermo Nicolet公司;LA-8080超高速氨基酸自動(dòng)分析儀,日本日立公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 中華鱉粉基本成分測(cè)定

蛋白質(zhì)：參考GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》凱氏定氮法;脂肪：參考GB 5009.6—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》索氏抽提法;水分：參考GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》直接干燥法;灰分：參考GB 5009.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》高溫灼燒法。

1.3.2 中華鱉粉預(yù)處理

將研磨后的中華鱉置于真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干2 d去除水分,中華鱉凍干粉貯存于玻璃真空干燥皿中備用。

參考文獻(xiàn)[7]的方法并略微改動(dòng),稱取5 g中華鱉凍干粉,提取過程均在4 ℃下。加入150 mL 2.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl,連續(xù)攪拌24 h,去除鹽溶性蛋白。離心后棄去上清液,所得沉淀繼續(xù)添加10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))異丙醇,浸泡24 h去除脂肪,離心后向沉淀中加入150 mL 0.1 mol/L EDTA,靜置過夜,離心棄去上清液,所得沉淀靜置于4 ℃冰箱備用。

1.3.3 膠原蛋白提取

根據(jù)LIU等[8]的方法,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行修改。

a)ASC：所有操作均在4 ℃條件下進(jìn)行。樣品中加入175 mL檸檬酸,攪拌提取8 h,所得溶液于12 000 r/min 下離心10 min,棄去沉淀,上清液加入NaCl至濃度達(dá)到0.9 mol/L,鹽析過夜。離心后所得沉淀加入最小體積的檸檬酸使其溶解,于透析袋中透析2 d,然后進(jìn)行冷凍干燥得到ASC。

b)ESC：樣品加入175 mL去離子水,并使用檸檬酸調(diào)節(jié)pH值至4種酶的最適pH區(qū)間,加入酶,使溶液酶活性達(dá)到2 500 U,在4 ℃下攪拌提取12 h,隨后處理與ASC相同,透析結(jié)束后冷凍干燥的得到ESC。

膠原蛋白得率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

1.3.4 SDS-PAGE

參照LAEMMLI等[9]的方法,將所制膠原蛋白樣品20 μL加入至8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))分離膠和5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))濃縮膠制成的SDS-PAGE預(yù)制膠內(nèi),120 V電泳60 min。結(jié)束后使用考馬斯亮藍(lán)R-250快速染色液對(duì)預(yù)制膠染色30 min,隨后脫色。

1.3.5 掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)

根據(jù)YANG等[10]的方法,將凍干的膠原蛋白樣品放置在標(biāo)準(zhǔn)SEM樣品臺(tái)上,并離子噴涂金,以5 kV電壓觀察蛋白微觀結(jié)構(gòu),比較不同提取方法下膠原蛋白的結(jié)構(gòu)特征與差異。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectrometer,FT-IR)

根據(jù)文獻(xiàn)[11]的方法并進(jìn)行一定的修改,光譜掃描范圍為4 000～500 cm-1,分辨率為4 cm-1,得到5種膠原蛋白吸收峰的變化曲線。

1.3.7 差式量熱掃描儀(differential scanning calorimetry, DSC)

參考張強(qiáng)等[6]的測(cè)量方法,稱取0.1 g凍干粉加入4 mL乙酸,準(zhǔn)確稱取10 mg液體于坩堝中,掃描溫度20～70 ℃,以5 ℃/min的速率進(jìn)行升溫,以空白坩堝作為對(duì)照。

1.3.8 GC-MS

參考CHEN等[12]的方法并進(jìn)行一定的修改,將色譜柱溫度編程設(shè)置在40 ℃下5 min,然后以3 ℃/min的速率升降到220 ℃并保持5 min。質(zhì)譜儀的電子電離電壓和離子源溫度分別為70 eV和230 ℃。質(zhì)譜儀的掃描范圍設(shè)置為40～400m/z。通過將其質(zhì)譜數(shù)據(jù)與其標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(NIST-14)進(jìn)行比較來識(shí)別氣味劑,計(jì)算每種化合物的保留指數(shù)(retention index,RI),并與其標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。通過GC-MS探究不同方法所得到的鱉源膠原蛋白的氣味。

1.3.9 氨基酸成分分析

參考GB 5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》。稱取膠原蛋白凍干10 mg,加入6 mol/L鹽酸,水解22 h,冷卻至室溫后定容。準(zhǔn)確吸取0.5 mL樣液于干燥皿中,減壓干燥,干燥殘留物用0.5 mL水解直至蒸干。蒸干后加入2 mL檸檬酸鈉緩沖溶液,通過0.22 μm濾膜后轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶備用。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 27和Origin 2017進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 中華鱉粉基本成分分析

由圖1可知,中華鱉粉粗蛋白含量占總組分的18.22%,雖低于鱉裙邊粗蛋白[6],但水分、粗脂肪含量較低,原料量大,易于獲取等優(yōu)點(diǎn),依舊可以視為較好的膠原蛋白來源。

圖1 中華鱉粉基本成分

2.2 中華鱉粉膠原蛋白得率

由圖2可知,由于膠原蛋白末端肽鏈在酸性條件下的溶解度較低,酶裂解后,能夠提高膠原蛋白肽鏈在酸性溶液中的溶解度,進(jìn)而提高膠原蛋白的提取效率,所以酸法較酶法提取率偏低。在不同酶提取率比較中,胃蛋白酶與酸性蛋白酶顯著高于風(fēng)味與木瓜蛋白酶(P<0.05)。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)域在酸性條件下更易受到裂解[12],所以pH在酸性或弱酸性時(shí),鱉粉膠原蛋白提取效率更高。

圖2 中華鱉粉膠原蛋白提取率

2.3 中華鱉粉膠原蛋白SDS-PAGE凝膠電泳分析

圖3中的1～5條帶分別對(duì)應(yīng)檸檬酸、酸性蛋白酶、胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶的電泳條帶。從上到下可以依次看見γ、β、α1、α2鏈,其中α1、α2鏈分子質(zhì)量為135～180 kDa,確定了γ鏈(300 kDa)與β鏈(250 kDa)的條帶,進(jìn)一步證明中華鱉粉中存在Ⅰ型膠原蛋白。ASC與ESC的α2鏈下還存在其他條帶,說明均有小分子肽的存在。

1-檸檬酸;2-酸性蛋白酶;3-胃蛋白酶;4-風(fēng)味蛋白酶;5-木瓜蛋白酶圖3 中華鱉粉ASC與ESC SDS-PAGE電泳圖

2.4 中華鱉粉膠原蛋白SEM分析

圖4是在1 mm、500 μm、100 μm 3種放大倍數(shù)下對(duì)5種膠原蛋白的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,圖中顯示,2種中性酶(風(fēng)味、木瓜)提取的膠原蛋白交聯(lián)程度低,多為片狀,且較為松散(圖4-d-1～圖4-d-3,圖4-e-1～圖4-e-3)。猜測(cè)因?yàn)轺M粉中同時(shí)存在裙邊以及背甲組織,導(dǎo)致檸檬酸與胃蛋白酶法提取的膠原蛋白存在少量海綿組織與多孔交聯(lián)組織的混合結(jié)構(gòu)(圖4-a-1～圖4-a-3,圖4-b-1～圖4-b-3),酸性蛋白酶法得到的膠原蛋白呈多層片狀結(jié)構(gòu),緊密程度高于風(fēng)味、木瓜蛋白酶法,但交聯(lián)程度低于胃蛋白酶與檸檬酸法。由此可得,不同提取方式會(huì)對(duì)膠原蛋白微觀結(jié)構(gòu)造成影響。

a-檸檬酸;b-酸性蛋白酶;c-胃蛋白酶;d-風(fēng)味蛋白酶;e-木瓜蛋白酶圖4 中華鱉粉酸溶性膠原ASC與酶溶性膠原ESC掃描電鏡圖

2.5 中華鱉粉膠原蛋白FT-IR分析

圖5為5種提取工藝下中華鱉粉膠原蛋白在4 000～500 cm-1紅外吸收光譜圖。圖5-a顯示,不同工藝提取的膠原蛋白峰形存在差異。圖5-b、圖5-c中酰胺A帶處于3 273.23、3 231.28 cm-1附近,均小于N—H的拉伸振動(dòng)范圍(3 400～3 440 cm-1),說明鱉粉膠原蛋白的穩(wěn)定性由氫鍵主導(dǎo)[13]。5種膠原蛋白的酰胺B帶出現(xiàn)在2 971.41 cm-1和2 970.45 cm-1附近,說明是由C—H的不對(duì)稱伸展和伸縮振動(dòng)引起的特征吸收峰[14]。在對(duì)酰胺Ⅱ帶的分析中發(fā)現(xiàn),由于甘氨酸和脯氨酸側(cè)鏈的—CH2與蛋白質(zhì)C—N、N—H基團(tuán)的收縮、彎曲振動(dòng)發(fā)生了耦合,導(dǎo)致酸性、風(fēng)味、木瓜蛋白酶法吸收峰位于1 400～1 500 cm-1[15],而胃蛋白酶與檸檬酸法所得膠原蛋白的酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ帶分別位于1 633.48、1 557.30、1 241.02 cm-1,僅與雙鍵基團(tuán)的拉伸振動(dòng)有關(guān),耦合程度較小[16]。紅外光譜表明5種膠原蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)保留完整,與ZOU等[14]對(duì)龜甲,SUN等[17]對(duì)羅非魚皮的研究結(jié)果一致,酶法與酸法均保留了較好的膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)。

圖5 中華鱉粉ASC與ESC傅里葉紅外光譜圖

2.6 中華鱉粉膠原蛋白熱穩(wěn)定性分析

圖6顯示了中華鱉粉ASC與ESC的熱變性溫度曲線。ASC熱變性溫度略低于ESC,但無顯著差異(P>0.05)。研究顯示,魚皮膠原蛋白的熱變性溫度在35 ℃以下[18],并且軟殼龜皮膚膠原蛋白[19]與軟殼龜裙邊膠原蛋白[10]的熱變性溫度分別為36 ℃和35.1 ℃,這表明鱉粉膠原蛋白熱穩(wěn)定性要優(yōu)于魚皮和軟殼龜皮膚、裙邊組分。ZOU等[14]的研究表明,超聲波等物理處理方式能夠有效提高膠原蛋白熱穩(wěn)定性,在本研究中,胃蛋白酶法提取的膠原熱穩(wěn)定性最好,下一步可以采取超聲波處理等方式進(jìn)一步提高鱉粉膠原蛋白的熱穩(wěn)定性,為鱉源膠原蛋白的應(yīng)用提供更豐富的實(shí)踐基礎(chǔ)。

圖6 中華鱉粉ASC與ESC膠原熱變性溫度曲線

2.7 中華鱉粉在不同提取方法下的氣味特征分析(GC-MS)

如表1所示,通過質(zhì)譜與RI值定性分析,分別從5種方法中檢測(cè)出12種(檸檬酸)、10種(酸性蛋白酶)、4種(胃蛋白酶)、9種(風(fēng)味蛋白酶)、14種(木瓜蛋白酶)揮發(fā)性氣味物質(zhì)。5種膠原蛋白的主要?dú)馕稙楸江h(huán)、乙酸乙酯(芳香類)和酮、醇(果香類)化合物,同時(shí),不同提取方法會(huì)使膠原混有其他氣味成分(來源于非膠原蛋白雜質(zhì)),這兩者共同決定了所提膠原的氣味構(gòu)成,間接影響鱉粉膠原蛋白在各領(lǐng)域中的應(yīng)用。檸檬酸法中檢測(cè)出使水產(chǎn)品產(chǎn)生強(qiáng)烈刺激性氣味的異戊醇(主要存在于淡水魚皮膚[20]),而酶法并未檢出。

表1 中華鱉粉在不同提取方法下的氣味物質(zhì)成分Table 1 Odor composition of Chinese soft-shelled turtle powder under different extraction methods

說明酶法能一定程度上避免水產(chǎn)品原料中的刺激性氣味進(jìn)入提取成分中;除此之外,檸檬酸、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶提取出的萘(樟腦味),對(duì)膠原蛋白后續(xù)應(yīng)用存在不利影響;風(fēng)味蛋白酶提取出的糠醛成分(面包、焦糖味)能提升酶溶性膠原蛋白在功能性食品上的應(yīng)用潛力;同時(shí)胃蛋白酶法提取出的揮發(fā)性氣味物質(zhì)最少,更適用于生物醫(yī)藥產(chǎn)品的研發(fā)。

2.8 中華鱉粉膠原蛋白氨基酸分析

表2、表3顯示了中華鱉粉膠原蛋白的氨基酸組成。中華鱉粉膠原蛋白中必需氨基酸占比優(yōu)于中華鱉裙邊[6],說明中華鱉粉膠原蛋白具備較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。其中胃蛋白酶溶性膠原蛋白氨基酸總量最高,而呈味氨基酸含量較少,與前文GC-MS研究結(jié)果一致。

表2 中華鱉粉ASC與ESC氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of ASC and ESC of Chinese turtle powder

表3 中華鱉粉ASC與ESC氨基酸占比 單位：%

膠原蛋白的分子結(jié)構(gòu)主要通過Pro和Hyp的吡咯烷環(huán)對(duì)多肽鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的限制來維持,并且部分由Hyp的羥基的氫鍵能力維持[21]。亞氨基酸含量越高,螺旋的穩(wěn)定性和膠原蛋白的熱穩(wěn)定性就越大[22]。本研究中,胃蛋白酶溶性膠原蛋白亞氨基酸含量較高,具有較高的熱變性溫度,與DSC測(cè)定結(jié)果相同。

3 結(jié)論

本文采用5種不同提取方法,從中華鱉粉中提取到ASC和4種ESC,對(duì)所提膠原蛋白進(jìn)行理化指標(biāo)的測(cè)定與分析。

不同提取方法對(duì)膠原蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、氨基酸組成、氣味組成、微觀形態(tài)均存在影響。對(duì)比不同提取方式,ESC提取率顯著高于ASC,其中最適pH<5的酶類能夠有效提高鱉粉膠原蛋白產(chǎn)率。傅里葉紅外光譜結(jié)果顯示5種提取方法均能得到完整膠原蛋白結(jié)構(gòu),其中胃蛋白酶溶性膠原蛋白基團(tuán)耦合程度較小,三螺旋結(jié)構(gòu)最為穩(wěn)定。對(duì)比不同方法的氨基酸組成與熱穩(wěn)定性(DSC),推測(cè)膠原蛋白熱穩(wěn)定性與亞氨基酸含量呈正相關(guān)。根據(jù)氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定的數(shù)據(jù),胃蛋白酶溶性膠原中,雜質(zhì)氣味較少,無刺激性氣味組分,僅以芳香、果香為主,結(jié)合其微觀結(jié)構(gòu)(SEM),胃蛋白酶溶性膠原交聯(lián)程度高、延展性強(qiáng),具有更好的食品、醫(yī)藥利用價(jià)值。

根據(jù)SDS-PAGE凝膠電泳圖譜中的條帶與分子質(zhì)量判斷,鱉粉膠原具備I型膠原的主要特征,說明鱉粉膠原蛋白具備一定的純度,但酶法提取的α2鏈下方存在明顯條帶,說明部分膠原蛋白在酶的持續(xù)作用下降解為小分子肽,對(duì)膠原的純度造成了部分影響,但結(jié)合本研究其余數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)：鱉粉膠原蛋白的主要性質(zhì)并未被影響,依舊能保持I型膠原的主要特征。若想采取進(jìn)一步的研發(fā),則需進(jìn)行更精密的純化操作,以隔絕小分子肽的干擾。

綜上,5種提取方法對(duì)鱉粉膠原蛋白的產(chǎn)量、氨基酸含量、微觀結(jié)構(gòu)、熱穩(wěn)定性等方面均存在影響。通過比較,胃蛋白酶提取的鱉粉膠原蛋白具有氣味小、交聯(lián)程度高、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)勢(shì),具備進(jìn)一步純化、開發(fā)利用的潛力。