王妍凌,陳杉彬,趙文梅,尹麗萍,黎進雪,張海鵬,張金萍,黃翠,呂嘉偉,武運*,薛潔*

1(新疆農(nóng)業(yè)大學 食品科學與藥學學院,新疆 烏魯木齊,830052) 2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京,100015)3(國家酒類品質與安全國際聯(lián)合研究中心,北京,100015)

葡萄酒是單種或多種葡萄進行發(fā)酵后產(chǎn)生的天然酒精型飲品[1],含有多酚、氨基酸、維生素等活性物質[2]。其中多酚類物質含量最為豐富[3]。目前檢測的葡萄酒中酚類物質主要包括黃烷-3-醇類、黃酮醇類、對羥基苯甲酸類、對羥基肉桂酸類等[4]。楊志偉等[3]檢測出葡萄酒中含有29種單體酚類物質。一些單體酚類物質已經(jīng)被報道具有一定的功能活性[5]。如兒茶素具有抗氧化、抗炎的功能[6]、槲皮素具有抗氧化、抗增殖、抗炎、保肝等作用[7]、山奈酚具有心臟保護、神經(jīng)保護、抗炎、抗糖尿病、抗氧化、抗菌、抗腫瘤和抗癌等活性[8]。由于葡萄酒中多酚類物質的種類和含量受到葡萄原料及釀造工藝、產(chǎn)區(qū)經(jīng)緯度的影響[9],因此,相當一部分葡萄酒中的多酚類物質帶有產(chǎn)區(qū)特征。新疆葡萄酒是我國葡萄酒中不可或缺的一部分,為了分析其產(chǎn)區(qū)特點,本課題前期對其進行檢測發(fā)現(xiàn)水楊酸、芥子酸、橙皮苷、表兒茶素沒食子酸酯在新疆葡萄酒中含量較高[10]。研究表明橙皮苷具有抗氧化、抗炎和預防內質網(wǎng)應激和DNA損傷的作用[11]。水楊酸、芥子酸具有一定的抗氧化活性[10],其他生物活性尚未報道。表兒茶素沒食子酸酯是兒茶素中的一種單體,目前報道較多是表沒食子兒茶素沒食子酸酯,而關于表兒茶素沒食子酸酯功效的報道較少[12-13]。

細胞自噬是指由自噬相關基因介導,在細胞內形成一種雙層膜結構包裹待降解物,并將其運送到溶酶體通過膜融合形成自噬溶酶體,由自噬溶酶體中的一系列水解酶消化包裹待降解底物,以此來支持細胞自身代謝和某些細胞器更新的過程[14]。此過程高度保守,細胞自噬的異常與多種疾病發(fā)生發(fā)展密切相關[15]。如自噬可以通過調節(jié)脂肪生成、脂肪分解、蛋白聚集體和RNA降解,參與神經(jīng)退行性疾病、代謝性疾病、心血管疾病、癌癥等疾病的發(fā)生、發(fā)展[16]。同時自噬在一些肝臟疾病[如病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性肝病、急性肝損傷、與α1-抗胰蛋白酶(α-1-antitryp sin,AT)缺乏相關的肝病、肝纖維化]中也具有一定的保護作用[17-18]。因此,自噬常被應用于分析物質活性功能以及調節(jié)細胞自噬的藥物篩選[19-20]。

本研究利用LO2細胞,基于細胞自噬的活性變化分析了新疆葡萄酒中水楊酸、芥子酸、橙皮苷、表兒茶素沒食子酸酯4種單體酚類物質對人源正常肝細胞的影響,為具有肝臟保護性的天然來源的功能物質篩選、葡萄酒加工工藝提升、葡萄酒品質提高以及葡萄酒相關產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)和新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橙皮苷、表兒茶素沒食子酸酯、芥子酸,水楊酸,上海源葉生物科技有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)基(roswell park memorial institute 1640,RPMI-1640),美國Gibco公司;EBSS培養(yǎng)基(Earle′s balanced salts, EBSS),0.25%胰蛋白酶,美國Sigma-Aldrich公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒,北京索萊寶科技有限公司;胎牛血清、鏈霉素、青霉素,美國Hyclone公司;CCK-8溶液(cell counting Kit-8, CCK-8),日本Dojindo Molecular Technologies公司;磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)、聚偏氟乙烯 [poly(vinylidene fluoride),PVDF]膜、TBST清洗液(TBS-T buffer, TBST)、4′,6-二脒基-2苯(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)、微管相關蛋白1A/1B-輕鏈3(microtubule-associated proteins 1A/1B light chain3,LC3),美國Sigma-Aldrich公司;螯合體1(sequestosome 1, P62),日本Medical&Biological Laboratories公司;GAPDH,美國Cell Signaling Technology公司;Eastep?Super總RNA提取試劑盒、GoScriptTMReverse Transcription System,上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司。

1.2 儀器與設備

YXQ-50G立式滅菌鍋,上海博迅生物儀器股份有限公司;Spectra Max?i D3多功能酶標儀,美國Molecular Devices公司;LEGEND Micro 21R微量臺式離心機,美國賽默飛公司;Chenmi Scope 6200 Touch化學發(fā)光成像系統(tǒng),上海勤翔科學儀器有限公司;THUNDER Imager 3顯微成像系統(tǒng),德國Leica公司;Applied Biosystems 7500型定量PCR儀,美國應用生物系統(tǒng)公司;DxFLEX流式細胞儀,美國貝克曼庫爾特公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

LO2細胞采用高糖RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng),并添加質量分數(shù)10%的胎牛血清,100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素,培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。當細胞生長至85%融合度左右時,使用質量分數(shù)0.25%胰蛋白酶消化后傳代。

1.3.2 細胞存活率試驗

接種2.0×104/孔LO2細胞于96孔板中,培養(yǎng)24 h后,用不同酚類物質處理24 h后,進行細胞增殖試驗檢測細胞增殖能力,加入CCK-8溶液10 μL/孔,孵育2 h,酶標儀測定450 nm處吸光度值,計算各組細胞的存活率。

1.3.3 實時熒光定量分析

以1.6×105/孔的接種量接種LO2細胞于6孔板中,培養(yǎng)24 h后,分為營養(yǎng)(nutrition)和饑餓(starvation)處理組。營養(yǎng)處理組分別為：濃度為0、100 μmol/L橙皮苷(hesperidin, HDN)+完全培養(yǎng)基(RPMI-1640培養(yǎng)基),濃度為0、50 μmol/L表兒茶素沒食子酸酯[(-)-epicatechin gallate, ECG]+完全培養(yǎng)基,分別處理LO2細胞24 h,橙皮苷用N0、N100-HDN表示,表兒茶素沒食子酸酯用N0、N50-ECG表示;饑餓處理組為：濃度為0、100 μmol/L橙皮苷+完全培養(yǎng)基,濃度為0、50 μmol/L表兒茶素沒食子酸酯+完全培養(yǎng)基處理LO2細胞22 h后,濃度為0、100 μmol/L橙皮苷+饑餓培養(yǎng)基(EBSS),濃度為0、50 μmol/L表兒茶素沒食子酸酯+饑餓培養(yǎng)基,分別處理LO2細胞2 h,橙皮苷用S0、S100-HDN表示,表兒茶素沒食子酸酯用S0、S50-ECG表示(實驗分組同免疫熒光、流式細胞分析)。用Eastep?Super總RNA提取試劑盒提取LO2細胞總RNA。使用GoScriptTMReverse Transcription System將樣品中總RNA轉換為互補DNA(cDNA)。用特定的引物擴增目的基因,引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成(表1)。定量分析采用AceQ?qPCR SYBR Green Master Mix和7500實時聚合酶鏈式反應系統(tǒng)進行實時定量聚合酶鏈式反應。以人GAPDH作為內參基因,通過(2-ΔΔCt)法計算各組樣品中目的基因的mRNA的相對表達量。

表1 實時熒光定量分析中使用的引物序列Table 1 Primer sequence used in real-time fluorescence quantitative analysis

1.3.4 蛋白印跡分析

以1.6×105/孔接種LO2細胞于6孔板中,不同酚類物質處理22 h,饑餓處理2 h后,預冷PBS清洗3次,用含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液裂解LO2細胞,4 ℃,12 000×g離心15 min,取上清液,使用BCA蛋白質測定試劑盒測定蛋白質濃度。加入5×樣品緩沖液混勻。98 ℃加熱10 min后,進行SDS-PAGE。電泳結束后將蛋白質轉移到PVDF上,使用封閉緩沖液中室溫封閉1 h后,4 ℃下分別與抗兔LC3一抗孵育過夜。TBS清洗液(TBS-T buffer, TBST)清洗3次,每次10 min,再用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗孵育40 min后,TBST清洗3次,每次10 min,最后,進行顯色和拍照,并用Image J軟件進行定量分析和比較。

1.3.5 免疫熒光分析

以1.6×105/孔接種LO2及穩(wěn)定表達GFP-LC3-RFP-LC3的LO2細胞于6孔板中,表兒茶素沒食子酸酯、橙皮苷處理22 h,饑餓處理2 h后,PBS洗2次,4%多聚甲醛室溫固定15 min,PBS洗3次,含有0.5% Triton X-100的PBS室溫透膜20 min,含有1% BSA的PBS室溫封閉1 h,PBS洗3次,用含有DAPI的抗熒光淬滅劑封片,熒光顯微鏡下觀察LC3的表達強度及定位。

1.3.6 流式細胞分析

以1.6×105/孔接種穩(wěn)定表達GFP-LC3-RFP-LC3的LO2細胞于6孔板中,培養(yǎng)24 h后,表兒茶素沒食子酸酯、橙皮苷處理24 h后饑餓處理2 h,PBS清洗3次,200 μL胰酶/well消化3 min,加入1 mL帶有血清的1640培養(yǎng)基中和,冰PBS清洗2次,加入200 μL冰PBS輕輕重懸細胞,每組計數(shù)5 000個細胞,進行測樣。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用SPSS 20分析處理數(shù)據(jù),所有實驗數(shù)據(jù)均為3次平行試驗的平均值,用平均值±標準誤表示,進行單因素方差分析(ANOVA),P<0.05時差異顯著,具有統(tǒng)計學意義;圖表由Origin 2021 Pro、Kaluza Analysis 2.1繪制。

2 結果與分析

2.1 不同酚類化合物對LO2細胞存活率的影響

為探究不同酚類物質對LO2細胞的影響作用,分別將不同濃度的表兒茶素沒食子酸酯0、25、50、100 μmol/L、橙皮苷0、50、100、200 μmol/L、芥子酸0、25、50、100 μmol/L、水楊酸0、25、50、100 μmol/L作用于LO2細胞,24 h后測定細胞增殖活性,結果如圖1所示。與對照組相比,表兒茶素沒食子酸酯作用LO2細胞后,隨著濃度的升高,細胞存活率顯著降低(P<0.01);橙皮苷作用LO2細胞后,在50、100 μmol/L,細胞存活率顯著升高(P<0.05),在200 μmol/L時,細胞存活率顯著降低(P<0.01);芥子酸作用LO2細胞后,細胞存活率呈增長趨勢,在25、50 μmol/L時,差異具有顯著性(P>0.05);水楊酸作用LO2細胞后,細胞存活率呈增長趨勢,在50 μmol/L,細胞存活率顯著升高(P>0.05)。綜上所述,根據(jù)上述酚類物質對LO2細胞存活率的影響,橙皮苷、芥子酸、水楊酸選取50、100 μmol/L,表兒茶素沒食子酸酯選取25、50 μmol/L,進行后續(xù)實驗。

a-表兒茶素沒食子酸酯;b-橙皮苷;c-芥子酸;d-水楊酸圖1 不同濃度酚類物質對細胞活力的影響

2.2 不同酚類化合物對LC3蛋白表達的影響

LC3蛋白是目前廣泛使用的觀察和評價細胞自噬活性的標志性蛋白[21]。在自噬小體雙層膜的形成過程中,細胞質中的LC3-I通過2個連續(xù)的泛素化反應與磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine,PE)結合,轉變?yōu)長C3-Ⅱ。在自噬小體與溶酶體融合的過程中,自噬小體內的LC3-Ⅱ也被溶酶體蛋白酶降解。因此細胞內LC3-Ⅱ的動態(tài)水平變化與自噬活性密切相關[22]。免疫印跡是監(jiān)測LC3變化的基礎方法[23]。

本研究用酚類物質分別處理LO2細胞24 h后,通過免疫印跡法檢測LO2細胞中LC3蛋白表達情況。結果如圖2所示。在營養(yǎng)與饑餓條件下,與對照組相比,表兒茶素沒食子酸酯作用細胞后LC3蛋白水平顯著升高(P<0.05),分別升高了10.2%～32%、263%～294%;橙皮苷作用細胞后LC3蛋白水平顯著升高(P<0.05),分別升高了5.8%～105%、80.5%;芥子酸處理細胞后,細胞中LC3蛋白水平顯著升高(P<0.05),分別升高了19%～30%、93.5%～102%,但在營養(yǎng)和饑餓條件,細胞中LC3蛋白水平有隨著芥子酸濃度升高而降低的趨勢;水楊酸處理細胞后,細胞中LC3蛋白水平LC3蛋白水平顯著升高(P<0.05),分別升高了27.9%～51%、15.9%～21.6%,但在營養(yǎng)和饑餓條件,細胞中LC3蛋白水平有隨著水楊酸濃度升高而降低的趨勢。綜上所述,表兒茶素沒食子酸酯和橙皮苷作用細胞后,LC3蛋白水平差異較為明顯,對細胞自噬的影響較為顯著,提示表兒茶素沒食子酸酯和橙皮苷對細胞自噬可能具有一定的促進作用,因此,選取表兒茶素沒食子酸酯、橙皮苷進行后續(xù)的試驗。

a-表兒茶素沒食子酸酯;b-表兒茶素沒食子酸酯LC3/GAPDH;c-橙皮苷;d-橙皮苷LC3/GAPDH;e-芥子酸;f-芥子酸LC3/GAPDH;g-水楊酸;h-水楊酸LC3/GAPDH圖2 不同濃度酚類物質對LC3蛋白表達的影響

2.3 不同酚類物質對LC3、P62蛋白mRNA水平的影響

目前免疫印跡對于LC3蛋白的檢測并不總能檢測到LC3-I蛋白,因此LC3蛋白基因的表達結合蛋白質含量分析是非常必要的[24-25]。除了自噬標志蛋白LC3,P62蛋白(SQSTM1/Sekeestome 1)也常被用來觀察細胞自噬的活性,當細胞自噬被激活時,P62蛋白表達水平顯著降低,提示自噬通量的增加[26]。

本研究為了進一步探索表兒茶素沒食子酸酯、橙皮苷對細胞自噬的影響,檢測了表兒茶素沒食子酸酯、橙皮苷對自噬相關蛋白LC3和P62蛋白mRNA相對表達水平的影響。結果如圖3所示,經(jīng)表兒茶素沒食子酸酯、橙皮苷處理后,營養(yǎng)條件和饑餓條件下的LC3蛋白mRNA表達水平都隨著表兒茶素沒食子酸酯、橙皮苷濃度的增加而顯著升高(P<0.05),同時,P62蛋白表達水平都隨著表兒茶素沒食子酸酯、橙皮苷濃度的增加而顯著降低(P<0.05)。與免疫印跡結果較為一致。說明表兒茶素沒食子酸酯、橙皮苷一定程度上能促進肝細胞自噬。

a-表兒茶素沒食子酸酯LC3 mRNA表達水平;b-表兒茶素沒食子酸酯P62 mRNA表達水平;c-橙皮苷LC3 mRNA表達水平;d-橙皮苷P62 mRNA表達水平圖3 表兒茶素沒食子酸酯、橙皮苷對LC3、P62蛋白mRNA水平的影響

2.4 不同酚類物質對綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)-LC3、紅色熒光蛋白(red fluorescent protein, RFP)-LC3表達的影響

LC3是一種自噬體膜蛋白,在自噬發(fā)生時部分LC3被轉運到自噬溶酶體內,隨著自噬的進行,自噬溶酶體內的LC3蛋白會被降解,提示自噬過程的完成[27]。因此,本研究制備了GFP和RFP共同標記的LC3,GFP蛋白對溶酶體酸性環(huán)境敏感,易隨著LC3被迅速降解掉;而RFP蛋白則難以被溶酶體降解。因此觀察GFP與RFP熒光比值變化,能夠精確評估自噬通量的強弱。當自噬被激活時,可以觀察到的GFP-LC3和RFP-LC3熒光強度增強,GFP/RFP熒光強度比值降低[20,28]。

為進一步驗證表兒茶素沒食子酸酯、橙皮苷對細胞自噬的調控作用,使用表兒茶素沒食子酸酯、橙皮苷處理穩(wěn)定表達GFP-LC3-RFP-LC3的LO2細胞24 h后,固定細胞,利用激光共聚焦顯微鏡觀察GFP-LC3、RFP-LC3細胞亞定位,并利用流式細胞儀檢測紅綠熒光強度。結果如圖4-a、圖4-b所示,與對照組比較,表兒茶素沒食子酸酯、橙皮苷處理細胞后,GFP-LC3和RFP-LC3熒光強度增強,LC3蛋白被招募至自噬體表面,細胞內形成大量自噬體。流式細胞術檢測各組細胞中GFP和RFP的熒光強度,結果如圖5所示,表兒茶素沒食子酸酯、橙皮苷處理LO2細胞24 h后,GFP/RFP比值減小,提示GFP與其標記的LC3被自噬溶酶體降解,而RFP未被顯著降解。綜上所述,表兒茶素沒食子酸酯、橙皮苷具有調控肝細胞自噬活性,誘導細胞自噬發(fā)生、發(fā)展并成熟的生物活性。

a-表兒茶素沒食子酸酯LC3熒光強度;b-橙皮苷LC3熒光強度圖4 免疫熒光分析表兒茶素沒食子酸酯、橙皮苷對LC3蛋白表達水平的影響

3 討論

肝臟是體內代謝和解毒內源、外源物質的重要功能的器官[29]。肝臟對血漿和飲食成分變化非常敏感,具有強大的自噬活性,能在各種應激條件下被激活[30,17],自噬被認為是各種壓力條件下利于生存的一種機制[31]。動物實驗表明橙皮苷能通過增加LC3-Ⅱ蛋白表達水平,降低P62蛋白表達水平,提高自噬活性,以此緩解缺氧狀態(tài)下造成的大鼠肝臟損傷[32]。本研究進一步利用人源的正常肝細胞,在細胞水平觀察橙皮苷是否可調控人源肝細胞的自噬活性。結果發(fā)現(xiàn),橙皮苷也可上調人源肝細胞的自噬活性。因細胞自噬的激活還受到自噬相關蛋白1抗體(unc-51-like kinase 1, ULK1)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTORC1)、AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)等上游信號通路的調節(jié)[33]。因此,橙皮苷的具體作用機制還需要進一步深入研究。除橙皮苷外,表兒茶素沒食子酸酯的LC3、P62蛋白也有相似的變化,因此,推測表兒茶素沒食子酸酯或具有保肝活性,或可開發(fā)為一種輔助緩解肝臟損傷的藥物,但防治肝損傷的機制涉及多個方面[34],目前關于表兒茶素沒食子酸酯對肝臟和自噬的影響還沒有較多的報道,后期可繼續(xù)開展動物和細胞實驗。本研究的免疫印跡結果顯示,在營養(yǎng)和饑餓條件下,與對照組相比,當芥子酸和水楊酸的濃度為50 μmol/L時,LO2細胞中LC3蛋白水平顯著升高;與50 μmol/L相比,當芥子酸和水楊酸的濃度達到100 μmol/L時,細胞中LC3蛋白水平有降低的趨勢,因此推測,高濃度的芥子酸和水楊酸一定程度降低細胞自噬活性,具體機理還需進一步研究。

4 結論

本研究利用不同濃度的酚類物質處理細胞,通過免疫印跡初步分析了新疆葡萄酒中酚類物質對細胞自噬的影響,結果顯示橙皮苷、表兒茶素沒食子酸酯作用細胞后LC3蛋白水平顯著升高。實時熒光定量分析橙皮苷、表兒茶素沒食子酸酯對細胞自噬的影響作用結果顯示,橙皮苷、表兒茶素沒食子酸酯上調了LO2細胞LC3蛋白mRNA的表達水平,下調了P62蛋白mRNA表達水平;細胞免疫熒光結果顯示GFP-LC3和RFP-LC3熒光強度增加,提示細胞內形成大量自噬體;流式細胞術結果顯示GFP-LC3/RFP-LC3熒光強度比值降低,表明有成熟自噬體生成。綜上所述,表兒茶素沒食子酸酯、橙皮苷可一定程度上調LO2細胞自噬活性,可為其相關產(chǎn)品開發(fā)提供一定的理論依據(jù),為葡萄酒品質的提高提供新思路。