劉陽(yáng),王程可苡,楊宇,羅宗洪,常冠紅,王新,張春玲

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西 楊凌,712100)

生活水平的提高和膳食結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變,使得人們更加傾向于將肉類食品作為蛋白質(zhì)攝入源。海產(chǎn)品作為一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來(lái)源,對(duì)于大眾營(yíng)養(yǎng)和健康必不可少。副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是導(dǎo)致海產(chǎn)源食物中毒的最主要致病菌,它可引起海水養(yǎng)殖動(dòng)物間弧菌病的流行和暴發(fā)性死亡,誤食該菌感染的海產(chǎn)品易引發(fā)胃腸炎和敗血癥等疾病[1]。副溶血性弧菌常與海產(chǎn)品中的特定腐敗菌-腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)共存于近岸海水和海產(chǎn)品中。腐敗希瓦氏菌能還原海產(chǎn)動(dòng)物肌肉中的氧化三甲胺并產(chǎn)生H2S氣體,同時(shí)能夠降解蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分,造成海產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的破壞和風(fēng)味品質(zhì)的劣變。副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的污染已造成嚴(yán)峻的食品安全問(wèn)題和極大的經(jīng)濟(jì)耗損[2-3],因此尋找一種高效的方法來(lái)減少或消除食品中的食源性致病菌和腐敗菌對(duì)食品安全和人類健康至關(guān)重要。

常用化學(xué)類殺菌劑雙氧水、臭氧、季氨化合物等在食品加工中的使用會(huì)導(dǎo)致化學(xué)殘留和環(huán)境污染問(wèn)題。常用物理方法有超高壓殺菌、輻照殺菌等,但由于滅菌成本高,應(yīng)用限制多,不適合大規(guī)模使用。微酸性電解水(slightly acidic electrolyzed water, SAEW)作為一種廣譜型的非熱殺菌技術(shù),是通過(guò)電解稀鹽酸和/或氯化鈉溶液產(chǎn)生的具有特殊理化性質(zhì)的水溶液。SAEW已被證明對(duì)多種病原體具有較強(qiáng)的殺菌作用[4-5]。SAEW具有高效廣譜的殺菌效果及綠色環(huán)保的優(yōu)點(diǎn),被認(rèn)為是食品工業(yè)中使用的化學(xué)消毒劑的有效替代品,已被應(yīng)用于水果、蔬菜和肉類等食品中病原菌的殺滅和控制,延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期,并能保持原有的色澤、風(fēng)味及質(zhì)構(gòu)[6-8]。

雖然已證明SAEW在食品行業(yè)應(yīng)用的有效性,但是作為含氯殺菌劑,其在食品中的使用濃度受到嚴(yán)格的監(jiān)管。GB 28234—2020《酸性電解水生成器衛(wèi)生要求》規(guī)定在食品生產(chǎn)加工中SAEW可使用的有效氯濃度(available chlorine concentration, ACC)為40～80 mg/L。另外,含氯消毒劑清洗有機(jī)農(nóng)產(chǎn)品和肉類食品后,水中殘留的ACC規(guī)定不得超過(guò)4 mg/L[9]。因此,低濃度微酸性電解水(low concentration slightly acidic electrolyzed water, LcSAEW)可能是最適合應(yīng)用于食品消毒的選擇。已證明LcSAEW(0～10 mg/L)對(duì)單核細(xì)胞增生性李斯特菌[10]、大腸桿菌O157∶H7[11]有較好的殺滅效果,但該技術(shù)對(duì)海蝦中優(yōu)勢(shì)致病菌-副溶血性弧菌和優(yōu)勢(shì)腐敗菌-腐敗希瓦氏菌的殺滅效果以及作用機(jī)制尚未探究。本研究對(duì)LcSAEW處理純培養(yǎng)及海蝦中副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的殺滅效果進(jìn)行對(duì)比,并通過(guò)生長(zhǎng)曲線、內(nèi)容物滲漏、電導(dǎo)率、膜電位、活性氧(reactive oxygen species, ROS)的測(cè)定以及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察,探究對(duì)兩種細(xì)菌的滅活機(jī)理,為進(jìn)一步研究LcSAEW殺菌機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腐敗希瓦氏菌CHPC 1.1833由上海海洋大學(xué)藍(lán)蔚青教授贈(zèng)送,副溶血性弧菌ATCC 17802由本實(shí)驗(yàn)室保存;ATP試劑盒、Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒、活性氧檢測(cè)試劑盒,上海碧云天生物技術(shù)有限公司;DiBAC4(3),北京索萊寶科技有限公司;LIVE/DEAD BacLight細(xì)菌細(xì)胞活性測(cè)定試劑盒,賽默飛世爾科技有限公司;中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis),購(gòu)買于陜西楊凌海鮮市場(chǎng),每只約20 g。

1.2 儀器與設(shè)備

Harmony-Ⅱ型微酸性電解水生成器,北京睿安德有限公司;PTH 027型余氯測(cè)量計(jì),英國(guó)百達(dá)靈有限公司;FE28-Standard型pH/ORP儀,上海梅特勒-托利多儀器有限公司;Bioscreen C型微生物生長(zhǎng)曲線儀,芬蘭Oy Growth Curves Ab公司;Spark型酶標(biāo)儀,上海帝肯貿(mào)易有限公司;AZ86031型水質(zhì)檢測(cè)儀,中國(guó)臺(tái)灣衡欣科技股份有限公司;PinAAciie 900F型火焰原子吸收光譜儀,美國(guó)Perkin Elmer公司;Nano SEM-450型掃描電子顯微鏡,美國(guó)FEI公司;Leica TCS SP8 X型激光共聚焦顯微鏡,德國(guó)Leica公司;UV2550型紫外可見分光光度計(jì),日本島津儀器有限公司;DH-11L型拍打式均質(zhì)器,寧波洛尚智能科技有限公司。

表1 不同有效氯濃度的低濃度微酸性電解水對(duì)副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的滅活效果Table 1 Inactivation effect of slightly acidic electrolyzed water with different available chlorine concentrations onV.parahaemolyticus and S.putrefaciens

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌懸液與LcSAEW的制備

將副溶血性弧菌(或腐敗希瓦氏菌)凍存液劃線到3% NaCl TSA(或LB)平板上獲得單菌落,挑取單菌落于3% NaCl TSB(或LB)肉湯中37 ℃(或25 ℃)振蕩培養(yǎng)18 h。用0.85%的生理鹽水洗滌(5 000×g,10 min,4 ℃)并調(diào)整菌懸液濃度至108CFU/mL。同時(shí),通過(guò)電解水發(fā)生器電解0.1% NaCl和0.01% HCl溶液制備后稀釋得到低濃度微酸性電解水(LcSAEW),立即測(cè)定其ACC、pH值與氧化還原電位(oxidation-reduction potential, ORP)值。

1.3.2 LcSAEW對(duì)純培養(yǎng)菌懸液的處理

將1 mL菌懸液加入到9 mL不同濃度的LcSAEW中,處理30 s后用0.5% Na2S2O3中和劑終止殺菌。然后用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋, 從適宜梯度中取0.1 mL涂布于硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂平板或鐵瓊脂平板進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。無(wú)菌去離子水處理作為空白對(duì)照。

1.3.3 蝦樣品的接種及LcSAEW對(duì)接種蝦的處理

參照WANG等[12]方法,將蝦沸水浴20 min,滅活蝦體內(nèi)的原生細(xì)菌。待蝦冷卻到室溫(25±2) ℃,將1 mL不同菌懸液分別滴加于蝦的背部和腹部,靜置附著20 min。接種濃度約為7 lgCFU/g。接種后,將蝦放入180 mL LcSAEW(ACC=10 mg/L)中,分別浸泡0.5、1、3、5、10 min。處理結(jié)束后,將蝦轉(zhuǎn)移至中和劑中均質(zhì)2 min,如1.3.2節(jié)所述進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。未處理的接種蝦作為對(duì)照組。

1.3.4 微生物生長(zhǎng)曲線

將不同處理后的副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌菌懸液按照10%接種量添加于3% NaCl TSB和LB肉湯中,培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為37 ℃和25 ℃,用微生物生長(zhǎng)曲線分析儀每隔1 h測(cè)定1次OD600nm值,總運(yùn)行時(shí)長(zhǎng)為24 h。每組3個(gè)平行。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),OD600nm為縱坐標(biāo),繪制微生物生長(zhǎng)曲線。

1.3.5 膜電位測(cè)定

細(xì)菌膜電位的測(cè)定參照FADHEL等[13]方法。在不同處理后的菌懸液中加入1 μmol/L熒光染料DIBAC4(3),黑暗中孵育20 min,使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度,激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為492/515 nm。

1.3.6 電導(dǎo)率的變化

將不同處理后的菌懸液在12 000 r/min條件下離心3 min,收集上清液,然后使用水質(zhì)檢測(cè)儀測(cè)定其電導(dǎo)率。

1.3.7 細(xì)菌胞內(nèi)物質(zhì)滲漏量測(cè)定

將不同處理后的菌懸液在12 000 r/min條件下離心3 min,收集上清液。使用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定OD260nm表示DNA含量。蛋白質(zhì)含量采用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定。K+濃度使用火焰原子吸收光譜儀測(cè)定766.5 nm處的吸光度。

1.3.8 細(xì)胞內(nèi)ROS水平測(cè)定

ROS檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平。在LcSAEW處理前,先將細(xì)菌懸液在12 000 r/min條件下離心3 min,將細(xì)胞懸浮于10 mmol/L DCFH-DA溶液,37 ℃孵育20 min。再用無(wú)菌生理鹽水清洗,去除多余的DCFH-DA。

1.3.9 細(xì)菌內(nèi)ATP含量測(cè)定

將不同處理后的菌懸液在12 000 r/min條件下離心3 min,棄上清液,加裂解液破碎細(xì)菌,離心取上清液,按照ATP檢測(cè)試劑盒說(shuō)明測(cè)定ATP濃度。

1.3.10 掃描電子顯微鏡觀察

將不同處理后的菌懸液于8 000 r/min條件下離心5 min,棄上清液。所得沉淀用2.5%的戊二醛溶液懸浮后固定10 h,用無(wú)菌生理鹽水洗滌3次后,分別用30%、50%、70%、90%、100%乙醇梯度脫水后重懸,取適量樣品滴至導(dǎo)電硅片上,CO2臨界點(diǎn)干燥后固定噴金,在掃描電鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.3.11 激光共聚焦顯微鏡觀察

將不同處理后的菌懸液于8 000 r/min條件下離心5 min,棄上清液后懸浮至無(wú)菌生理鹽水中。向每1 mL細(xì)菌懸液中加入3 μL SYTO 9/PI的2X染料,在黑暗中孵育15 min。滴加5 μL在載玻片上,使用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光并拍照分析。SYTO 9和PI染料的激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)分別為485/540 nm和535/610 nm。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均為3次重復(fù),結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,采用Duncan′s法進(jìn)行顯著性分析,差異顯著水平P<0.05;采用Origin 2022軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 LcSAEW對(duì)純培養(yǎng)副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的殺滅效果

不同ACC的LcSAEW的理化性質(zhì)及對(duì)副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的殺滅情況如表1所示。相比于對(duì)照組,ACC為0.5、1、2 mg/L的SAEW處理后,副溶血性弧菌分別減少了1.93、4.03、5.29 lg CFU/mL,而腐敗希瓦氏菌分別減少了0.59、1.17、2.8 lg CFU/mL。當(dāng)ACC為4、8 mg/L時(shí),副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌相繼被殺滅至未檢出水平,可知LcSAEW對(duì)副溶血性弧菌的殺菌效果更顯著。并且隨著ACC增加,兩種菌的細(xì)菌數(shù)量均顯著下降(P<0.05),說(shuō)明ACC是影響殺菌效果的主要因素。與先前的報(bào)道結(jié)果一致,ACC越高,LcSAEW對(duì)大腸桿菌[11]、沙門氏菌[14]以及銅綠假單胞菌[15]的殺菌活性也越強(qiáng)。

2.2 LcSAEW處理對(duì)蝦表面接種菌的殺菌效果

LcSAEW(ACC=10 mg/L)對(duì)接種了副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的海蝦進(jìn)行不同時(shí)間(0.5、1、3、5、10 min)的處理,結(jié)果如圖1所示。與對(duì)照組相比,殺菌效果隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增強(qiáng)(P<0.05)。當(dāng)處理時(shí)間為10 min時(shí),副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的微生物數(shù)量分別下降了1.6、1.25 lg CFU/g。LcSAEW殺滅含有機(jī)物質(zhì)的食品基質(zhì)中的微生物時(shí),LcSAEW中的有效作用成分在有機(jī)物質(zhì)作用下會(huì)產(chǎn)生損耗[16],故海蝦表面接種菌與純培養(yǎng)細(xì)菌殺滅效果差異較大。

圖1 低濃度微酸性電解水處理對(duì)蝦表面接種的副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的殺滅效果

2.3 LcSAEW處理對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

通過(guò)測(cè)定生長(zhǎng)曲線進(jìn)一步評(píng)估了LcSAEW對(duì)2種菌的抑制作用,結(jié)果如圖2所示。在對(duì)照組(ACC=0 mg/L)中,副溶血性弧菌(圖2-A)與腐敗希瓦氏菌(圖2-B)都經(jīng)過(guò)2 h遲緩期后迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,隨后在13 h和14 h達(dá)到穩(wěn)定期。隨著ACC的增加,兩種菌的遲緩期都明顯延長(zhǎng),并且最終細(xì)菌濃度(OD600nm)都相應(yīng)降低。值得注意的是,在ACC為10 mg/L時(shí)腐敗希瓦氏菌被完全抑制生長(zhǎng),而ACC為6 mg/L時(shí)即可徹底殺滅副溶血性弧菌,與平板計(jì)數(shù)結(jié)果一致。LI等[10]報(bào)道ACC為12 mg/L的LcSAEW可在30 s內(nèi)完全殺滅單核細(xì)胞增多性李斯特菌,說(shuō)明不同的細(xì)菌對(duì)ACC敏感性存在一定差異。

A-副溶血性弧菌;B-腐敗希瓦氏菌圖2 低濃度微酸性電解水處理對(duì)副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌生長(zhǎng)的影響

2.4 LcSAEW處理對(duì)細(xì)胞內(nèi)容物的影響

2.4.1 DNA和蛋白質(zhì)的泄漏

細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏的測(cè)定是細(xì)胞膜完整性損傷的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)[17-18]。如圖3所示,與對(duì)照組相比,副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌經(jīng)LcSAEW處理后細(xì)胞外DNA水平顯著升高(P<0.05),且呈濃度依賴關(guān)系。而細(xì)胞外蛋白水平雖然呈增加趨勢(shì),但只有副溶血性弧菌在ACC為10 mg/L時(shí)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。當(dāng)LcSAEW作用于細(xì)菌時(shí),釋放到細(xì)胞外的蛋白質(zhì)和DNA大分子,可作為膜損傷的主要特征物質(zhì)[17]。蛋白質(zhì)與DNA泄露的變化趨勢(shì)一致,進(jìn)一步驗(yàn)證了LcSAEW對(duì)細(xì)胞膜完整性的破壞。

A-蛋白質(zhì);B-DNA圖3 低濃度微酸性電解水處理對(duì)副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的胞內(nèi)蛋白質(zhì)和DNA滲漏的影響

2.4.2 細(xì)胞內(nèi)K+的滲漏

K+是細(xì)菌內(nèi)最豐富的陽(yáng)離子,參與基本的生命活動(dòng),并調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓和氧化還原電位[19]。鉀通道的激活和鉀離子的泄漏與超極化現(xiàn)象密切相關(guān),K+的泄漏已被用來(lái)監(jiān)測(cè)抗菌劑造成的細(xì)菌膜破壞[20]。如圖4所示,除了腐敗希瓦氏菌在ACC為1、2 mg/L時(shí),經(jīng)LcSAEW處理后2種細(xì)菌的上清液中K+濃度(與對(duì)照組對(duì)比)都具有顯著性差異(P<0.05),與膜電位檢測(cè)結(jié)果完全吻合。細(xì)胞內(nèi)K+的損失會(huì)造成多種代謝途徑受阻,破壞細(xì)胞滲透壓的調(diào)節(jié)和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。

圖4 低濃度微酸性電解水處理對(duì)副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌胞內(nèi)K+滲漏的影響

2.5 LcSAEW處理對(duì)細(xì)菌膜電位和電導(dǎo)率的影響

膜電位指質(zhì)子通量引起的電化學(xué)梯度在細(xì)胞膜上產(chǎn)生的電位差[21],是合成ATP的驅(qū)動(dòng)力之一。本研究用探針DiBAC4(3)檢測(cè)LcSAEW對(duì)副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的膜電位的影響。如圖5-A所示,ACC為6、10 mg/L的LcSAEW處理后2種細(xì)菌的膜電位(與對(duì)照組對(duì)比)都存在顯著性差異(P<0.05)。LcSAEW使2種細(xì)菌的膜電位降低,導(dǎo)致細(xì)胞膜超極化,且呈ACC依賴性。LIU等[22]報(bào)道了SAEW可引起腐敗希瓦氏菌和腐生葡萄球菌的超極化現(xiàn)象,與本研究結(jié)論一致。膜電位發(fā)生超極化可能是由于LcSAEW處理導(dǎo)致了細(xì)胞膜上離子通道的失活和破壞[23],部分帶電離子跨膜運(yùn)輸,使膜內(nèi)外電位差增大,極化狀態(tài)加強(qiáng)[24]。

A-膜電位;B-電導(dǎo)率圖5 低濃度微酸性電解水處理對(duì)副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的膜電位和電導(dǎo)率的影響

細(xì)菌電導(dǎo)率的變化可以反映其細(xì)胞膜通透性的改變,其改變常伴隨著胞內(nèi)小分子物質(zhì)如離子、磷酸鹽等電解質(zhì)的流出[25]。如圖5-B所示,經(jīng)LcSAEW處理后,隨著濃度的增加,副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的電導(dǎo)率相應(yīng)升高,且與對(duì)照組對(duì)比都具有顯著性差異(P<0.05)。根據(jù)膜電位、電導(dǎo)率和胞外K+含量等通透性實(shí)驗(yàn)結(jié)果,都說(shuō)明細(xì)菌膜內(nèi)外出現(xiàn)離子紊亂,標(biāo)志著細(xì)胞膜通透性的增強(qiáng),導(dǎo)致細(xì)胞功能異常。

2.6 LcSAEW處理后細(xì)胞內(nèi)ROS和ATP水平的變化

ROS是細(xì)胞代謝的副產(chǎn)物,過(guò)量累積會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)生物大分子的氧化損傷,從而破壞細(xì)菌結(jié)構(gòu)和功能。如圖6-A所示,隨著ACC的增加,2種細(xì)菌胞內(nèi)ROS的含量都逐漸增加。尤其是當(dāng)ACC為6和10 mg/L時(shí),ROS水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。有研究報(bào)道,SAEW有效地抑制了單增李斯特菌[10]和假單胞菌[26]的抗氧化酶系統(tǒng)的活性。因此,本研究中LcSAEW可能破壞了菌體的抗氧化防御系統(tǒng),導(dǎo)致了ROS的大量產(chǎn)生和積累,從而誘導(dǎo)細(xì)胞膜上多不飽和脂肪酸的過(guò)氧化[27]以及蛋白質(zhì)羰基化。而上述2.4.1節(jié)中,細(xì)胞外蛋白水平?jīng)]有明顯變化,可能是蛋白質(zhì)很快會(huì)與細(xì)菌內(nèi)ROS[28]或LcSAEW中氯物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。

A-ROS;B-ATP圖6 低濃度微酸性電解水處理對(duì)副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌胞內(nèi)ROS和ATP的影響

ATP是微生物可利用能量的基本載體。ATP含量的降低會(huì)影響菌體的生命活動(dòng),抑制其生長(zhǎng)和分裂[29]。本研究中ATP的測(cè)定采用生物發(fā)光法。如圖6-B所示,與對(duì)照組相比,LcSAEW可顯著降低細(xì)胞內(nèi)ATP濃度(P<0.05),且具有ACC濃度依賴性。細(xì)菌內(nèi)ATP的迅速耗盡,可能是因?yàn)長(zhǎng)cSAEW攻擊細(xì)胞膜導(dǎo)致ATP的泄漏;膜電位(質(zhì)子梯度)的消耗引起ATP的合成受阻[27];以及細(xì)胞內(nèi)ATP酶的持續(xù)水解[30]。

2.7 LcSAEW處理對(duì)細(xì)菌超微結(jié)構(gòu)的影響

2.7.1 細(xì)胞形態(tài)變化

為了證實(shí)LcSAEW引起的細(xì)菌損傷,采用掃描電子顯微鏡觀察處理后的菌體形態(tài)(圖7)。對(duì)照組的副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌,均表現(xiàn)出典型的革蘭氏陰性桿菌的結(jié)構(gòu),表面規(guī)則光滑。經(jīng)LcSAEW處理的副溶血性弧菌(圖7-A)表面出現(xiàn)明顯的凹陷及褶皺,且隨著LcSAEW濃度的升高,菌體嚴(yán)重皺縮甚至形成不規(guī)則小孔,導(dǎo)致內(nèi)容物泄漏。而腐敗希瓦氏菌(圖7-B)經(jīng)LcSAEW處理后表面結(jié)構(gòu)無(wú)明顯坍塌,僅在質(zhì)量濃度≥2 mg/L時(shí)出現(xiàn)凹陷和皺縮。結(jié)果表明,LcSAEW對(duì)2種細(xì)菌都具有一定的損傷作用,破壞程度呈濃度依賴性。并且在相同濃度下,副溶血性弧菌較腐敗希瓦氏菌表現(xiàn)出更顯著的結(jié)構(gòu)變化。

A-副溶血性弧菌;B-腐敗希瓦氏菌圖7 低濃度微酸性電解水處理后副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的SEM圖像

2.7.2 細(xì)胞質(zhì)膜完整性

使用混合熒光染料Syto 9和PI進(jìn)行菌體染色,檢測(cè)經(jīng)LcSAEW處理后細(xì)胞質(zhì)膜的通透性變化(圖8)。低分子質(zhì)量(～10 Da)綠色熒光染料Syto 9可以穿透完整和受損的細(xì)胞質(zhì)膜,而高分子質(zhì)量(～668 Da)紅色熒光染料PI只能穿透受損的細(xì)胞質(zhì)膜[31]。對(duì)照組的副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌均顯示Syto 9染料的綠色熒光,說(shuō)明細(xì)胞膜是完整的。而經(jīng)LcSAEW處理的細(xì)菌出現(xiàn)黃色或紅色熒光,且隨著LcSAEW濃度的升高,2種熒光比例增加,表明質(zhì)膜完整性受損。并且在相同濃度下,副溶血性弧菌的黃色或紅色熒光比例明顯高于腐敗希瓦氏菌,表明LcSAEW對(duì)副溶血性弧菌細(xì)胞質(zhì)膜完整性的破壞更強(qiáng)。

A-副溶血性弧菌;B-腐敗希瓦氏菌圖8 低濃度微酸性電解水處理后副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的CLSM圖像

3 結(jié)論

本研究以海蝦中優(yōu)勢(shì)致病菌-副溶血性弧菌和優(yōu)勢(shì)腐敗菌-腐敗希瓦氏菌為研究對(duì)象,探究了LcSAEW對(duì)純培養(yǎng)及海蝦表面接種菌的殺菌效果以及作用機(jī)制。結(jié)果表明,LcSAEW對(duì)2種菌均具有較強(qiáng)的殺滅作用,殺菌效果呈ACC依賴性;并且隨著處理時(shí)間的增長(zhǎng),LcSAEW對(duì)蝦表面接種菌的殺滅效果也增強(qiáng)。LcSAEW殺滅副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌可能的機(jī)制包括：a) LcSAEW破壞細(xì)胞膜完整性,導(dǎo)致膜通透性增加,造成DNA、蛋白質(zhì)、ATP、K+等內(nèi)容物的泄漏,激光共聚焦顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果證實(shí)了LcSAEW對(duì)細(xì)胞外部結(jié)構(gòu)的破壞作用;b) LcSAEW造成細(xì)胞膜超極化現(xiàn)象,細(xì)菌膜電位的改變干擾細(xì)胞正常的代謝活動(dòng),從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。部分離子通道激活導(dǎo)致K+等電解質(zhì)的泄露正是造成細(xì)胞膜超極化的原因之一,而電導(dǎo)率的增加證明了膜內(nèi)外的離子紊亂;c) LcSAEW造成ATP的快速耗盡,抑制細(xì)胞的生命活動(dòng);d) LcSAEW導(dǎo)致了ROS的大量產(chǎn)生和積累,造成細(xì)胞中生物大分子(蛋白質(zhì)和DNA)的氧化損傷,以及細(xì)胞膜上多不飽和脂肪酸和膜蛋白的過(guò)氧化,從而破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能。