楊雪 程園園 田瑞華

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤, 近年來其發(fā)病率和死亡率均呈不斷升高趨勢(shì)［1］。目前胃癌治療主要為手術(shù)治療, 胃癌的發(fā)病與抑癌基因失活、原癌基因激活及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因異常表達(dá)密切相關(guān)［2］。有研究證實(shí), c-Myc 是一類經(jīng)典的癌基因, 其在腫瘤組織中呈異常高表達(dá), 并與惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展及浸潤關(guān)系密切相關(guān), 并在細(xì)胞分化、增殖和凋亡等生理過程中發(fā)揮重要作用［3］。CDK-12 在調(diào)控DNA 損傷和應(yīng)激損傷的細(xì)胞應(yīng)答基因轉(zhuǎn)錄方面發(fā)揮特定作用, 其在多種惡性腫瘤中呈異常高表達(dá)［4］。研究證實(shí), CDK-12表達(dá)可上調(diào)c-Myc 及其相關(guān)基因表達(dá), 從而加速DNA的復(fù)制［5］。兩者在惡性腫瘤中存在一定相關(guān)性, 并共同參與惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。CDK-12 是c-Myc 前體mRNA 加工必須基因。為此, 本研究對(duì)80 例胃癌患者手術(shù)標(biāo)本中的c-Myc、CDK12 表達(dá)進(jìn)行免疫組化法檢測(cè), 分析兩者的相關(guān)性及臨床意義, 現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016 年1 月～2019 年1 月期間本院收治的80 例胃癌患者的胃癌組織和癌旁組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］, 并經(jīng)病理學(xué)檢查及影像學(xué)檢查證實(shí)；符合胃癌根治手術(shù)指征；無心肝腎等臟器功能不全者；術(shù)前未行放療和化療；患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：心肝腎等臟器功能不全者；合并腸道器質(zhì)性、功能性疾病者；合并免疫缺陷疾病、血液系統(tǒng)疾病者；合并其他惡性腫瘤者；術(shù)前接受放療、化療等治療者；妊娠期及哺乳期婦女；不能配合本研究隨訪或失訪者。80 例患者中男57 例, 女23 例；年齡44～84 歲, 平均年齡(59.1±8.4)歲；有飲酒史35 例,有吸煙史30 例；腫瘤最大直徑：＜5 cm 56 例, ≥5 cm 24 例；分化程度：高分化30 例, 中低分化50 例；組織學(xué)分型：腺癌55 例, 黏液癌18 例, 其他7 例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期26 例, Ⅲ～Ⅳ期54 例；浸潤深度：未侵犯漿膜44 例, 侵犯漿膜36 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30 例。本研究獲得了醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員的批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 試劑和儀器 鼠抗人c-Myc、CDK12 單克隆抗體、羊抗鼠二抗由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。金相顯微鏡WMJ-9688 由上海豫光儀器有限公司提供。

1.2.2 免疫組化法檢測(cè) 將標(biāo)本病理蠟塊連續(xù)切片,經(jīng)脫蠟、水化后用檸檬酸鹽抗原修復(fù)液進(jìn)行修復(fù), 磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌5 min, 連續(xù)3 次。用10%山羊血清在室溫下密封30 min, 加入一抗, 置于4℃冰箱中過夜, 滴加二抗, 室溫下孵育1 h, 用二氨基聯(lián)苯氨(DAB)顯色并沖洗, 蘇木精復(fù)染, 脫水、透明后中性樹膠封片, 鏡下觀察。陰性對(duì)照用PBS 代替一抗。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 比較胃癌組織和癌旁組織中c-Myc、CDK12 陽性表達(dá)情況；分析胃癌組織中c-Myc、CDK12 陽性表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系；分析c-Myc 與CDK12 陽性表達(dá)的相關(guān)性, 胃癌組織中c-Myc、CDK12 陽性表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系。由2名病理科醫(yī)師采用雙盲法閱片, 評(píng)估每張標(biāo)本切片的染色強(qiáng)度和細(xì)胞陽性率。細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕褐色或棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。染色程度及陽性細(xì)胞占比采用雙評(píng)分、半定量法評(píng)定：無染色為0 分；淡黃色為1 分；棕黃色為2 分；棕色為3 分。每張切片任意選5個(gè)視野(×400)觀察陽性細(xì)胞占比：幾乎無染色計(jì)0 分；陽性細(xì)胞比例＜10%計(jì)1 分；10%≤陽性細(xì)胞比例＜35%計(jì)2 分；35%≤陽性細(xì)胞比例＜70%計(jì)3 分；陽性細(xì)胞比例≥70%計(jì)4 分。以兩者得分的乘積來判斷c-Myc 及CDK12 的陽性表達(dá), 當(dāng)乘積≤4分判斷為陰性, ＞4分判定為陽性［7］。術(shù)后進(jìn)行3 年的隨訪, 采用電話、門診或住院病歷隨訪方式, 于2022 年1 月結(jié)束隨訪。術(shù)后6 個(gè)月內(nèi)結(jié)合患者情況每隔2～4 周進(jìn)行門診復(fù)查1 次；術(shù)后6 個(gè)后每隔3～6 個(gè)月門診復(fù)查1 次。記錄患者生存情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析, 計(jì)數(shù)資料用率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)；c-Myc、CDK12 表達(dá)關(guān)系采用Spearman 相關(guān)性分析；采用Kaplan-Meier 生存曲線分析患者生存預(yù)后, 采用log-rank 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織和癌旁組織中c-Myc、CDK12 陽性表達(dá)情況比較 胃癌組織中c-Myc、CDK12 陽性表達(dá)率均明顯高于癌旁組織(P＜0.05)。見表1。

表1 80 例患者的胃癌組織和癌旁組織中c-Myc、CDK12 陽性表達(dá)情況比較［n(%)］

2.2 胃癌組織中c-Myc、CDK12 陽性表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 不同年齡、性別、腫瘤最大直徑患者胃癌組織中c-Myc、CDK12 陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；中低分化、Ⅲ～Ⅳ期、侵犯漿膜、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者胃癌組織中c-Myc、CDK12 陽性表達(dá)率明顯高于高分化、Ⅰ～Ⅱ期、未侵犯漿膜、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者胃癌組織(P＜0.05)。見表2。

表2 胃癌組織中c-Myc、CDK12 陽性表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系［n(%)］

2.3 c-Myc 與CDK12 陽性表達(dá)的相關(guān)性分析 相關(guān)分析發(fā)現(xiàn), c-Myc、CDK12 在胃癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)性(r=0.487, P=0.016＜0.05)。

2.4 胃癌組織中c-Myc、CDK12 陽性表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系 胃癌組織中c-Myc、CDK12 陽性患者的3 年生存率均明顯低于c-Myc、CDK12 陰性患者(P＜0.05)。見表3, 圖1, 圖2。

圖1 c-Myc 陽性和c-Myc 陰性患者的生存率比較

圖2 CDK12 陽性和CDK12 陰性患者的生存率比較

表3 胃癌組織中c-Myc、CDK12 陽性表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系［n(%)］

3 討論

胃癌的發(fā)生是由多基因、多因素共同作用的結(jié)果,其與腌制食品、高鹽飲食、吸煙及幽門螺桿菌(Hp)感染等有關(guān)［8］。c-Myc 基因是細(xì)胞核內(nèi)的癌基因, 可在細(xì)胞周期的不同階段誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡, 刺激細(xì)胞增生, 細(xì)胞所處生長環(huán)境及細(xì)胞接受的信號(hào)類型對(duì)細(xì)胞增殖凋亡方向起著關(guān)鍵性作用。c-Myc 表達(dá)異?？赡苁菒盒阅[瘤發(fā)生的重要原因。研究證實(shí), c-Myc 在肺癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá), 可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化、增殖及血管生成, 增加腫瘤向惡性轉(zhuǎn)變和進(jìn)一步擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)［9］。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn), 胃癌發(fā)病早期組織中的c-Myc 表達(dá)較胃炎組織明顯提高［10］。本研究采用免疫組化法對(duì)胃癌組織中的c-Myc 表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè), 結(jié)果顯示, 胃癌組織、癌旁組織中c-Myc 陽性表達(dá)率分別為77.5%、13.8%, 胃癌組織中c-Myc 陽性表達(dá)率較高, 經(jīng)單因素分析顯示, c-Myc陽性表達(dá)率與分化程度、TNM 分期、病灶侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān), 其表達(dá)水平與患者年齡、性別無明顯關(guān)系。這一結(jié)果與黃國全等［11］報(bào)道基本相符, 說明c-Myc 表達(dá)可能與胃癌細(xì)胞侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)。CDK12 對(duì)細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性有調(diào)節(jié)作用, 并可修復(fù)受損傷的DNA, 參與細(xì)胞的分化過程。Ji 等［12］研究指出, CDK12 與卵巢癌和乳腺癌存在密切的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn), 如乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤患者存在CDK12 高表達(dá), 其隨著CDK12表達(dá)水平的升高, 患者腫瘤的侵襲能力也明顯增強(qiáng)［13-19］。本 組80 例 胃 癌 組 織 標(biāo) 本 中 有87.5% 的CDK12 陽性表達(dá)率, 明顯高于癌旁組織的15.0%, 說明CDK12 的表達(dá)水平可能與胃癌的發(fā)生、進(jìn)展有關(guān), 經(jīng)單因素分析發(fā)現(xiàn), CDK12 表達(dá)水平與癌組織的TNM 分期、分化程度、腫瘤侵襲深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān), 提示CDK12 表達(dá)水平可能在胃癌轉(zhuǎn)移和浸潤及進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用。另外, 本研究對(duì)患者生存期進(jìn)行隨訪研究, 結(jié)果顯示, c-Myc 陽性表達(dá)患者的3 年生存率明顯低于c-Myc 陰性表達(dá)患者, CDK12 陽性表達(dá)患者與CDK12 陰性表達(dá)患者3 年生存率比較也有相似的結(jié)果, 說明c-Myc 和CDK12 高表達(dá)可能對(duì)疾病的進(jìn)展及預(yù)后均有明顯的影響。而本研究對(duì)c-Myc、CDK12 在胃癌組織中的關(guān)系進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn), 兩者具有明顯的正相關(guān)性, 表明c-Myc、CDK12 可能在胃癌的發(fā)生、進(jìn)展過程中及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮相互協(xié)同、相互影響的作用, 但其具體作用機(jī)理并未明確, 需在后續(xù)研究中擴(kuò)大樣本量, 從分子學(xué)角度進(jìn)一步探討。

總之, c-Myc、CDK12 在胃癌組織中異常高表達(dá),兩者呈正相關(guān)性, 并與腫瘤的TNM 分期、分化程度、腫瘤侵襲深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān), 并對(duì)患者的預(yù)后有明顯影響, 可通過檢測(cè)兩者水平評(píng)估胃癌患者的預(yù)后。