邢文靜，伏圣青，韓曉捷

天津市藥品檢驗(yàn)研究院，天津 300070

鮭降鈣素是一種骨代謝調(diào)節(jié)藥，能調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞活性，抑制體內(nèi)破骨細(xì)胞，還能改善患者骨吸收，適用于骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)減少引起的骨痛、畸形性骨炎、高血鈣癥和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)不良癥等[1-5]。鮭降鈣素制劑主要有鮭降鈣素注射液、鮭降鈣素鼻用噴霧劑，而鮭降鈣素鼻用噴霧劑比鮭降鈣素注射液更易被患者接受?！吨袊?guó)藥典》2020 年版二部收載了鮭降鈣素、鮭降鈣素注射液和注射用鮭降鈣素的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[6]。在已收載的制劑中有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)下，對(duì)降鈣素C 進(jìn)行了限定，并未對(duì)其他具體雜質(zhì)做出要求。現(xiàn)行版《歐洲藥典》（EP11）[7]、《美國(guó)藥典》（USP43）[8]和《日本藥典》（JP18）[9]收載了鮭降鈣素，并且EP11 中將N-乙酰半胱氨酰鮭降鈣素、9-D-亮氨酸鮭降鈣素、去-22-酪氨酸鮭降鈣素作為已知雜質(zhì)進(jìn)行了控制，明確了其限度。鮭降鈣素作為人工合成多肽類藥物，具有不穩(wěn)定、易降解的特點(diǎn)，需對(duì)鮭降鈣素產(chǎn)品中雜質(zhì)進(jìn)行嚴(yán)格控制[10]。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜-加校正因子的主成分自身對(duì)照法測(cè)定了鮭降鈣素鼻用噴霧劑中雜質(zhì)，方法準(zhǔn)確、可靠、專屬性強(qiáng)，為鮭降鈣素鼻用噴霧劑的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試驗(yàn)

Waters e2695 高效液相色譜儀，配備2489 紫外檢測(cè)器；梅特勒托利多XS205 十萬(wàn)分之一電子天平。

鮭降鈣素對(duì)照品（批號(hào)140665-201804，質(zhì)量分?jǐn)?shù)89.7%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；降鈣素C 對(duì)照品（批號(hào)140808-201802，質(zhì)量分?jǐn)?shù)88.2%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；N-乙酰半胱氨酰鮭降鈣素（雜質(zhì)A，批號(hào)1086210-R06010，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%，USP）；9-D-亮氨酸鮭降鈣素（雜質(zhì)B，批號(hào)4022-001A1，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.8%，TLC）；去-22-酪氨酸鮭降鈣素（雜質(zhì)C，批號(hào)4022-061A1，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.5%，TLC）；鮭降鈣素鼻用噴霧劑樣品來(lái)自瑞士Future Health Pharma GmbH 公司，規(guī)格2 mL∶4 400 IU，批號(hào)分別為DH100102、DH100103、DH 100108；四甲基氫氧化銨25%水溶液（分析純），磷酸（分析純），乙腈（色譜純），超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Macherey-Nagel Nucleosil 100-5 C18AB 色譜柱（250 mm×4.0 mm，5 μm）；以0.04 mol/L 四甲基氫氧化銨溶液（用磷酸調(diào)pH 2.5）–乙腈（9∶1）為流動(dòng)相A，以0.04 mol/L 四甲基氫氧化銨溶液（用磷酸調(diào)pH 2.5）–乙腈（4∶6）為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～30 min，流動(dòng)相A 從72%降至50%；30～35 min，流動(dòng)相A 從50%降至5%；35～45 min，流動(dòng)相A 保持5%；45～49 min，流動(dòng)相A 從5%增加至72%；49～60 min，流動(dòng)相A 保持72%）；檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；體積流量為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為100 μL；柱溫為65 ℃；樣品室溫度：10 ℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品貯備液的制備 精密稱取鮭降鈣素、降鈣素C、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 對(duì)照品各10 mg，分別置20 mL 量瓶中，加流動(dòng)相A 溶解，分別制成0.5 mg/mL 的對(duì)照品貯備液。

2.2.2 雜質(zhì)定位溶液的制備 分別精密量取降鈣素C、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 對(duì)照品貯備液適量，加流動(dòng)相A 稀釋，均制成5 μg/mL 雜質(zhì)定位溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性溶液的制備 分別精密量取鮭降鈣素、降鈣素C、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 對(duì)照品貯備液各1 mL，置同一個(gè)100 mL 量瓶中，加流動(dòng)相A 稀釋至刻度，即得。

2.2.4 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密量取降鈣素C、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 對(duì)照品貯備液各1 mL，置于同一個(gè)100 mL 量瓶中，用流動(dòng)相A 稀釋至刻度，制成含各雜質(zhì)對(duì)照品約5 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.2.5 供試品溶液的制備 精密稱取鮭降鈣素鼻用噴霧劑5 mL，置10 mL 量瓶中，加流動(dòng)相A 稀釋至刻度，即得。

2.2.6 自身對(duì)照溶液 精密量取鮭降鈣素鼻用噴霧劑5 mL，置200 mL 量瓶中，用流動(dòng)相A 稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.7 空白輔料溶液 按鮭降鈣素鼻用噴霧劑的處方稱取各輔料適量，溶解，制備空白輔料溶液。

2.3 專屬性和系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別取空白輔料溶液、降鈣素C、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 雜質(zhì)定位溶液、系統(tǒng)適用性溶液、鮭降鈣素鼻用噴霧劑供試品溶液（批號(hào)DH100102）各100 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示流動(dòng)相A 和空白輔料對(duì)主峰和雜質(zhì)測(cè)定均無(wú)干擾；各成分分離良好，鮭降鈣素主峰與雜質(zhì)A 分離度為4.0，符合要求。降鈣素C、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 相對(duì)保留時(shí)間分別為0.5～0.6、1.15、0.8、0.9。

圖1 空白輔料溶液（A）、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液（B）和鮭降鈣素鼻用噴霧劑（C）HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of pharmaceutical excipients solution (A),system suitability solution (B),and Salmon Calcitonin Nasal Spray (C)

2.3.2 破壞實(shí)驗(yàn) 分別取鮭降鈣素鼻用噴霧劑5 mL，置10 mL 量瓶中，進(jìn)行高溫（60 ℃放置6 h）、強(qiáng)酸（1 mol/L 鹽酸溶液1 mL 放置1 h，中和）、強(qiáng)堿（1 mol/L 氫氧化鈉溶液1 mL 放置10 min，中和）、強(qiáng)光照（4 500 lx 下照射48 h）、強(qiáng)氧化（加入30%雙氧水1 mL 放置1 h）作用后，分別加流動(dòng)相A 稀釋至刻度，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果鮭降鈣素鼻用噴霧在光照、強(qiáng)酸、氧化條件下相對(duì)穩(wěn)定；在高溫條件下，降鈣素C、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 有明顯增加，雜質(zhì)A 略有增加；在強(qiáng)堿條件下，雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 有明顯增加，各主要降解雜質(zhì)之間、雜質(zhì)與主峰之間均能有效分離，且物料平衡，說(shuō)明此方法對(duì)雜質(zhì)能有效分離和檢測(cè)。

2.4 校正因子和線性范圍考察試驗(yàn)

精密量取鮭降鈣素、降鈣素C、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 對(duì)照品貯備液適量，加流動(dòng)相A 分別均稀釋制成0.20、1.25、2.5、3.75、5、6.25、7.50 μg/mL對(duì)照品系列溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算雜質(zhì)的校正因子，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，鮭降鈣素及其雜質(zhì)均在0.20～7.50 μg/mL 線性關(guān)系良好，雜質(zhì)A、B、C的校正因子均超出0.90～1.10，因此有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)下已知雜質(zhì)可按加校正因子的主成分自身對(duì)照法計(jì)算。

表1 線性關(guān)系和校正因子Table 1 Linear relationship and correction factor

2.5 檢測(cè)限和定量限考察

取對(duì)照品貯備液，用流動(dòng)相A 逐步稀釋，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以信噪比為3 時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為檢測(cè)限，以信噪比為10 時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為定量限，結(jié)果鮭降鈣素、降鈣素C、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 的檢測(cè)限分別為25、26、23、29、25 ng，定量限分別為83、51、46、57、82 ng。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取鮭降鈣素鼻用噴霧劑（批號(hào)DH100102），平行6 份，制備自身對(duì)照溶液和供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果降鈣素C、雜質(zhì)A、雜質(zhì)C的平均質(zhì)量濃度分別為0.80%、0.67%、0.17%，RSD值分別為0.9%、1.1%、1.6%。雜質(zhì)B 低于定量限。

2.7 精密度試驗(yàn)

2.7.1 儀器精密度試驗(yàn) 取系統(tǒng)適用性溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算峰面積，結(jié)果鮭降鈣素、降鈣素C、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 峰面積的RSD 值分別為0.6%、0.7%、1.3%、0.9%、0.8%。

2.7.2 中間精密度試驗(yàn) 分別以不同人員（2 人）、不同時(shí)間、不同儀器按2.6 項(xiàng)下方法分析。結(jié)果降鈣素C、雜質(zhì)A、雜質(zhì)C 的平均質(zhì)量濃度的RSD 值分別為1.0%、1.3%、1.5%。雜質(zhì)B 低于定量限。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取系統(tǒng)適用性溶液于10 ℃放置，分別于0、2、4、8、20 h 進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果降鈣素C、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 峰面積的RSD 值分別為0.5%、1.0%、1.3%、0.8%，表明供試品溶液于10 ℃放置時(shí)20 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 回收率試驗(yàn)

精密取鮭降鈣素鼻用噴霧劑（批號(hào)DH100102）5 mL，置10 mL 量瓶中，分為3 組，分別加入混合對(duì)照品溶液80、100、120 μL，加入流動(dòng)相A 至刻度，制成加標(biāo)濃度相當(dāng)于雜質(zhì)限度80%、100%、120%的溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度制備3 份，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果降鈣素C、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 平均回收率分別為98.1%、98.9%、100.5%、99.7%，RSD 值分別為1.6%、1.5%、1.0%、1.1%。

2.10 耐用性試驗(yàn)

考察在流動(dòng)相pH 值±0.2、體積流量變化±0.1 mL/min、柱溫變化±2 ℃、波長(zhǎng)變化±2 nm、流動(dòng)相比例變化±2%的條件下對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果在各條件下系統(tǒng)適用性均符合要求，各已知雜質(zhì)測(cè)定結(jié)果RSD 值均小于10%，未知雜質(zhì)總量測(cè)定結(jié)果的RSD 值小于10%，提示色譜系統(tǒng)參數(shù)耐用性良好。

2.11 樣品測(cè)定

取鮭降鈣素鼻用噴霧劑3 批，分別制備混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和自身對(duì)照溶液，進(jìn)樣測(cè)定，分別按加校正因子的主成分自身對(duì)照法（方法Ⅰ）和主成分外標(biāo)法（方法Ⅱ）計(jì)算有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)量濃度，結(jié)果見(jiàn)表2。參考《歐洲藥典》（EP11）、《美國(guó)藥典》（USP43）中對(duì)已知雜質(zhì)、單個(gè)未知雜質(zhì)和總雜質(zhì)的限度要求，對(duì)3 批鮭降鈣素鼻用噴霧劑樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

表2 鮭降鈣素鼻用噴霧劑中有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果（n=2）Table 2 Determination of related substances in in Salmon Calcitonin Nasal Spray (n=2)

3 討論

根據(jù)現(xiàn)行版《歐洲藥典》（EP11）、《美國(guó)藥典》（USP43）中鮭降鈣素、鮭降鈣素注射液和注射用鮭降鈣素中有關(guān)物質(zhì)檢查的色譜條件，色譜柱均采用C18柱，流動(dòng)相均采用四甲基氫氧化銨溶液–乙腈體系，檢測(cè)波長(zhǎng)均為220 nm，柱溫均為65 ℃。經(jīng)過(guò)色譜條件的篩選和優(yōu)化，調(diào)整流動(dòng)相比例達(dá)到較好的雜質(zhì)分離效果，并排除輔料干擾，同時(shí)分別考察了Vydac C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Macherey-Nagel Nucleosil 100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Macherey-Nagel Nucleosil 100-5 C18AB（250 mm×4.0 mm，5 μm）3 種不同品牌型號(hào)的C18色譜柱，所得圖譜顯示主峰與降鈣素C、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 以及其他相鄰雜質(zhì)的分離度均符合要求，方法適用性較強(qiáng)。

《中國(guó)藥典》2020 年版二部、《歐洲藥典》（EP11）、《美國(guó)藥典》（USP43）中均采用峰面積歸一化法控制鮭降鈣素中有關(guān)物質(zhì)的限量，但由于各雜質(zhì)與主成分的響應(yīng)因子不同，采用峰面積歸一化法測(cè)定雜質(zhì)結(jié)果會(huì)產(chǎn)生誤差。本實(shí)驗(yàn)以鮭降鈣素為對(duì)照，以主成分回歸直線斜率與雜質(zhì)回歸直線斜率的比計(jì)算校正因子，用于校正雜質(zhì)的實(shí)測(cè)峰面積。結(jié)果采用加校正因子的主成分自身對(duì)照法可更準(zhǔn)確地測(cè)定鮭降鈣素鼻用噴霧劑中有關(guān)物質(zhì)。因此，在雜質(zhì)對(duì)照品較難獲得或造價(jià)過(guò)高的情況下，引入校正因子更便捷準(zhǔn)確。

現(xiàn)行版各國(guó)藥典中均規(guī)定鮭降鈣素中有關(guān)物質(zhì)的限量，《歐洲藥典》（EP11）中明確了已知雜質(zhì)的限度，《美國(guó)藥典》（USP43）收錄了鮭降鈣素鼻用制劑，但并未規(guī)定制劑中有關(guān)物質(zhì)限度。本實(shí)驗(yàn)規(guī)定了4 種已知雜質(zhì)，其中雜質(zhì)A、B、C 為鮭降鈣素固相合成中引入的雜質(zhì)，而降鈣素C 為鮭降鈣素鼻用噴霧劑中主要降解雜質(zhì)，降鈣素C 含量變化是表征該制劑穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。

綜上，本研究建立了鮭降鈣素鼻用噴霧劑中有關(guān)物質(zhì)檢查的HPLC 測(cè)定法，測(cè)定了已知雜質(zhì)降鈣素C 和雜質(zhì)A、B、C，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)便、快速，可作為鮭降鈣素鼻用噴霧劑中有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突