胡云簫,吳俊俊,趙北辰2,,王陽,康振*

1(糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無錫,214122) 2(食品合成生物技術(shù)教育部工程研究中心,江南大學(xué)未來食品科學(xué)中心,江蘇 無錫,214122) 3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

透明質(zhì)酸是由葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺通過β-1,3和β-1,4糖苷鍵交替串聯(lián)形成的酸性直鏈黏多糖[1-2],主要存在于人和動(dòng)物的結(jié)締組織以及部分細(xì)菌的莢膜層中,具有保濕、潤滑、抗炎等多種生理功能,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品、化妝品以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

透明質(zhì)酸的獲取方法有組織提取法、化學(xué)合成法、體外酶法和微生物發(fā)酵法。組織提取法、化學(xué)合成法和體外酶法因原材料受限、生產(chǎn)成本高等原因不適于透明質(zhì)酸的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。獸疫鏈球菌是目前工業(yè)上最主要的透明質(zhì)酸生產(chǎn)菌株[3],能夠天然合成高分子質(zhì)量透明質(zhì)酸,同時(shí)具有透明質(zhì)酸發(fā)酵周期短,生產(chǎn)強(qiáng)度大,胞外雜多糖少產(chǎn)物提純簡便等優(yōu)點(diǎn)。然而,獸疫鏈球菌存在遺傳背景不清晰,基因工程改造困難的問題,圍繞其透明質(zhì)酸合成能力的提升主要通過培養(yǎng)條件優(yōu)化策略實(shí)現(xiàn)。PATIL等[4]采用全因子設(shè)計(jì)和中心復(fù)合設(shè)計(jì)的方式優(yōu)化獸疫鏈球菌生產(chǎn)透明質(zhì)酸的培養(yǎng)基配比,搖瓶中最大平均發(fā)酵生產(chǎn)率達(dá)到0.798 g/L。AMADO等[5]首次使用玉米浸泡液作為主要氮源,通過間歇式生物反應(yīng)器發(fā)酵獸疫鏈球菌得到透明質(zhì)酸3.48 g/L。SHUKLA等[6]利用甘蔗糖蜜作為碳源,優(yōu)化溫度、pH和攪拌速率,最終采用獸疫鏈球菌在3.7 L分批補(bǔ)料發(fā)酵罐中生產(chǎn)透明質(zhì)酸3.31 g/L。LAI等[7]以正十二烷和正十六烷作為氧載體,采用獸疫鏈球菌在配備螺旋帶狀葉輪的發(fā)酵罐中發(fā)酵透明質(zhì)酸,產(chǎn)量達(dá)到4.25 g/L。

隨著合成生物學(xué)的發(fā)展,研究人員相繼在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和谷氨酸棒桿菌等模式微生物中引入透明質(zhì)酸代謝途徑實(shí)現(xiàn)透明質(zhì)酸的合成。YU等[8]在大腸桿菌中通過替換稀有密碼子及優(yōu)化輔因子Mg2+質(zhì)量濃度使產(chǎn)量達(dá)到190 mg/L。WOO等[9]通過基因敲除成功調(diào)控大腸桿菌中葡萄糖和半乳糖消耗速率,進(jìn)一步過表達(dá)透明質(zhì)酸前體合成途徑基因在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)利用葡萄糖和半乳糖生產(chǎn)透明質(zhì)酸,產(chǎn)量可達(dá)29.98 mg/L。但利用大腸桿菌生產(chǎn)透明質(zhì)酸,通常存在透明質(zhì)酸產(chǎn)量低及透明質(zhì)酸難以轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外的問題。JIA等[10]在枯草芽孢桿菌中構(gòu)建了人工操縱子組成表達(dá)系統(tǒng),并采取兩階段誘導(dǎo)策略使透明質(zhì)酸搖瓶產(chǎn)量達(dá)到6.8 g/L。但枯草芽孢桿菌胞外多糖成分復(fù)雜,且發(fā)酵后期菌體易破裂,這為透明質(zhì)酸的分離提純帶來了困難。CHENG等[11-12]通過操縱子優(yōu)化、啟動(dòng)子工程、RNA干擾及敲除乳酸脫氫酶基因等策略在5 L發(fā)酵罐發(fā)酵透明質(zhì)酸28.7 g/L。WANG等[13]通過引入水蛭透明質(zhì)酸酶破壞谷氨酸棒桿菌透明質(zhì)酸囊狀層的策略顯著提升透明質(zhì)酸產(chǎn)量,最終在5 L發(fā)酵罐中分批補(bǔ)料發(fā)酵使透明質(zhì)酸產(chǎn)量高達(dá)74.1 g/L。但由谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸,發(fā)酵周期長,轉(zhuǎn)化率低且產(chǎn)物提取工藝不成熟。由此可知,以上工程菌株均難以取代獸疫鏈球菌達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)水平,加強(qiáng)獸疫鏈球菌遺傳背景的解析至關(guān)重要。

獸疫鏈球菌(Streptococcuszooepidemicus)WSH-24可以天然合成透明質(zhì)酸,且其發(fā)酵周期短,發(fā)酵成本低,產(chǎn)物分離提純操作簡便。本文旨在對獸疫鏈球菌WSH-24進(jìn)行全基因組測序及轉(zhuǎn)錄組測序,以解除其基因組信息不清晰的限制。接著分析其代謝途徑,并基于組學(xué)分析結(jié)果,優(yōu)化培養(yǎng)基中氨基酸和維生素含量以提高獸疫鏈球菌WSH-24的透明質(zhì)酸生產(chǎn)能力,為其分子改造及產(chǎn)量提升提供支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

1.1.1 菌株

S.zooepidemicusWSH-24為作者所在試驗(yàn)室保藏菌株。

1.1.2 試劑

蛋白胨、酵母粉,美國OXIOD公司;乳酸標(biāo)準(zhǔn)樣品,深圳西爾曼科技有限公司;氨基酸、牛肉浸粉、酪蛋白胨、腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、煙酰胺、泛酸、吡哆胺、吡哆醛、核黃素、鹽酸硫胺素、L-鳥氨酸、生物素,上海麥克林生化科技有限公司;氰鈷胺素,阿達(dá)瑪斯試劑有限公司;EZ-10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒,生工生物工程(上海)有限公司;其余試劑均為分析純試劑,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

a)THY培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基)(g/L)：牛肉浸粉10.0,蛋白胨20.0,葡萄糖2.0,碳酸氫鈉2.0,酵母提取物2.0,磷酸氫二鈉0.4,氯化鈉2.0;固體培養(yǎng)基另添加瓊脂粉15 g/L。

b)FSB培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基)(g/L)：酪蛋白胨10.0,葡萄糖20.0,MOPs 42.0,氯化鈉1.5,磷酸氫二鉀2.0,酵母浸粉3.5,硫酸鎂0.4;pH 7.0。

c)基礎(chǔ)培養(yǎng)基[14]：葡萄糖20.0 g/L,十二水合磷酸氫二鈉1.5 g/L,磷酸二氫鉀0.5 g/L,七水合硫酸鎂0.5 g/L,腺嘌呤30.0 mg/L,鳥嘌呤30.0 mg/L,尿嘧啶30.0 mg/L,生物素0.1 mg/L,氰鈷胺素0.1 mg/L,煙酰胺2.0 mg/L,泛酸0.8 mg/L,吡哆胺0.8 mg/L,吡哆醛1.0 mg/L,核黃素0.4 mg/L,鹽酸硫胺素0.4 mg/L,L-鳥氨酸100.0 mg/L;pH 7.0。

d)補(bǔ)料培養(yǎng)基：葡萄糖400 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋,日本Hirayama株式會(huì)社;UV2450紫外分光光度計(jì),日本Shimadzu公司;恒溫振蕩培養(yǎng)箱,上海知楚儀器有限公司;葡萄糖-乳酸生物傳感分析儀,深圳西爾曼科技有限公司;pH計(jì),瑞士Mettler-Toledo公司;低溫高速冷凍離心機(jī),美國Beckman公司;1 L、3 L全自動(dòng)發(fā)酵罐,迪必爾上海生物工程有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 全基因組測序及比較基因組分析

全基因組測序：將S.zooepidemicusWSH-24 菌株搖瓶培養(yǎng)到對數(shù)中前期,12 000 r/min、4 ℃條件下離心5分鐘,棄上清液,使用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取基因組,達(dá)到要求的基因組在Hiseq平臺(tái)上進(jìn)行全基因組測序。

用于比較基因組學(xué)分析的菌株及其在NCBI數(shù)據(jù)庫中的基因組登錄號分別為：S.zooepidemicusMGCS 10565(CP001129.1)、S.zooepidemicusATCC 35246(CP002904.1)、S.zooepidemicusH70(FM204884.1)和S.zooepidemicusCY(CP006770.1)。

1.3.2 轉(zhuǎn)錄組測序

將WSH-24菌株搖瓶培養(yǎng)到對數(shù)中前期,12 000 r/min、4 ℃條件下離心5 min,棄上清液,使用液氮速凍菌體并轉(zhuǎn)移至研缽內(nèi)研磨成粉末,用藥匙將粉末轉(zhuǎn)移至1 mL充滿Trizol的離心管中,并在Sangon Biotech(上海)的Illumina HiSeq平臺(tái)上進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.3.3 孔板發(fā)酵

種子液的制備：挑取已活化平板上的單菌落至裝有5 mL液體THY培養(yǎng)基的50 mL離心管中,37 ℃、220 r/min過夜培養(yǎng)8～10 h。

孔板發(fā)酵：以1%(體積分?jǐn)?shù))接種量將種子液接種于裝有1.5 mL液體培養(yǎng)基的24孔板中,37 ℃、350 r/min培養(yǎng)12 h。

1.3.4 發(fā)酵罐發(fā)酵

種子液的制備：同1.3.1節(jié)種子液的制備。

二級種子液的制備：以初始OD600=0.1將種子液接種于裝有25 mL液體THY培養(yǎng)基的250 mL擋板錐形瓶中,37 ℃、220 r/min培養(yǎng)8～9 h。

發(fā)酵罐發(fā)酵：以10%(體積分?jǐn)?shù))接種量將二級種子液接種于發(fā)酵罐中進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵,1 L發(fā)酵罐發(fā)酵罐裝液量為0.6 L,3 L發(fā)酵罐發(fā)酵罐裝液量為1.5 L。37 ℃、初始攪拌300 r/min、初始通氣量3 m3/(m3·min)。使用50%(體積分?jǐn)?shù))氨水自動(dòng)補(bǔ)堿并維持pH值在7.0左右,使用攪拌槳和通氣量控制溶氧在20%左右,當(dāng)初始葡萄糖消耗至10 g/L時(shí),流加補(bǔ)料控制葡萄糖質(zhì)量濃度在10 g/L左右。發(fā)酵過程中定期取樣測定并記錄。

1.3.5 發(fā)酵樣品處理

發(fā)酵結(jié)束后,常溫、8 000 r/min離心10 min,取上清液,加入3倍體積無水乙醇于-20 ℃過夜醇沉,次日4 ℃、8 000 r/min離心,取沉淀常溫晾干乙醇,使用超純水復(fù)溶到所需體積,多次醇沉重復(fù)上述操作。

1.3.6 透明質(zhì)酸含量測定

Bitte-Muir法測定[15-16]。純化后的透明質(zhì)酸溶液稀釋相應(yīng)倍數(shù),取200 μL溶解裝有在1 mL硫酸硼砂溶液(4.77 g四硼酸鈉溶解于500 mL濃硫酸)的比色管中,沸水浴15 min,冷卻后加入50 μL咔唑溶液(1.25 g咔唑溶解于500 mL無水乙醇)顯色,測定OD530的值。并根據(jù)葡萄糖醛酸標(biāo)曲計(jì)算透明質(zhì)酸含量。

葡萄糖醛酸標(biāo)曲：分別配制質(zhì)量濃度為0、10、20、30、40、50 mg/L的葡萄糖醛酸樣品,測定同上。以葡萄糖醛酸樣品濃度為橫坐標(biāo),對應(yīng)OD530值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.7 其他參數(shù)測定

菌體生長情況：發(fā)酵液稀釋相應(yīng)倍數(shù),于600 nm波長下測定菌體濁度。

乳酸含量：取1 mL發(fā)酵液樣品,離心取上清液,稀釋相應(yīng)倍數(shù),經(jīng)過0.22 μm膜過濾后使用葡萄糖-乳酸生物傳感分析儀測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 獸疫鏈球菌WSH-24全基因組測序

獸疫鏈球菌WSH-24是實(shí)驗(yàn)室前期篩選獲得的一株高效透明質(zhì)酸生產(chǎn)菌株,但其基因組信息尚未測定,限制了對該菌株基因組層面的了解及基于基因組信息的相關(guān)研究。為了彌補(bǔ)該菌株基因組信息缺失,應(yīng)用三代測序Hiseq平臺(tái)對獸疫鏈球菌WSH-24進(jìn)行全基因組建庫測序,WSH-24全基因組圖譜如圖1所示。測序結(jié)果表明,WSH-24的完整基因組大小為2 147 053 bp,GC含量為41.75%,共有CDS 1 969個(gè)。將預(yù)測得到的編碼序列與各數(shù)據(jù)庫中的蛋白序列進(jìn)行比對,全部1 969個(gè)基因在NR、COG和KEGG等數(shù)據(jù)庫均比對成功。其中比對成功率最高的數(shù)據(jù)庫為NR數(shù)據(jù)庫,成功比對蛋白1 967個(gè),占基因總數(shù)的99.90%。

2.2 獸疫鏈球菌WSH-24中心代謝途徑分析

中心碳代謝(central carbon metabolism,CCM)主要包括糖酵解途徑(glycolytic pathway,EMP)、磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway,PPP)以及三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle,TCA cycle),為機(jī)體提供能量同時(shí)為其他代謝如氨基酸代謝、維生素代謝、透明質(zhì)酸代謝等提供前體物質(zhì),是機(jī)體的核心代謝路徑[17]。如圖2-a所示,分析全基因組測序結(jié)果,菌株WSH-24具有完整的EMP途徑和PPP途徑,但TCA循環(huán)不完全,根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫報(bào)道僅可比對到琥珀酰輔酶A合成酶(succinyl-CoA synthetase,SCS)。為了進(jìn)一步明確菌株WSH-24的CCM對透明質(zhì)酸代謝的影響,對該菌株進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序。分析轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可知,菌株EMP途徑基因轉(zhuǎn)錄水平最強(qiáng),遠(yuǎn)高于其他代謝途徑。這意味著在該菌株生長過程中,主要通過EMP途徑來獲取能量。此外,該菌株中乳酸脫氫酶基因ldh轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度高,中心代謝溢流[18]嚴(yán)重(圖2-b)。

a-維生素B族代謝途徑基因轉(zhuǎn)錄情況;b-添加維生素B族培養(yǎng)基中菌株生長過程圖2 獸疫鏈球菌WSH-24的中心代謝途徑

2.3 獸疫鏈球菌WSH-24氨基酸代謝途徑解析及優(yōu)化

氨基酸是合成蛋白質(zhì)以及生物分子的重要前體物質(zhì),在為生物體的代謝中起著至關(guān)重要的作用,不僅可以影響菌株生長速度,還可以激活或抑制菌株部分生物合成[19]。獸疫鏈球菌發(fā)酵透明質(zhì)酸的培養(yǎng)基比谷氨酸棒桿菌等代謝工程改造的透明質(zhì)酸生產(chǎn)菌種的培養(yǎng)基復(fù)雜的多,需要添加大量的酵母粉(3.5 g/L)、牛肉浸粉(10.0 g/L)和酪蛋白胨(10.0 g/L),才可以支持透明質(zhì)酸的發(fā)酵和菌體的生長。通過分析獸疫鏈球菌WSH-24的氨基酸合成代謝通路,我們發(fā)現(xiàn)獸疫鏈球菌缺失部分氨基酸的合成代謝途徑基因(表1)。

表1 氨基酸代謝途徑缺失基因Table 1 Missing genes in amino acid metabolic pathways

為驗(yàn)證獸疫鏈球菌WSH-24的氨基酸缺陷型,將其接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,觀察其生長情況。結(jié)果如圖3-a所示,在不添加任何氨基酸的培養(yǎng)基中菌株無法正常生長(CK-);在添加0.5 g/L全部20種氨基酸的培養(yǎng)基中菌株能夠正常生長(CK+);在分別去除纈氨酸(Val)、谷氨酰胺(Gln)、精氨酸(Arg)和色氨酸(Trp)的氨基酸培養(yǎng)基中菌株無法生長。該結(jié)果初步表明Val、Gln、Arg和Trp為菌株WSH-24的必需氨基酸,無法自身合成。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)論,我們對WSH-24菌株分別在不同缺陷型培養(yǎng)基中的生長過程進(jìn)行了分析。如圖3-b所示,在氨基酸缺陷型培養(yǎng)基中,菌株在整個(gè)生長周期均無法正常生長,2 h開始OD600出現(xiàn)下降趨勢,這一結(jié)果證實(shí)了菌株WSH-24為Val、Gln、Arg和Trp 4種氨基酸缺陷型。

a-20種氨基酸缺失對菌株生長的影響;b-分別缺乏Val、Gln、Arg和Trp培養(yǎng)基中菌株生長情況圖3 氨基酸缺陷型確定

結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用1 L發(fā)酵罐分析外源添加4種必需氨基酸對獸疫鏈球菌WSH-24透明質(zhì)酸發(fā)酵情況的影響。如圖4所示,外源添加氨基酸對菌株的生物量無明顯促進(jìn)作用,但可以促進(jìn)透明質(zhì)酸的合成。外源添加Val、Gln、Arg和Trp為1.0 g/L時(shí),透明質(zhì)酸產(chǎn)量最高,可達(dá)到(2.65±0.02) g/L,相比初始野生型菌株產(chǎn)量(2.09±0.02) g/L提高了26.79%。

圖4 氨基酸添加對透明質(zhì)酸發(fā)酵的影響

2.4 獸疫鏈球菌維生素B族合成分析及優(yōu)化

維生素B族是微生物代謝活動(dòng)過程中多種酶的重要輔因子,具有促進(jìn)菌體生長、增強(qiáng)菌體代謝的作用[20]。對維生素B族代謝途徑基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)各代謝途徑相關(guān)基因均具有較低的歸一化單基因表達(dá)豐度(fragments per kilobase million,FPKM)[21],基因轉(zhuǎn)錄水平低(圖5-a)。為了分析維生素B族是否可以促進(jìn)菌體生長及代謝,分別向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中外源添加維生素B1、維生素B2、維生素B5、維生素B6、維生素B7和維生素B12。結(jié)果如圖5-b所示,添加維生素B5、維生素B7和維生素B12的培養(yǎng)基中,菌株OD600值相較未添加任何維生素的對照(CK-)提高明顯,分別提高23.98%、22.41%和21.85%,且與全部添加6種維生素的培養(yǎng)基中菌株生長情況相當(dāng)(CK+)。該結(jié)果表明維生素B5、維生素B7和維生素B12的添加能夠有效促進(jìn)菌體生長。

a-B族維生素代謝途徑基因轉(zhuǎn)錄水平;b-添加B族維生素培養(yǎng)中菌株生長過程圖5 維生素B族缺乏情況確定

結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采取外源添加3種維生素B族的方式分批補(bǔ)料發(fā)酵(1 L發(fā)酵罐),以改善菌株生長,提高透明質(zhì)酸產(chǎn)量。按照1.13基礎(chǔ)培養(yǎng)基中維生素B5、維生素B7和維生素B12的比例進(jìn)行外源添加,分別添加一倍體積維生素B5、維生素B7和維生素B12及2倍體積維生素B5、維生素B7和維生素B12,即維生素B50.8 mg/L、維生素B70.1 mg/L和維生素B120.1 mg/L及維生素B51.6 mg/L、維生素B70.2 mg/L、維生素B120.2 mg/L。結(jié)果如圖6所示,添加3種維生素的培養(yǎng)基中菌株12 h的OD600值均高于對照(未添加維生素),且透明質(zhì)酸產(chǎn)量也均高于對照。當(dāng)外源添加維生素B50.8 mg/L、維生素B70.1 mg/L和維生素B120.1 mg/L時(shí),透明質(zhì)酸產(chǎn)量最高,可達(dá)(2.46±0.07) g/L,相比初始野生型菌株提高了21.33%。

圖6 B族維生素添加對透明質(zhì)酸發(fā)酵的影響

2.5 3 L罐分批補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸

結(jié)合上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取最高透明質(zhì)酸產(chǎn)量對應(yīng)的氨基酸添加量(外源添加氨基酸Val、Gln、Arg和Trp均1.0 g/L)和維生素添加量(外源添加維生素B50.8 mg/L、維生素B70.1 mg/L和維生素B120.1 mg/L),對培養(yǎng)基進(jìn)行組合優(yōu)化,并采用3 L發(fā)酵罐對組合優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果如圖7所示,優(yōu)化培養(yǎng)基中必需氨基酸和B族維生素的供應(yīng)對細(xì)胞的生長有明顯促進(jìn)作用,菌株生長速率和細(xì)胞密度均明顯提升。產(chǎn)物透明質(zhì)酸和副產(chǎn)物乳酸在整個(gè)發(fā)酵過程中均不斷積累。透明質(zhì)酸產(chǎn)量在12 h達(dá)到最高值(5.63 g/L),生產(chǎn)強(qiáng)度為0.31 g/(L·h),相較野生型提升了33.33%。

a-未優(yōu)化菌株3L罐分批補(bǔ)料發(fā)酵情況b-培養(yǎng)基優(yōu)化后菌株3L罐分批補(bǔ)料發(fā)酵情況圖7 3 L罐分批補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸

3 結(jié)論

獸疫鏈球菌是目前工業(yè)上透明質(zhì)酸發(fā)酵生產(chǎn)的主要生產(chǎn)菌株,也是唯一可以生產(chǎn)食品用透明質(zhì)酸原料的菌種。但獸疫鏈球菌對培養(yǎng)基的要求遠(yuǎn)比谷氨酸棒桿菌等菌種高,發(fā)酵培養(yǎng)基中需要添加大量的酵母粉等營養(yǎng)成分。分析其遺傳特征和代謝特征將有望對該菌種的改造奠定基礎(chǔ)。本研究通過對獸疫鏈球菌WSH-24進(jìn)行全基因組測序,發(fā)現(xiàn)了該菌株具有高效的糖酵解和乳酸合成能力以及不完整的三羧酸循環(huán)。此外,結(jié)合組學(xué)分析及生長曲線實(shí)驗(yàn)分析,確定了獸疫鏈球菌WSH-24為纈氨酸、谷氨酰胺、精氨酸和色氨酸4種氨基酸缺陷型,同時(shí)維生素B5、維生素B7和維生素B12的合成基因轉(zhuǎn)錄水平過低不足以維持菌體生長。結(jié)合上述結(jié)果,通過額外添加必需的氨基酸和B族維生素,優(yōu)化培養(yǎng)基組分,最終3 L發(fā)酵罐中透明質(zhì)酸產(chǎn)量可達(dá)5.63 g/L,生產(chǎn)強(qiáng)度可達(dá)0.31 g/(L·h),相較優(yōu)化前提高33.33%。開發(fā)獸疫鏈球菌基因編輯工具,回補(bǔ)部分缺失的氨基酸代謝途徑,有望降低獸疫鏈球菌對豐富培養(yǎng)基培養(yǎng)條件的依賴度。同時(shí),獸疫鏈球菌屬于乳酸菌,其發(fā)酵過程消耗的葡萄糖被大量的轉(zhuǎn)化為乳酸副產(chǎn)物,以乳酸脫氫酶編碼基因ldh作為靶點(diǎn),采用基因編輯系統(tǒng)對其進(jìn)行改造,實(shí)現(xiàn)碳代謝流調(diào)控[22]增加葡萄糖/透明質(zhì)酸轉(zhuǎn)化率,有利于透明質(zhì)酸產(chǎn)量的進(jìn)一步提升。本研究為透明質(zhì)酸的產(chǎn)量提升提供了指導(dǎo),同時(shí)為獸疫鏈球菌的應(yīng)用拓寬提供了支撐。