康蕾，梁磊，洪關(guān)婷，王一瓊，莘莉瓊，楊勇軍

川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合肛腸科，四川 南充 637000

便秘是常見(jiàn)的胃腸道疾病，主要臨床表現(xiàn)為大便干燥、排便時(shí)間延長(zhǎng)、排便次數(shù)減少[1]，在中醫(yī)學(xué)屬“便秘”范疇。當(dāng)今社會(huì)，隨著社會(huì)人口老齡化、生活習(xí)慣改變、生活壓力增大等各類因素，便秘發(fā)生率呈逐年上升的趨勢(shì)。研究表明，便秘對(duì)多種疾病的發(fā)生也有直接影響，如帕金森病、多種肛周疾病、乳腺疾病、冠心病等。西醫(yī)對(duì)便秘的治療主要以各類瀉劑為主，但療效欠佳，所以結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)及生物信息學(xué)探索更多中藥治療便秘的有效途徑是必要的。

《金匱要略》中首次記載厚樸三物湯，述其由大黃、枳實(shí)、厚樸3 味藥組成，厚樸為君，主氣，大黃為臣主瀉，枳實(shí)為佐藥主滯。該方立于“通”重在“行氣”，具有行氣導(dǎo)滯通便之功[2]。其方中重用厚樸，極大加強(qiáng)了該方行氣的功效。尤善治療實(shí)熱內(nèi)積，氣滯不行，氣滯重于實(shí)積之便秘。根據(jù)現(xiàn)有研究表明，其方中含有蘆薈大黃素、厚樸酚等成分，具有明顯的肌松弛、抗病毒、抗腫瘤、抗炎、抗菌作用[3]，可增強(qiáng)胃腸蠕動(dòng)、改善便秘。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過(guò)各數(shù)據(jù)庫(kù)、運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)技術(shù)構(gòu)建“藥物成分–靶點(diǎn)–信號(hào)通路–疾病”相互作用關(guān)系的方法，在對(duì)分析各類藥物作用發(fā)生機(jī)制的過(guò)程中有著重要意義。分子對(duì)接是一種用于藥物研究的方法，能夠識(shí)別具有治療意義的新化合物，并在分子水平上預(yù)測(cè)配體–靶點(diǎn)相互作用關(guān)系[4]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，篩選及分析厚樸三物湯治療便秘的有效成分及作用靶點(diǎn)，為臨床基礎(chǔ)研究以及中藥新藥的研發(fā)提供新思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 厚樸三物湯有效化合物成分及相關(guān)靶點(diǎn)篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP），以口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18為篩選條件，檢索并獲得厚樸三物湯中大黃、枳實(shí)、厚樸3 味中藥的有效化合物及對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，篩選后在Uiprot 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org）中將化合物作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化成規(guī)范的基因標(biāo)識(shí)符。

1.2 便秘相關(guān)靶點(diǎn)篩選

以“constipation”為檢索詞，在 OMIM、GeneCards、PharmGKB、TTD、DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中查找有關(guān)便秘的相關(guān)靶點(diǎn)，在各數(shù)據(jù)庫(kù)獲取的數(shù)據(jù)再通過(guò)R 語(yǔ)言的“Venn”軟件包，去重后取交集并繪制韋恩圖。

1.3 厚樸三物湯成分與靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將篩選的厚樸三物湯的有效成分及疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，構(gòu)建厚樸三物湯有效成分與靶點(diǎn)的可視化圖，運(yùn)用插CytoNCAA 分析視圖的特征，設(shè)置節(jié)點(diǎn)值和自由度參數(shù)，以方便準(zhǔn)確的觀察復(fù)方中主要有效成分。將1.2 項(xiàng)下獲得的便秘靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇物種為“人”模式，蛋白屬設(shè)為“home sapiens”，highest confidence＝0.95，其他參數(shù)不變，獲取蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。利用CytoNCA 進(jìn)行拓?fù)浞治?，篩選其核心靶點(diǎn)。

1.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)的基因本體（GO）及京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

利用生物信息軟件包“ org.Hs.eg.db ”“enrichplot”“clusterProfiler”等數(shù)據(jù)包對(duì)厚樸三物湯有效成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功富集分析和KEGG 通路分析，以P＜0.05 為閾值。以對(duì)GO 生物學(xué)過(guò)程中的生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞成分（CC）、分子功能（MF）富集最高的前10 條繪制成條形圖。將KEGG 通路富集程度最高的前20 條繪制成高級(jí)氣泡圖。

1.5 分子對(duì)接驗(yàn)證

在Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中查找關(guān)鍵靶點(diǎn)的2D 結(jié)構(gòu)，再通過(guò)ChemOffice 軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)化成3D 結(jié)構(gòu)。在Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)基因，找到對(duì)應(yīng)蛋白ID，在PDB（http://www.rcsb.org/）中下載關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白受體的3D 結(jié)構(gòu)，再利用Pymol、AutoDockTools 軟件進(jìn)行對(duì)其進(jìn)行去除水分子、原有配體和受體及分子的處理，進(jìn)行加氫的處理后確定活性口袋。再運(yùn)行Vina 對(duì)分子與靶點(diǎn)的最低結(jié)合能進(jìn)行分析驗(yàn)證，最后利用Pymol 軟件轉(zhuǎn)化成可視化圖。

2 結(jié)果

2.1 厚樸三物湯有效活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)

通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為篩選條件，獲得厚樸三物湯有效活性成分，符合篩選條件的有效成分共39 個(gè)，其中大黃16 個(gè)，厚樸2 個(gè)，枳實(shí)21 個(gè)，見(jiàn)表1?；钚猿煞謱?duì)應(yīng)靶點(diǎn)139 個(gè)。

表1 厚樸三物湯有效成分Table 1 Effective components of Houpu Sanwu Decoction

2.2 厚樸三物湯治療便秘的潛在靶點(diǎn)

從在GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank 5 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中，獲取便秘的靶點(diǎn)分別為5 298、361、357、11、84 個(gè)，去掉重復(fù)化合物后后取并集，還剩余1 585 個(gè)，見(jiàn)圖1。將厚樸三物湯主要有效成分的作用靶點(diǎn)與疾病的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)取交集，最終獲得厚樸三物湯作用于便秘的潛在靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)57 個(gè)，有效成分26 個(gè)，以韋恩圖的形式展現(xiàn)交集靶點(diǎn)，見(jiàn)圖2。

圖1 便秘相關(guān)靶點(diǎn)Fig.1 Targets associated with constipation

圖2 厚樸三物湯治療便秘作用靶點(diǎn)Fig.2 Target of Houpu Sanwu Decoction in treatment of constipation

2.3 成分–靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析

在Cytoscape 數(shù)據(jù)庫(kù)中，將26 個(gè)與便秘相關(guān)的有效成分、57 條相關(guān)基因?qū)霕?gòu)建活性成分–靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3?？梢?jiàn)同一個(gè)疾病靶點(diǎn)可與不同的活性成分相對(duì)應(yīng)，不同的靶點(diǎn)也可對(duì)應(yīng)相同的活性成分，厚樸三物治療便秘具有多個(gè)靶點(diǎn)、多種成分特點(diǎn)。

圖3 活性成分–靶點(diǎn)圖Fig.3 Active ingredients–target plot

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建分析與核心靶點(diǎn)篩選

將厚樸三物湯主要有效成分作用靶點(diǎn)與便秘疾病靶點(diǎn)取交集所獲得的57 個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入數(shù)String據(jù)庫(kù)，選擇最低互助評(píng)分為0.9，去除游離點(diǎn)，得到55 個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 334 條邊，見(jiàn)圖4。將String 數(shù)據(jù)庫(kù)中得到的PPI 網(wǎng)絡(luò)文件導(dǎo)入Cytoscape 軟件，利用CytoNCA 進(jìn)行篩選及可視化處理，如圖5 所示，其連接點(diǎn)數(shù)目較高的靶點(diǎn)基因有白細(xì)胞介素（IL）-1B、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）3、細(xì)胞周期素D1（CCND1）、腫瘤蛋白P53（TP53）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體G（PPARG）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、胞間黏附分子-1（ICAM1）、MAPK14、原癌基因（MYC）、血紅素加氧酶1（HMOX1）、雌激素受體1（ESR1）、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物酶2（PTGS2）、MAPK8、蛋白激酶B1（Akt1）、MAPK1、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、酪氨酸激酶受體2（ERBB2），這些靶點(diǎn)是厚樸三物湯治療便秘的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖4 厚樸三物湯蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Protein PPI network of Houpo Sanwu Decoction

圖5 核心靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Core target gene network

2.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO 功能富集分析和KEGG 通路分析

將20 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入利用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 通路分析，以P＜0.05 為閾值篩選，得出BP 包含對(duì)營(yíng)養(yǎng)素水平的反應(yīng)、對(duì)金屬離子的反應(yīng)、對(duì)氧氣水平的反應(yīng)、對(duì)紫外線的反應(yīng)、對(duì)藥物的反應(yīng)等2 008 條，CC 包含隔膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、囊泡腔、核封裝等67 個(gè)，MF 主要涉及磷酸酶結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合蛋白、核受體活動(dòng)、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、泛素蛋白連接酶結(jié)合等123 條。分別取富集最顯著的前10 條經(jīng)行可視化分析，見(jiàn)圖6。對(duì)KEGG 通路進(jìn)行篩選，以P＜0.05 為篩選條件，得到153 條信號(hào)通路，厚樸三物湯治療便秘涉及的主要有內(nèi)分泌抗藥性、人巨細(xì)胞病毒感染、膀胱癌、直腸癌、卡波西肉瘤、皰疹病毒感染、IL-17、丙型肝炎、小細(xì)胞肺癌等信號(hào)通路。根據(jù)靶點(diǎn)數(shù)目及P值取前富集顯著的前30 條進(jìn)行可視化，見(jiàn)圖7。

圖7 KEGG 富集分析圖Fig.7 KEGG enrichment analysis

2.6 分子對(duì)接

將自由度較高的的活性成分蘆薈大黃素、木犀草素、柚皮素與2.4 項(xiàng)下篩選的核心基因IL-1B、VEGFA、MAPK3 進(jìn)行分子對(duì)接，并利用pymol 軟件進(jìn)行可視化分析，見(jiàn)圖8、表2。結(jié)果顯示，蘆薈大黃素與各核心靶點(diǎn)基因有較好的結(jié)合活性，提示蘆薈大黃素與上述靶點(diǎn)相互作用較大可能為厚樸三物湯治療便秘的重要機(jī)制，值得做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖8 分子對(duì)接模式圖Fig.8 Molecular docking model diagram

表2 厚樸三物湯治療便秘核心有效成分與靶點(diǎn)結(jié)合能Table 2 Houpu Sanwu Decoction for treating constipation core active ingredient and target binding energy

3 討論

厚樸三物湯為治療便秘的有效方，具有通便瀉熱，消滯除滿功效。中醫(yī)認(rèn)為便秘不僅與自身體質(zhì)有關(guān)，還與環(huán)境、飲食等外在因素有關(guān)。氣血虧虛虛、脾腎陽(yáng)虛、陰血虧虛等為便秘的常見(jiàn)病機(jī)，其病位在大腸，且涉及肺、脾、腎等臟腑[5]。據(jù)歷代醫(yī)家總結(jié)及現(xiàn)代臨床實(shí)踐表明，厚樸三物湯主要對(duì)氣滯型便秘療效顯著，但治療機(jī)制至多為尚未清楚。故本研究通過(guò)各中藥數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)藥物的有效成分、疾病的靶點(diǎn)經(jīng)行查找分析，以發(fā)現(xiàn)成分于靶點(diǎn)相互關(guān)系，為厚樸三物湯治療便秘使用提供理論依據(jù)。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)篩選，得到厚樸三物湯的有57個(gè)活性成分，其中關(guān)鍵成分為蘆薈大黃素、木犀草素、柚皮素。研究發(fā)現(xiàn)，蘆薈大黃素可能是通過(guò)增加肌間的神經(jīng)叢P 物質(zhì)（SP）、血管活性腸肽（VIP）的含量，以進(jìn)一步增強(qiáng)腸道動(dòng)力來(lái)緩解便秘[6]；Zheng 等[7]報(bào)道，蘆薈大黃素也可以通過(guò)上調(diào)便秘小鼠腸組織中水通道蛋白3（AQP3）表達(dá)來(lái)改善胃腸蠕動(dòng)而促進(jìn)排便。木犀草素屬天然黃酮類化合物，經(jīng)研究其可以通過(guò)L 型鈣離子通道來(lái)調(diào)節(jié)腸道平滑肌運(yùn)動(dòng)，也能夠通過(guò)降低平滑肌細(xì)胞的Akt 磷酸化水平，抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt 通路激活，起到抑制平滑肌增殖的作用以達(dá)到治療便秘的作用[8]。柚皮素可調(diào)節(jié)血清中胃腸代謝相關(guān)成分的產(chǎn)生。研究顯示柚皮素緩便秘癥狀的機(jī)制可能與上調(diào)lop 誘導(dǎo)便秘小鼠的Cajal 間質(zhì)細(xì)胞和AQP3的表達(dá)增加相關(guān)[9]。因此蘆薈大黃素、木犀草素、柚皮素極大可能為治療便秘的關(guān)鍵有效成分，為臨床新藥的研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

PPI 網(wǎng)絡(luò)顯示，厚樸三物湯中有效化合物成分可能是通過(guò)IL-1B、VEGFA、MAPK3 等關(guān)鍵靶點(diǎn)起作用，IL-1B 可以顯著增加腸上皮細(xì)胞中抗菌肽的表達(dá)，降低腸道炎癥致病菌的存活率，減輕炎癥對(duì)腸道環(huán)境的干擾[10]。MAPK3 是MAPK 家族成員。在便秘模型大鼠結(jié)腸組織中，通過(guò)阻斷MAPK信號(hào)通路，可以下調(diào)APQ3、APQ4 的表達(dá)，有效減少腸道對(duì)水分重新吸收，減少便秘的發(fā)生[11]。

VEGFA 可促進(jìn)新生血管形成，厚樸三物湯中的有效成分可能通過(guò)調(diào)節(jié)VEGFA 水平，以改善腸神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)支持，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，以進(jìn)一步緩解便秘。通過(guò)KEGG 富集分析可知，以上關(guān)鍵靶點(diǎn)作用于便秘有多條通路途徑，主要包括內(nèi)分泌抗藥性、人巨細(xì)胞病毒感染、膀胱癌、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、IL-17、丙型肝炎、小細(xì)胞肺癌等信號(hào)通路。進(jìn)一步說(shuō)明厚樸三物湯治療便秘很可能是通過(guò)免疫抑制、抗炎作用、抗病毒、抗腫瘤等多種方式發(fā)揮作用。通過(guò)分子對(duì)接將厚樸三物湯有效成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接，結(jié)果顯示二者能穩(wěn)定結(jié)合，進(jìn)一步說(shuō)明厚樸三物湯有效成分能在體內(nèi)穩(wěn)定的發(fā)揮治療作用。本研究表明，厚樸三物湯治療便秘具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突