鄭雪松，張小飛，董 碟

武漢貝茵萊生物科技有限公司，湖北 武漢 430000

炎癥性腸病是一類復(fù)雜、病因不明的慢性腸道疾病，主要類型為克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎。這兩種疾病都表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的腸道炎癥，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。腸道微生物群落擁有巨大的生物多樣性，與宿主的健康狀況存在密切關(guān)聯(lián)，且近年來已被證明在許多疾病的發(fā)生與發(fā)展中起著重要作用，包括腸道疾病、腸道相關(guān)的代謝性疾病和一些心腦血管疾病等[1-2]。葡聚糖硫酸鈉鹽（Dextran Sulfate Sodium Salt，DSS）是一種聚陰離子衍生物，其誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型的機制雖未十分明確，但通常認為會引發(fā)巨噬細胞功能失調(diào)、腸道菌群失調(diào)。IFX 和Hydrostatin-SN10 在炎癥性腸病治療中顯示出較好的療效[3-4]。因此，研究利用DSS 對小鼠進行潰瘍性結(jié)腸炎誘導(dǎo)，觀察對照組、實驗組和治療組潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的體重變化、脾臟指數(shù)及生物標志物的表達情況，分析小鼠的炎癥標志物表達水平與炎癥性腸病的關(guān)系，有助于診斷IBD 和指導(dǎo)用藥治療。

1 資料和方法

1.1 一般資料

研究采用的實驗動物為C57BL/6 小鼠，實驗主要耗材包括DSS、組織固定液、生理鹽水、蘇木素伊紅染色試劑盒、Chymotrypsin C 和Gelsolin ELISA 試劑盒、RhoGDI2 抗體等。實驗使用的主要儀器包括制冰機、超凈工作臺、高壓滅菌鍋、離心機、超微量分光光度計、組織研磨儀、酶標儀、TS-200 脫色搖床、超純水儀、GeL Image System。

1.2 研究方法

潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型的構(gòu)建步驟如下。第一，將C57BL/6 小鼠進行3～5 d 的預(yù)飼養(yǎng)，再隨機分為7 個組，每組6～8 只小鼠，包括對照組，實驗組，IFX和Hydrostatin-SN10 治療處理組。第二，對照組以滅菌的純凈水及無菌飼料喂養(yǎng)，持續(xù)7 d[5-6]；其他組以3%DSS 溶液喂養(yǎng)，持續(xù)7 d。第三，Hydrostatin-SN10處理組小鼠均進行腹腔注射給藥，IFX 組、Hydrostatin-SN10、M1、M2 和M3 組的給藥劑量分別是800 μg/kg/d、4 mg/kg/d、800 μg /kg/d，實驗組注射100 μL/20g/d 的生理鹽水7 d。第四，每日定時對每組小鼠稱重并進行行為觀察，記錄小鼠的體重。第五，實驗第7 天處死小鼠，取出小鼠的脾臟、結(jié)腸進行拍照并記錄其重量[7]，然后按照部位分段處理結(jié)腸，分別用于炎癥標志物的檢測和后續(xù)其他實驗材料。

1.3 觀察指標

潰瘍性結(jié)腸炎的癥狀一般表現(xiàn)為腹瀉、患者體重下降、脾臟異常腫大[8]。因此，探究腸病微生物在炎癥腸病中的靶標時，將小鼠的體重變化、脾臟質(zhì)量及腸道炎癥標志物的表達情況作為觀察指標進行分析，Chymotrypsin C 及Gelsolin 均采用ELISA 試劑盒進行檢測，RhoGDI2 采用免疫印跡法進行檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

研究對實驗結(jié)果數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析均采用SPSS 25.0 進行，值均為雙側(cè)檢驗，若P＞0.05，則數(shù)據(jù)不具有統(tǒng)計學(xué)意義，反之則具有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗數(shù)據(jù)均采用表示，計量資料間的比較采用ANOVA檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的體重結(jié)果分析

對各組小鼠進行處理后，對照組小鼠體重呈正常生長狀態(tài)，實驗組小鼠體重呈大幅下降狀態(tài)，治療組均有不同程度的體重下降（P＜0.001）。開始實驗的第1 天，所有小鼠的體重為19±1.0 g，分別在第1、3和7 天進行稱重，小鼠體重變化見表1。

表1 小鼠體重變化結(jié)果

2.2 各組小鼠的脾臟指數(shù)結(jié)果分析

相較于實驗組，其余組別的脾臟指數(shù)均有所下降（P＜0.001）。相較于對照組，實驗組小鼠的脾臟指數(shù)上升0.100%，IFX 組和Hydrostatin-SN10 治療組小鼠的脾臟質(zhì)量上升0.056%；小鼠脾臟質(zhì)量變化結(jié)果見圖1。

圖1 小鼠脾臟指數(shù)變化結(jié)果

2.2 小鼠炎癥標志物表達結(jié)果分析

相較于對照組，實驗組的三種炎癥標志物表達量均大幅上升，經(jīng)過不同藥物治療后，小鼠腸道炎癥標志物表達水平出現(xiàn)不同程度的下降。Hydrostatin-SN10-M1 組的炎癥因子表達水平下降不明顯，且與Hydrostatin-SN10 組相比，具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，Chymotrypsin C （P ＜0.001）、RhoGDI2 （P ＜0.001）、Gelsolin（P＜0.001）。小鼠腸道炎癥標志物表達水平結(jié)果見表2。

表2 小鼠腸道炎癥標志物表達水平

3 討論

IBD 是一種非常經(jīng)典的與腸道微生物菌群相關(guān)的疾病，包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎。研究以C57BL/6 小鼠為實驗對象，分析了小鼠治療前后的體重、脾臟和炎癥標志物表達水平與IBD 之間的聯(lián)系，為IBD 治療靶標的發(fā)現(xiàn)及檢測提供相關(guān)實驗資料。

實驗組的小鼠腸道組織中三種生物標志物表達量均上升，其中實驗組RhoGDI2 基因表達水平上升最明顯，是對照組的82 倍，實驗組Gelsolin 和Chymotrypsin C 分別是35 倍和8.9 倍。經(jīng)過IFX 和Hydrostatin-SN10 治療組的腸道炎癥標志物表達水平均有明顯下降。綜上所述，小鼠結(jié)腸中Chymotrypsin C、RhoGDI2 及凝溶膠蛋白Gelsolin 表達水平與小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的嚴重程度密切相關(guān)，未來可能作為診斷指標用于IBD 的檢測和治療。