趙晨穎 ，韓雪 ，賀一凡 ，史海龍，王斌，衛(wèi)昊，史永恒*，劉繼平

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046

2.陜西省中醫(yī)藥管理局 中藥藥效機(jī)制與物質(zhì)基礎(chǔ)重點(diǎn)研究室，陜西 咸陽 712046

糖尿病是以機(jī)體對(duì)糖利用效率降低引起的血糖過高為主要特征的代謝性疾病，進(jìn)而引起蛋白質(zhì)和脂肪代謝異常，后期會(huì)逐漸導(dǎo)致眼、心、腦、腎、足等多器官急慢性并發(fā)癥。2015—2017 年我國(guó)18歲及以上人群糖尿患病率為11.2%，達(dá)1.56 億人[1]。因此，尋找治療糖尿病的藥物是藥物研究的熱點(diǎn)。

葒草素和異葒草素是一類黃酮碳苷類化合物，為蓼科植物葒蓼PolygonumorientaleL.的主要活性成分，在西番蓮、決明、黃荊、竹葉、滿天星、麻花艽等中藥材中也存在。近年來的藥理學(xué)研究表明，葒草具有豐富的藥理活性，其主要活性成分葒草素和異葒草素具有心血管保護(hù)、抗衰老、抗腫瘤、抗炎、調(diào)血糖等藥理作用[2-4]。葒草素和異葒草素可以改善脂肪細(xì)胞中的葡萄糖代謝，維持肝細(xì)胞的底物利用率來改善胰島素抵抗現(xiàn)象已被證實(shí)[5]，但關(guān)于其降血糖的靶點(diǎn)及體外活性研究較少。

本研究擬通過虛擬分子對(duì)接篩選中藥葒草中黃酮碳苷類有效成分葒草素和異葒草素可能的降血糖靶點(diǎn)，并對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行體外活性測(cè)試，從而揭示葒草素和異葒草素降血糖作用及其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 藥品及主要試劑

葒草素（成都曼思特化學(xué)制劑有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)20171105）；異葒草素（成都曼思特化學(xué)制劑有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)20171105）；熒光脫氧葡萄糖（1-NBDG，藥明康德新藥開發(fā)有限公司，批號(hào)ET4099-7-P1）；達(dá)格列凈（上海瀚香生物科技有限公司，批號(hào)2014102202）；4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷（PNPG，成都華娜化學(xué)制劑有限公司，批號(hào)20171026）；阿卡波糖（成都艾娜華化學(xué)制劑有限公司，批號(hào)20170828）；DMEM培養(yǎng)基（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號(hào)GP21110161645）；胰蛋白酶（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號(hào)CR2112015）；磷酸緩沖液（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號(hào)WH0022A071）；氯化膽堿、氯化鉀、氯化鎂、氯化鈣（天津市天力化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 細(xì)胞

穩(wěn)定過表達(dá)鈉–葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 2（SGLT2）的HEK293（人胚胎腎上皮細(xì)胞），穩(wěn)定高表達(dá)蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）的293T 細(xì)胞（人胚腎細(xì)胞），由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和細(xì)胞中心提供。

1.3 儀器

Radiance 2100 CLSM 激光共聚焦掃描顯微鏡（Bio-Rad 公司），MCO-15AC CO2培養(yǎng)箱（Sanyo 公司），Enspire 熒光酶標(biāo)儀（Perkinelmer 公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分子對(duì)接

從www.rcsb.org 網(wǎng)站依次下載糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)在 Schr?dinger 軟件中對(duì)受體結(jié)構(gòu)用 Protein Preparation Wizard 模塊分別進(jìn)行加氫、加電荷、去除結(jié)晶水等處理，并采用Glide 模以原配體為中心（GPR40 和SGLT2 以文獻(xiàn)報(bào)道活性位點(diǎn)殘基為中心）生成格點(diǎn)文件；采用LigPrep 模塊對(duì)配體進(jìn)行處理，采用Epik 方法生成pH（7±2）的所有可能構(gòu)象，采用Glide 模塊以標(biāo)準(zhǔn)精度進(jìn)行分子對(duì)接，得出分子對(duì)接結(jié)果，并計(jì)算陽性對(duì)照物與葒草素/異葒草素的分子對(duì)接得分差異度。

得分差異度＝（陽性對(duì)照物得分－葒草素/異葒草素對(duì)接得分）/陽性對(duì)照物得分

2.2 體外抑制SGLT2 活性實(shí)驗(yàn)

本研究采用穩(wěn)定過表達(dá)SGLT2 的人胚腎細(xì)胞（HEK293）模型，并以1-NBDG 為底物進(jìn)行葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，采用文獻(xiàn)報(bào)道[6]的方法初步評(píng)價(jià)化合物對(duì)HEK293 細(xì)胞SGLT2 攝取功能的抑制強(qiáng)度。

將濃度為3×108個(gè)/L 的過表達(dá)SGLT2 的HEK293 細(xì)胞按100 μL/孔細(xì)胞鋪板，90%融合后，采用低糖無血清DMEM 培養(yǎng)基處理2 h 后，用非特異性攝取緩沖液（Na+-free buffer）/Na+依賴性攝取緩沖液（Na+-buffer）清洗1 遍，再加入含有1-NBDG（100 μmol/L）的攝取液進(jìn)行葡萄糖攝取。

在上述培養(yǎng)板中按50 μL/孔依次加入葒草素、異葒草素和達(dá)格列凈（3 個(gè)平行濃度）溶液，濃度均為1×10?5mol/L，在37 ℃下攝取4 h；然后加入含有0.5 mmol/L 根皮苷的攝取緩沖液使反應(yīng)停止；在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。將0.1 mol/L NaOH 裂解細(xì)胞轉(zhuǎn)移至底部透明的96 孔黑板中，采用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)1-NBDG 含量（激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)：485 nm/535 nm）。采用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞裂解液的熒光強(qiáng)度，結(jié)果以熒光強(qiáng)度/蛋白含量來表示。

2.3 體外抑制α-葡萄糖苷酶活性實(shí)驗(yàn)

采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法[7-8]評(píng)價(jià)葒草素和異葒草素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性。實(shí)驗(yàn)將分為對(duì)照組、葒草素（100 μmol/L）組、異葒草素（100 μmol/L）組、阿卡波糖（100 μmol/L）組，在160 μL 的96 孔板開展，每組3 個(gè)平行孔。將20 μL 0.1 mol/L 磷酸緩沖液（pH 7.0）、20 μL 底物溶液（2.5 mmol/L pNPG溶于0.1 mol/L 磷酸緩沖液）和20 μL 100 μmol/L 待測(cè)藥物依次加入孔中，混勻，在37 ℃水浴中振蕩10 min 后，再加入20 μL α-葡萄糖苷酶溶液（在含有0.2% BSA 的0.01 mol/L 磷酸緩沖液中加入0.2 U/mL α-葡萄糖苷酶，溶解），充分混勻，然后放入37 ℃水浴中反應(yīng)20 min。結(jié)束后加入80 μL 0.2 mol/L 碳酸鈉溶液中止反應(yīng)，采用酶標(biāo)儀在405 nm處測(cè)定其吸光度（A），最后根據(jù)公式計(jì)算出各樣品的抑制率。

抑制率＝1－（A受試－A空白）/（A對(duì)照－A空白）

2.4 體外抑制PTP1B 活性實(shí)驗(yàn)

采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法[9]測(cè)定葒草素和異葒草素對(duì)PTP1B 的抑制活性。本實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、葒草素（100 μmol/L）組、異葒草素（100 μmol/L）組、陽性對(duì)照化合物V[10]（100 μmol/L）組，PTP1B 酶稀釋至0.5 ng/μL 待用，以pNPP 作為PTP1B 的底物，每組3 個(gè)平行孔。在160 μL 的96 孔板中，將10 μL待測(cè)物與5 μL PTP1B 于室溫下共孵5 min，后依次加入35 μL 反應(yīng)液（含有50 mmol/L HEPES、5 mmol/L DTT、150 mmol/L NaCl、2 mmol/L EDTA）和50 μL pNPP 溶液（2 mmol/L，pH 7.0），在30 ℃下孵育10 min，加入25 μL 3 mol/L 氫氧化鈉溶液終止酶反應(yīng)。水解產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚鈉在405 nm 處有很強(qiáng)的光吸收，采用酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm 處的A，根據(jù)公式計(jì)算出各樣品的抑制率。

抑制率＝1－（A受試－A空白）/（A對(duì)照－A空白）

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 葒草素和異葒草素與糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果

從www.rcsb.org 網(wǎng)站下載糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)的晶體結(jié)構(gòu)，見表1。葒草素和陽性對(duì)照物與糖尿病靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果以結(jié)合能表示見表2，其中SGLT2、α-葡萄糖苷酶與陽性對(duì)照物達(dá)格列凈和阿卡波糖的分子對(duì)接結(jié)果分別?9.79 kcal/mol（1 cal＝4.4 J）、?5.58 kcal/mol；而葒草素與SGLT2 和α-葡萄糖苷酶對(duì)接得分分別為?9.32 kcal/mol、?5.67 kcal/mol，其與陽性對(duì)照物得分差異度分別為4.80%、1.59%，分子對(duì)接結(jié)果差異度小。其中葒草素與SGLT2 中的Thr153、Trq291、Ser460 形成4 個(gè)氫鍵，與α-葡萄糖苷酶中的Asp282、Asp518、Arg600、Asp616 形成6 個(gè)氫鍵。

表1 糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)及PDB 編號(hào)Table 1 Diabetes-related targets and PDB numbers

表2 葒草素與糖尿病靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果Table 2 Molecular docking results of orientin and diabetes target

異葒草素和陽性對(duì)照物與糖尿病靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果見表3，異葒草素與SGLT2 中的Asn75、Aer460、Ser400 形成 4 個(gè)氫鍵，對(duì)接結(jié)果為?8.63kcal/mol，其與陽性對(duì)照物達(dá)格列凈對(duì)接得分相比其差異度為11.84%；與α-葡萄糖苷酶中的Asp282、Arg281、Asp404、Phe525、Asp616 形成5個(gè)氫鍵，對(duì)接結(jié)果為?5.34 kcal/mol，比陽性對(duì)照藥阿卡波糖的?5.58 kcal/mol 略弱，但二者的差異度為僅4.30%。異葒草素與其他靶點(diǎn)的分子對(duì)接普遍較弱，而與PTP1B 的分子對(duì)接結(jié)果僅為?4.93 kcal/mol，其與陽性對(duì)照物化合物902 的差異度達(dá)46.88%。

表3 異葒草素與糖尿病靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果Table 3 Molecular docking results of isoorientin and diabetes target

由表2、3 可知，葒草素和異葒草素在糖尿病靶標(biāo)中，對(duì)α-葡萄糖苷酶有較強(qiáng)的結(jié)合作用，其次對(duì)SGLT2 也具有較好的結(jié)合能力，但對(duì)PTP1B 的結(jié)合能力很弱。因此。葒草素和異葒草素的降血糖作用可能是通過抑制雙靶點(diǎn)α-葡萄糖苷酶和SGLT2 發(fā)揮。

3.2 葒草素和異葒草素抑制 α-葡萄糖苷酶、SGLT2、PTP1B 活性

體外活性測(cè)試結(jié)果表明，在100 μmol/L 時(shí)葒草素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率為（16.7±5.8）%，異葒草素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率為（11.8±3.8）%，同濃度的陽性對(duì)照藥阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率為（63.7±5.8）%；葒草素對(duì)SGLT2 蛋白的抑制率為（15.4±1.2）%，異葒草素對(duì)SGLT2 抑制率為（9.4±1.1）%，而同濃度的陽性對(duì)照藥達(dá)格列凈對(duì)SGLT2 的抑制率為（92.7±8.8）%；葒草素對(duì)PTP1B的抑制率僅為（3.0±0.5）%，異葒草素對(duì)PTP1B 的抑制率為（?3.8±0.6）%，同濃度的陽性對(duì)照藥V 對(duì)PTP1B 的抑制率為（73.4±8.3）%，見表4。

表4 葒草素、異葒草素對(duì)SGLT2、α-glucosidase、PTP1B 蛋白的抑制率的影響Table 4 Effects of orientin and isoorientin on the inhibition rates of SGLT2,α-glucosidase and PTP1B proteins

4 討論

糖尿病的藥物治療靶點(diǎn)多，藥物多，但糖尿病發(fā)病率高，嚴(yán)重影響人們的身心健康和生活質(zhì)量，且許多治療糖尿病的藥品商品化嚴(yán)重，成本高，且藥物之間的相互作用與不良反應(yīng)較多[13]，而傳統(tǒng)中藥在治療糖尿病時(shí)可能耐受性較強(qiáng)，不良反應(yīng)較少，因此從天然藥物中尋求治療糖尿病的藥物研究一直是藥學(xué)研究的熱點(diǎn)。SGLT2 抑制劑和α-葡萄糖苷酶抑制劑均是良好的降血糖藥物[14-16]，但是兼有抑制SGLT2 和α-葡萄糖苷酶的藥物報(bào)道較少。

在靶點(diǎn)篩選中發(fā)現(xiàn)，葒草素和異葒草素對(duì)α-葡萄糖苷酶具有較好的結(jié)合作用，其分子對(duì)接得分與陽性對(duì)照藥阿卡波糖基本接近，但其細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)葒草素和異葒草素在100 μmol/L 時(shí)對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率分別為（16.7±5.8）%、（11.8±3.8）%，均對(duì)α-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出溫和的抑制作用；葒草素和異葒草素對(duì)SGLT2 也表現(xiàn)出較好的結(jié)合作用，其分子對(duì)接得分與陽性對(duì)照藥達(dá)格列凈的差異度分別為4.80%、11.84%，但細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示二者對(duì)SGLT2的抑制率分別為（15.4±1.2）%、（9.4±1.1）%，均有一定的抑制活性；在PTP1B 的研究中，葒草素和異葒草素在分子對(duì)接均表現(xiàn)出對(duì)該蛋白弱的結(jié)合作用，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中幾乎無抑制作用。因此，葒草素和異葒草素可同時(shí)抑制α-葡萄糖苷酶和SGLT2 2個(gè)蛋白，呈現(xiàn)出很好的雙靶點(diǎn)降血糖作用，是潛在的一類具有SGLT2 和α-葡萄糖苷酶雙靶點(diǎn)抑制的化合物。

對(duì)比葒草素和異葒草素，可以發(fā)現(xiàn)，葒草素對(duì)α-葡萄糖苷酶和SGLT2 2 個(gè)蛋白表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。在分子對(duì)接中，葒草素與阿卡波糖的分子對(duì)接差異度為1.59%，優(yōu)于異葒草素與阿卡波糖分子對(duì)接差異度4.30%，葒草素與達(dá)格列凈的分子對(duì)接差異度為4.80%，也優(yōu)于異葒草素與達(dá)格列凈分子對(duì)接差異度11.84%；在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，葒草素在100 μmol/L 時(shí)對(duì)α-葡萄糖苷酶SGLT2 蛋白的抑制率分別為（16.7±5.8）%、（15.4±1.2）%，均優(yōu)于異葒草素對(duì)α-葡萄糖苷酶SGLT2 蛋白抑制活性的（11.8±3.8）%、（9.4±1.1）%。因此，葒草素比異葒草素具有更好的靶點(diǎn)抑制活性，可能比異葒草素具有更好的降血糖作用。

綜上，葒草素和異葒草素對(duì)SGLT2 和α-糖苷酶均具有一定的抑制活性，對(duì)PTP1B 基本沒有抑制作用，且葒草素的體外活性略強(qiáng)于異葒草素。葒草素有可能作為一類具有雙靶點(diǎn)作用的降血糖先導(dǎo)化合物，對(duì)其開展進(jìn)一步研究，拓展葒草素在降血糖方面的應(yīng)用，對(duì)新型降血糖藥物的研發(fā)具有一定意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突