李宏洋,張通化,羅麗蓉,李升

1(貴州大學 生命科學學院,貴州 貴陽,550025)2(貴州大學 農(nóng)業(yè)生物工程研究院,貴州 貴陽,550025)

泡椒是我國一種傳統(tǒng)的發(fā)酵食品,由于其獨特的風味和營養(yǎng)益生作用而深受人們的喜愛[1]。泡椒口感辛辣中帶酸,具有增進食欲、促進血液循環(huán)、調(diào)理腸胃和促進消化等作用。泡椒的辣味和酸味是其最基本的味道,同時也是泡椒特有的風味之一,辣味和酸味相互作用,形成了獨特的口感和滋味[2]。乳酸菌是發(fā)酵辣椒的主要菌群,發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乳酸和乙酸貢獻了泡椒的主要酸味[3],并降低食物基質(zhì)的pH值,從而創(chuàng)造出一種抑制腐敗菌和致病菌生長的環(huán)境,這種作用有助于延長食品的保質(zhì)期并提高其安全性。辣椒素是引起辣椒辛辣的主要成分,屬于香草類化合物家族中的一種極度辛辣的生物堿,化學式為C18H27NO3[4-5]。由于強烈的刺激性和生物活性,辣椒素具有廣泛抗菌作用[6],可以有效地抑制如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌和霉菌等多種病原微生物的生長代謝[7-8],當辣椒素濃度超過一定質(zhì)量濃度(0.133 g/L)時,也會對乳酸菌細胞產(chǎn)生傷害作用[9]。研究表明,不同品種的辣椒對發(fā)酵辣椒制品的品質(zhì)及風味具有較大影響[10],不同批次的泡椒質(zhì)量與風味不同,品質(zhì)不穩(wěn)定[11],這可能與辣椒的辣度以及自然發(fā)酵過程參與的菌株種類有關。篩選出耐受辣椒素的乳酸菌,作為強化發(fā)酵候選菌株應用于泡椒工業(yè)生產(chǎn),取代傳統(tǒng)自然發(fā)酵,可為更好利用辣椒和乳酸菌資源提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗菌株來自于四川綿陽市和德陽廣漢市農(nóng)家自制泡椒鹵水,年限分別為6年和5年;商用菌株CICC 6239購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;MRS肉湯及瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基,杭州百思生物技術有限公司;CaCO3、NaCl、NaOH,國藥集團化學試劑有限公司;辣椒素標準品,索萊寶科技有限公司;乳酸菌成套生化鑒定管,上海撫生實業(yè)有限公司;細菌基因組DNA 提取試劑盒、RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、革蘭氏染色液,塞維爾生物科技有限公司。

辣椒素母液制備：用無水乙醇溶解配制30 g/L的辣椒素母液溶液,0.22 μm濾器過濾除菌,4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與設備

辣度快速檢測儀,北京盈盛恒泰科技有限責任公司;恒溫水平搖床,塞維爾生物科技有限公司;酶標儀、高速冷凍離心機、全自動高壓滅菌鍋,美國 Thermo公司;便攜式電導率儀,上海雷磁儀器廠;S-3400 N掃描電子顯微鏡;HITACHI(日立)公司;PCR儀、熒光定量PCR儀,美國伯樂。

1.3 試驗方法

1.3.1 泡椒汁的辣度測定

參照GB/T 21266—2007中辣椒素類物質(zhì)總量計算方法,測定的泡椒汁的斯科維爾指數(shù)并換算其辣椒素含量。

1.3.2 菌株的分離純化

將1 mL泡椒老鹵水用生理鹽水倍比稀釋后取100 μL樣液涂布至含0.7 g/L辣椒素、15 g/L CaCO3的MRS瓊脂平板上,37 ℃培養(yǎng) 48 h,根據(jù)溶鈣圈和形態(tài)特征挑選菌落并進行革蘭染色和過氧化氫酶試驗。

1.3.3 耐受辣椒素菌株的篩選

高濃度辣椒素極易從培養(yǎng)基析出,且溶劑乙醇體積分數(shù)較高會抑制菌株的生長,因此根據(jù)菌株在較低濃度辣椒素脅迫下的相對生長率進行篩選。將1.3.2節(jié)保存的菌株活化2代后,用生理鹽水稀釋至1.0×108CFU/mL制成菌懸液(下同)。根據(jù)辣椒素對乳酸菌的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)為0.133 g/L,將Y-6的菌懸液以1%比例接種到0.2 g/L辣椒素MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃, 160 r/min搖床培養(yǎng),測定0和24 h的OD600nm值,空白培養(yǎng)基作為對照組,將生長狀況好的菌株在0.3、0.4和0.5 g/L辣椒素MRS培養(yǎng)基中復篩,3次重復試驗。通過公式(1)計算相對生長率。

(1)

式中：R,相對生長率,%;a和b為無辣椒素培養(yǎng)基中24和0 h的OD600nm值;c和d為加有辣椒素培養(yǎng)基中24和0 h的OD600nm值。

1.3.4 菌種鑒定

使用pH計和GB 12456—2021 中的酸堿滴定法每2 h測定菌株pH和酸度變化;生理生化鑒定：乳酸菌成套生化鑒定管;16S rDNA 序列分析：提取菌株的基因組DNA[12],以27 F和1492 R為引物進行PCR擴增,PCR產(chǎn)物送上海生工測序,MEGA 7.0 繪制系統(tǒng)進化樹,確定菌株種屬。

1.3.5 辣椒素對乳酸菌的生長抑制作用

將Y-6菌懸液以1%接種量接入0.5、0.6、0.7、0.8和0.9 g/L辣椒素MRS培養(yǎng)基中,37 ℃,160 r/min培養(yǎng)24 h,測定其OD600 nm值,以未接菌培養(yǎng)基為空白對照,抑菌率按式(2)計算,并用GraphPad Prism 9軟件計算辣椒素的 IC50值,3次重復。

(2)

式中：OD對照,空白處理組OD600nm值;OD處理,辣椒素處理組OD600nm值。

1.3.6 辣椒素對乳酸菌細胞膜通透性的影響

將Y-6菌懸液以1%的比例接入MRS液體培養(yǎng)基中,160 r/min,37 ℃振蕩培養(yǎng)至菌濃度達到1.0×108CFU/mL時,加入辣椒素使其終濃度為IC50值。取3 mL菌液4 000 r/min離心10 min吸取上清液,分別測定0、1、2、3、4 和5 h上清液的電導率;測量0、2、4、6、8和10 h上清液OD260nm與OD280nm值[13],商用菌株6239為對照,無菌水為空白對照。

1.3.7 掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)分析

將Y-6懸液以1%的比例分別接入空白培養(yǎng)基和0.57 g/L辣椒素MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃,160 r/min培養(yǎng)12 h,5 000 r/min離心10 min,棄上清液,沉淀用磷酸鹽緩沖液洗滌2次后用2.5%的戊二醛4 ℃固定過夜。0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌樣品3次后使用30%、50%、70%、90%、100%(體積分數(shù))乙醇溶液依次進行梯度脫水處理,最后將所有樣品放在真空蒸發(fā)器中。鍍一層金屬膜,使用S-3400 N掃描電鏡觀察菌體細胞的變化,以商用菌株6239為對照。

1.3.8 熒光定量PCR

將Y-6菌懸液以1%的比例接入空白培養(yǎng)基和0.57 g/L辣椒素MRS培養(yǎng)基中,37 ℃,160 r/min培養(yǎng),收集對數(shù)生長期(空白對照組8 h和處理組12 h)的菌體,Trizol法提取細菌總RNA后進行反轉(zhuǎn)錄[14]。以16SrRNA為內(nèi)參基因,檢測通用應激蛋白usp、ABC轉(zhuǎn)運蛋白滲透酶、滲透保護劑轉(zhuǎn)運系統(tǒng)-ATP結合蛋白(opuA)、滲透保護劑轉(zhuǎn)運系統(tǒng)-透性酶蛋白(opuB)和滲透保護劑轉(zhuǎn)運系統(tǒng)-底物結合蛋白(opuC)、乳酸脫氫酶(L-lactate dehydrogenase)：ldh和磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase)：pgk等7個與辣椒素耐受性相關的基因在辣椒素處理前后的表達量變化,每個處理3次重復。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本試驗數(shù)據(jù)以3 次重復的平均值±標準差表示,Excel 2010進行數(shù)據(jù)分析,Graph Pad Prism9.0作圖并計算辣椒素的 IC50值。用IBM SPSS Statistics 26軟件Duncan 法對各數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 耐受辣椒素乳酸菌的篩選

2.1.1 初篩

通過測定泡椒汁的辣椒素含量為(0.685±0.016) g/L,在此基礎之上以0.7 g/L辣椒素濃度對耐受菌株進行初篩,得到30株生長良好、溶鈣圈明顯、革蘭氏染色陽性以及過氧化氫酶測定為陰性的菌株,并分離純化后保存。

2.1.2 復篩

在0.2 g/L辣椒素處理下,30株乳酸菌對辣椒素均有一定的耐受能力,選擇相對生長率在90%以上的8株菌株(表1),進一步復篩(0.3、0.4和0.5 g/L),結果表明菌株Y-6在0.5 g/L辣椒素下的生長率仍在70%以上,其余菌株雖有生長,但其長勢較差(表2)。基于此,我們選擇菌株Y-6為后續(xù)的試驗材料。

表1 乳酸菌在0.2 g/L辣椒素培養(yǎng)基中的生長情況Table 1 The growth of lactobacillus in contained 0.2 g/L capsaicin medium

表2乳酸菌在含有不同辣椒素濃度培養(yǎng)基中的生長情況Table 2 The growth of lactobacillus in contained different concentration capsaicin medium

2.2 耐受辣椒素乳酸菌的鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察

通過形態(tài)學鑒定發(fā)現(xiàn)菌株Y-6的菌落為乳白色,形狀呈凸起,圓形,濕潤、表面光滑細密,不透明但有光澤,無芽孢(圖1-a),革蘭氏染色結果表明,菌株Y-6菌體呈紫色、桿狀(圖1-b)的革蘭氏陽性菌。

a-菌落形態(tài);b-光學顯微鏡下細胞形態(tài)圖1 菌落形態(tài)學特征

2.2.2 生理生化鑒定

對菌株Y-6的產(chǎn)酸測定結果表明,其菌液pH值隨著時間的推移而逐漸降低,酸度增加,在20 h趨于穩(wěn)定,pH值為3.93±0.01,24 h其酸度值達到140 °T(圖2);過氧化氫酶試驗、VP試驗、靛基質(zhì)試驗結果均為陰性,甲基紅(M.R)試驗為陽性;糖酵解試驗結果表明,菌株Y-6可利用七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、甘露醇、水楊苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、乳糖、木糖和阿拉伯糖(表3)。

圖2 菌株Y-6 24 h下的pH和酸度變化

表3 菌株Y-6的生理生化鑒定結果Table 3 Physiological and biochemical identification results of strain Y-6

2.2.3 16S rDNA 序列分析

對菌株Y-6進行16S rDNA 擴增測序并與GenBank 數(shù)據(jù)庫進行 BLAST 同源性序列比對,使用Megalign程序的鄰接法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3),菌株Y-6與植物乳桿菌3596 (登錄號：MT538471.1)的序列以100%的置信度聚在一起,親緣關系最近。

圖3 菌株Y-6和相關菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 耐受辣椒素乳酸菌的耐受性研究

2.3.1 辣椒素對乳酸菌的生長抑制作用

通過對菌株Y-6生長率的測定發(fā)現(xiàn),在0.25 g/L辣椒素處理下,對數(shù)期時間點為8 h,穩(wěn)定期時間點為16 h,作用效果小,與空白對照組一致;在0.5 g/L辣椒素處理下,對數(shù)期時間點為12 h,穩(wěn)定期時間點為28 h。無論是在0.25 還是0.5 g/L辣椒素的脅迫下,并未顯著地降低穩(wěn)定期(32 h)的OD600nm值,而在高濃度(≥1.0 g/L)辣椒素處理下,菌株不生長或生長緩慢,相對生長率僅10%左右(圖4)。

圖4 不同濃度辣椒素對菌株Y-6的生長的影響

對菌株Y-6和6239在不同濃度辣椒素處理下的生長比較發(fā)現(xiàn),在0.1 g/L的辣椒素處理下2株菌的生長無差異性,辣椒素的作用低;隨著辣椒素濃度的升高,菌體受到的抑制程度隨之增加,但相比于6239,菌株Y-6均保持較高的活性(圖5)。

圖5 不同菌株的辣椒素耐受性比較

通過對菌株Y-6進行辣椒素IC50的測定發(fā)現(xiàn),辣椒素質(zhì)量濃度為0.5 g/L時,抑菌率(28.53±0.04)%;在辣椒素質(zhì)量濃度為0.6 g/L時,抑菌效果顯著性升高,抑菌率為(54.38±0.01)%,已超過辣椒素的半抑制濃度;在辣椒素質(zhì)量濃度為0.7 g/L時,抑菌率為(76.42±0.01)%,與0.8 g/L的抑菌率無顯著差異(P<0.05),選擇IC50(0.571 g/L)進行后續(xù)實驗(圖6)。

圖6 菌株Y-6在不同濃度辣椒素處理下24 h的存活率

綜上,高濃度辣椒素可以致死乳酸菌,使其不生長或生長緩慢,低濃度辣椒素增長了菌株的滯后期,且隨濃度的增大抑制效果更明顯;菌株Y-6的IC50為0.571 g/L;相較于菌株6239,Y-6受辣椒素生長抑制作用更低。

2.3.2 辣椒素對乳酸菌細胞膜完整性的影響

相對電導率可反映菌體細胞膜通透性變化,0.57 g/L辣椒素處理下菌株Y-6和6239在0～1 h的胞外電導率呈現(xiàn)出上升的趨勢,1 h均達到最大值,分別為6.36±0.31和7.69±0.008;在2～5 h出現(xiàn)緩慢的下降趨勢,但仍高于空白處理組(圖7);菌株Y-6與6239在2～10 h的OD260nm和OD280nm值均高于空白對照組,結果表明在辣椒素作用下乳酸菌細胞膜的通透性增加,促進了胞內(nèi)核酸和蛋白等內(nèi)容物的釋放,導致電導率、OD260nm和OD280nm值升高;但辣椒素處理下Y-6的胞外電導率均低于6239,且核酸OD260nm值和蛋白OD280nm值在2 h后趨于恒定,比6239所需的時間(4 h)更短,表明菌株Y-6相較于菌株6239對辣椒素能更快適應(圖8)。為進一步研究Y-6對辣椒素的耐受性,通過SEM對菌株Y-6和6239的細胞形態(tài)觀察。未加辣椒素組下的菌株6239和Y-6的細胞形態(tài)完整、輪廓清晰呈桿狀,表面光滑,無顆粒物無膨脹皺縮現(xiàn)象,未見細胞破損,表明細胞膜完整,細胞處于正常狀況;辣椒素處理下菌株6239細胞變形嚴重,失去光澤,細胞出現(xiàn)皺縮和扭曲等形態(tài),發(fā)生粘連,界限模糊,細胞發(fā)生破損,有明顯的損傷;菌株Y-6在辣椒素處理下部分細胞出現(xiàn)和扭曲和皺縮等形態(tài),但仍能保持細胞膜完整(圖9)。

圖7 辣椒素處理下菌株Y-6和6239的電導率

a-菌株Y-6和6239的蛋白泄露;b-菌株Y-6和6239的核酸泄露圖8 辣椒素處理下菌株Y-6和6239的蛋白和核酸泄漏

綜上,辣椒素通過破環(huán)乳酸菌的壁膜結構從而抑制菌體的生長,而Y-6在辣椒素脅迫下可能存在一定的應激反應機制使得其適應環(huán)境,相較于商用菌株6239對辣椒素有更高的耐受性。

2.3.3 乳酸菌對辣椒素的耐受調(diào)節(jié)

選取的7個基因在辣椒素處理下均顯著上調(diào),與空白對照組的表達有顯著性差異(P<0.01),菌株Y-6對辣椒素有一定的耐受性,揭示表明菌株通過提高通用應激蛋白基因usp(3.37±0.04)等熱激蛋白基因的表達應對辣椒素引起的脅迫,保證細胞壁膜的完整性而維持生長;菌株通過自身抑制分裂周期,以求在這種不利條件下存活,所以增加了其生長的滯后期(圖4),通過opuA(4.06±0.05)、opuB(6.39±0.38)和opuC(7.32±0.53)等相容性溶質(zhì)調(diào)控系統(tǒng)基因以及ABC轉(zhuǎn)運蛋白滲透酶基因(23.24±0.43)的表達上調(diào)維持菌體滲透壓的平衡,使其能在辣椒素的環(huán)境中適應耐受;最后通過提高與生長代謝相關的如ldh(3.85±0.05)和pgk(3.49±0.06)等糖酵解相關基因的表達,逐漸恢復自身的生長代謝以耐受較高濃度的辣椒素(圖10)。

圖10 選取基因在對數(shù)生長期受辣椒素誘導表達情況

3 討論與結論

辣椒素是引起辣椒辛辣的主要成分,具有較好的抗菌活性,通過誘導滲透脅迫元件以及膜生物合成和轉(zhuǎn)運體網(wǎng)絡的關鍵基因的表達,抑制核糖體成分和生長相關基因等抑制細菌生長[15],大多數(shù)革蘭氏陰性菌(包括大腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌和變形桿菌)的MIC為0.512 g/L,而對革蘭氏陽性菌(如甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的MIC為0.256 g/L;枯草芽孢桿菌MIC為0.128 g/L[16],測定的泡椒汁辣椒素含量為(0.685±0.016) g/L,可有效地抑制病原菌的生長,是篩選耐受辣椒素乳酸菌的主要來源之一,篩選到的菌株Y-6對辣椒素有一定的耐受性,在0.5 g/L下的生長率仍在70%以上,經(jīng)形態(tài)學觀察、生理生化試驗和16S rDNA 序列分析[17]鑒定為植物乳桿菌。

細胞壁膜是多種抗菌劑的直接作用靶標[18],辣椒素破環(huán)了菌株Y-6和6239細胞膜的完整性,導致其電導率、OD260nm和OD280nm值均升高,細胞出現(xiàn)一定的皺縮變形等。研究表明辣椒素能破壞肽聚糖結構[19],致使病原菌的細胞膜破壞成孔而達到抑菌作用[20]。辣椒素的酚羥基會改變致病菌的疏水性和細胞質(zhì)膜中負表面電荷的減少;導致局部破裂和孔形成,在細胞膜中形成孔,產(chǎn)生結構損傷和抑制作用[21],作為一類生物堿,辣椒素可抑制細菌的外排泵活性[22-23]和增加胞外滲透壓[24]致使細胞膜受損而壞死。菌株Y-6在0.57 g/L辣椒素處理下仍能保持細胞形態(tài)的相對完整,相關研究表明乳酸菌可誘導專門的修復機制適應不良環(huán)境[25],菌株通過上調(diào)表達usp等熱激蛋白相關基因維持細胞膜流動性和蛋白質(zhì)穩(wěn)定,另一方面,調(diào)節(jié)opuA、opuB和opuC等相容性溶質(zhì)調(diào)控系統(tǒng)基因以平衡細胞內(nèi)和細胞外滲透壓之間的差異[26],ABC轉(zhuǎn)運蛋白滲透酶基因的表達上調(diào)可降低藥物對菌株的細胞毒性,提高了菌株的耐受性[27]。辣椒素增長了菌株的滯后期,且濃度越大抑制效果越明顯。0.5 g/L辣椒素下乳酸菌的對數(shù)生長期時間點從8 h延滯到12 h,穩(wěn)定期時間點從16 h延滯到28 h,這是因為菌體可系統(tǒng)調(diào)節(jié)影響菌體細胞的活性和抑制分裂周期以求在不利條件下存活[28],在適應一段時間后(對數(shù)生長期)又提高通過乳酸脫氫酶ldh基因和和磷酸甘油酸激酶基因pgk基因等糖酵解相關的酶活性恢復自身的生長和代謝,最終也能達到最高的生長數(shù)量。

植物乳桿菌Y-6對辣椒素有一定的耐受性,可作為高辣度辣椒的發(fā)酵劑,為發(fā)酵辣椒的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定理論依據(jù)。