賀炎娜,李 丹,張云鮮,王 丹,王海蕓,崔永靜
蒙牛乳業(yè)(焦作)有限公司,河南 焦作 454000
單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)常出現(xiàn)于土壤中,是以死亡的和正在腐爛的有機物為食的腐生菌,能產(chǎn)生溶血素,引起人類發(fā)燒、腹瀉、頭痛、發(fā)冷、惡心、肌痛等癥狀,也是肉制品、乳制品、魚類、冷藏類食品中的一種污染物,感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎,對人類健康危害較大。
對于單增李斯特氏菌,檢驗技術(shù)機構(gòu)采用國家標準法作為基礎(chǔ)方法進行檢驗。如何有效地鑒別單核細胞增生李斯特菌,則需要與其他相似菌進行對比試驗,在試驗過程中記錄生理生化試驗結(jié)果的相同點及不同點,從而準確快速地分辨單核細胞增生李斯特菌。
從2021 年開始,本實驗室陸續(xù)購入李斯特菌屬的標準菌株:英諾克李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌。依據(jù)GB 4789.30-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》[1],人為地將李斯特菌屬的標準菌株添加至樣品中,在連續(xù)的試驗中觀察對應(yīng)標準菌株的菌落形態(tài)、生化及溶血試驗,從而找出不同菌株的差異性,提升實驗人員的綜合水平。
標準菌株:伊氏李斯特氏菌ATCC19119[美國菌種保藏中心(American type culture collection,ATCC)]、斯氏李斯特氏菌CICC35967、英諾克李斯特氏菌CICC10417、單增李斯特氏菌CICC21635[中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(China center of industrial culture collection,CICC)]。
含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆肉湯(Trypticase Soy-Yeast Extract Agar,TSA-YE)、BHI 肉湯(Brain Heart Infusion Broth)、血瓊脂平板、PALCAM 瓊脂基礎(chǔ)(PALCAM Agar Base)、李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基(Listeria Chiomogenic Medium)、半固體培養(yǎng)基(Motility Test Medium(Semisolid))、單增李斯特氏菌干制生化鑒定試劑盒(Listeria Monocytogenes Dehydration Biochemical Identification Kit)、3%過氧化氫溶液、PALCAM 選擇性添加劑、革蘭氏染色液(GRAM STAIN SETS)試劑盒。以上培養(yǎng)基均來源于北京陸橋技術(shù)股份有限公司。
BSP-250 生化培養(yǎng)箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、SPX-250B 生化培養(yǎng)箱(上海?,攲嶒炘O(shè)備有限公司)、BSC-1300ⅡA2 生物安全柜(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、培養(yǎng)皿(玻璃培養(yǎng)皿或一次性培養(yǎng)皿)、18 mm×180 mm 試管、接種針及對應(yīng)的滅菌裝置(如酒精燈或紅外滅菌器)、Primo Star 顯微鏡(卡爾蔡司股份公司)、VITEK 2 COMPACT 微生物鑒定儀(法國生物梅里埃公司)。
參照GB 4789.30-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》方法。
1.3.1 菌種的活化
標準菌株需從專業(yè)從事微生物菌種保藏管理的機構(gòu)處獲得,嚴格按照標準菌株附帶的操作流程活化。實驗室按照相應(yīng)的操作流程將菌株活化后,將其保存在營養(yǎng)肉湯中,同時添加10%~15%的甘油作為冷凍保護培養(yǎng)基[2],獲得標準儲備菌株,并將其貯存在(-20±2)℃的專用冰柜中。
1.3.2 菌種的復(fù)活
將上述活化后的菌株取出,分別放置在營養(yǎng)肉湯或BHI 肉湯(Brain Heart Infusion Broth)中(36±1)℃培養(yǎng)18~24 h。
1.3.3 劃線分離與純化
使用李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基(Listeria Chiomogenic Medium)和PALCAM 瓊脂基礎(chǔ)(PALCAM Agar Base)劃線培養(yǎng)后的營養(yǎng)肉湯或BHI 肉湯,于(36±1)℃培養(yǎng)(24±2)h 后,觀察菌落形態(tài)。同時將上述平板上的菌落劃線純化至TSA-YE 平板上,進行后續(xù)的鑒定實驗。
1.3.4 鑒定
①染色鏡檢;②動力試驗;③生化鑒定:用3%過氧化氫溶液及干制生化試劑盒鑒定,生化試劑盒包含木糖、鼠李糖、MR-VP、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、七葉苷;④溶血試驗:穿刺接種;⑤使用VITEK 2 COMPACT 微生物鑒定儀進行鑒定[3]。
不同菌株在相應(yīng)培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)見表1。由于試驗過程中使用非選擇性增菌培養(yǎng)基TSAYE,故在TSA-YE 生長的菌株均為乳白色,從菌落形態(tài)上無法進行區(qū)分。
表1 各菌株在不同培養(yǎng)基上的生長情況
2.2.1 染色鏡檢
挑取TSA-YE 平板上的菌落進行染色鏡檢見圖1。鏡檢結(jié)果表示,四種標準菌株均為革蘭氏陽性短桿菌。
圖1 顯微鏡下的形態(tài)
2.2.2 動力試驗
使用接種針將TSA-YE 平板上的菌落穿刺至半固體培養(yǎng)基中,于(30±1)℃培養(yǎng)48 h~5 d。半固體生長狀態(tài)見圖2。
圖2 半固體動力培養(yǎng)基中的形態(tài)
2.2.3 生化鑒定
生化鑒定結(jié)果見表2,MR-VP、葡萄糖、麥芽糖、七葉苷、過氧化氫酶試驗無法區(qū)分斯氏李斯特氏菌CICC35967、英諾克李斯特氏菌CICC10417、伊氏李斯特氏菌ATCC19119、單增李斯特氏菌CICC21635四種菌株。伊氏李斯特氏菌ATCC19119、斯氏李斯特氏菌CICC35967 鼠李糖和木糖的結(jié)果分別為(-)、(+),英諾克李斯特氏菌CICC10417、單增李斯特氏菌CICC21635 鼠李糖和木糖的結(jié)果分別為(+)、(-),這兩個試驗可進行有效區(qū)分。
表2 各菌株的生化鑒定結(jié)果
2.2.4 溶血試驗
單增李斯特氏菌產(chǎn)生狹窄、清晰、明亮的溶血圈,斯氏李斯特氏菌在刺種點周圍產(chǎn)生弱的透明溶血圈,英諾克李斯特氏菌無溶血圈,伊氏李斯特氏菌產(chǎn)生寬的、輪廓清晰的β-溶血區(qū)域。
2.2.5 VITEK 2 COMPACT 微生物鑒定儀鑒定
利用VITEK 2 Compact 全自動微生物分析系統(tǒng)對伊氏李斯特氏菌ATCC19119、斯氏李斯特氏菌CICC35967、英諾克李斯特氏菌CICC10417、單增李斯特氏菌CICC21635 四種菌株進行鑒定,磷脂酰磷脂酶C(PIPLC)、D-木糖(dXYL)、α-葡萄糖苷酶(AGLU)、α-甘露糖苷酶(AMAN)、酪氨酸芳胺酶(TyrA)、多粘菌素B 耐受(POLYB)、乳糖(LAC)、新生霉素耐受(NOVO)、6.5%NaCl 生長(NC6.5)、D-海藻糖(dTRE)等10 項檢測結(jié)果不一致,其余33 項生化鑒定結(jié)果一致,結(jié)果分別判定為伊氏李斯特氏菌(93%概率)為非常好的鑒定,斯氏李斯特氏菌(97%概率)為極好的鑒定,英諾克李斯特氏菌(99%概率)為極好的鑒定,單核細胞增生李斯特氏菌(99%概率)為極好的鑒定。
本研究表明,菌株的關(guān)鍵特性在試驗中可快速、高效的區(qū)分與分離,同時木糖和鼠李糖試驗可初步篩選區(qū)分4 株標準菌株。未來可以通過科學技術(shù),將木糖和鼠李糖加入鑒別培養(yǎng)基中,在劃線分離步驟中通過顏色信息進行區(qū)分,縮短試驗過程,提高檢測效率。