張 季,楊 沙,羅玉航,侯 睿,馬新雨,朱小蘭*
(1.遵義市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)院,貴州 遵義 563099;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 四川現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院,四川 成都 611430;3.安捷倫科技(中國)有限公司成都分公司,四川 成都 610213)
“高溫制曲、高溫堆積發(fā)酵、高溫餾酒”的工藝特點(diǎn)造就了醬香型白酒“醬香突出、幽雅細(xì)膩、柔綿醇厚、回味悠長”的獨(dú)特風(fēng)味[1]。經(jīng)其特殊工藝制成的大曲含有豐富的微生物及酶類,釀酒原料中蛋白質(zhì)的酶降解、發(fā)酵過程中微生物的代謝產(chǎn)物和發(fā)酵完畢后微生物細(xì)胞的自溶是氨基酸生成的重要途徑[2]。白酒中的氨基酸既是微生物生長所需的重要營養(yǎng)物質(zhì),又是白酒中風(fēng)味化合物的重要前體,與高級(jí)醇和酯類的生成密切相關(guān)[3],其本身可以呈現(xiàn)的風(fēng)味如酸、鮮、甜、苦等還會(huì)對(duì)白酒的風(fēng)味及口感產(chǎn)生重要影響[4],YIN H等[5]研究表明,可以通過添加氨基酸來修飾芳香化合物。此外,氨基酸等非揮發(fā)性的含氮化合物還具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化和降血壓等功能[4]。張莊英等[2]研究表明,醬香型白酒所含氨基酸種類最多;張巧玲等[3]建立非成對(duì)數(shù)據(jù)比較分析判別模型實(shí)現(xiàn)了對(duì)醬香型白酒大曲類別的有效判別;柳習(xí)月等[6]利用蛋白組學(xué)揭示了苯丙氨酸代謝對(duì)醬香大曲風(fēng)味的影響,研究表明,氨基酸的種類及含量對(duì)醬香型白酒的風(fēng)味特征具有重要影響。
氨基酸的檢測(cè)主要有薄層色譜法(thin layer chromatography,TLC)[7-8]、液相色譜法(liquid chromatography,LC)[9-10]、液質(zhì)聯(lián)用法(liquid chromatograph-mass spectrometer,LC-MS)[11-12]、氣相色譜法(gas chromatography,GC)[13]、氣質(zhì)聯(lián)用法(gaschromatography-massspectrometer,GC-MS)[14-16];非色譜分離方法有毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis,CE)法[17-18]。檢測(cè)方法包括質(zhì)譜(mass spectrometer,MS)和分光光度檢測(cè)器,如紫外(ultraviolet,UV)[19-20]、可見光(visible spectrophotometry,VIS)和熒光檢測(cè)(fluorescence detector,F(xiàn)LD)[21-22]。但由于其具有衍生物不穩(wěn)定、反應(yīng)條件繁瑣、操作時(shí)間長等問題,不利于氨基酸的快速分析[23]。目前,氨基酸檢測(cè)涉及標(biāo)準(zhǔn)主要有GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》[24]、GB/T 30987—2020《植物中游離氨基酸的測(cè)定》[25]、QB/T 4356—2012《黃酒中游離氨基酸的測(cè)定高效液相色譜法》[26]等,但沒有白酒中氨基酸的分析標(biāo)準(zhǔn),原因在于白酒中氨基酸的含量較低。已有相關(guān)研究方法利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法實(shí)現(xiàn)對(duì)紫薯[27]、瘧疾生物樣品[28]等的氨基酸快速檢測(cè),但針對(duì)白酒的報(bào)道較少。
本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)儀,建立了白酒中21種氨基酸含量的快速測(cè)定方法,并對(duì)其方法學(xué)進(jìn)行考察。旨在為實(shí)現(xiàn)白酒中氨基酸快速檢測(cè),適用于白酒樣品的快速分析。
40份白酒樣品(清香型白酒2份,濃香型白酒19份,醬香型白酒19份):市售。
甲醇、乙腈(均為質(zhì)譜純):美國杰帝貝柯公司;甲酸(質(zhì)譜純):安捷倫科技有限公司;甲酸銨和氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%):成都克洛瑪生物科技有限公司;正己烷、無水硫酸鈉(均為分析純):天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。
1290II-6470B超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀:安捷倫科技有限公司;ALC-210.4型電子天平:德國賽多利斯公司;KQ-500超聲儀:昆山市超聲儀器有限公司;Lab Dancer渦旋器:德國艾卡集團(tuán);Mini Spin Plus離心機(jī):德國艾本德公司。
1.3.1 白酒樣品預(yù)處理
取1.0 mL白酒樣品于1.5 mL離心管,12 000 r/min離心5 min,取上清液直接用于儀器分析。
1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液的制備:每種氨基酸各稱取10 mg,加入體積分?jǐn)?shù)60%的甲醇溶液10 mL,常溫條件下超聲溶解30 min,得到質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL儲(chǔ)備液。
混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:每種氨基酸儲(chǔ)備液各取100 μL至15 mL離心管,加入體積分?jǐn)?shù)70%的甲醇溶液至10 mL,得到質(zhì)量濃度為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。取混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用體積分?jǐn)?shù)70%的甲醇溶液依次稀釋,得到質(zhì)量濃度分別為10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL的溶液,用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.3.3 白酒樣品中氨基酸含量分析
(1)色譜條件
Agilent InfinityLabPoroshell 120 HILIC-Z色譜柱(2.1×100 mm,2.7 μm),柱溫40 ℃,流動(dòng)相A為20 mmol/L甲酸銨-水溶液(pH=3);B為20 mmol/L水相甲酸銨(pH=3),溶于乙腈∶水(9∶1,V/V)溶液,進(jìn)樣量0.5 μL,柱溫30 ℃,流速0.4 mL/min,梯度洗脫程序:0~11.5 min,100%B;11.5~11.6 min,70%~40%B;11.6~15 min,40%B。
(2)質(zhì)譜條件
電噴霧離子(electrospray ionization,ESI+)源,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring,MRM)模式,干燥氣溫度330 ℃,氣體流速13.0 L/min,霧化器35 psi,鞘氣溫度390 ℃,鞘氣流速12 L/min,毛細(xì)管電壓1 500 V,噴嘴電壓0 V,定性離子、定量離子見表1。
表1 氨基酸的定性離子和定量離子Table 1 Qualitative and quantitative ions of amino acids
氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖見圖1。由圖1可知,21種氨基酸可在15 min內(nèi)檢出,具有良好的分離能力及峰形。
圖1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of amino acid standards
2.2.1 氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限
以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),響應(yīng)值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程,計(jì)算檢出限(limit of detection,LOD)及定量限(limit of quantitation,LOQ),結(jié)果見表2。由表2可知,除賴氨酸外,所有化合物的線性相關(guān)系數(shù)R2均>0.995。21種氨基酸的檢出限范圍為0.1~8.0 ng/mL,定量限范圍為0.2~20.0 ng/mL。
表2 氨基酸的線性回歸方程、線性范圍、檢出限及定量限Table 2 Linear regression equation, linear range, detection limit and quantitation limit of amino acids
2.2.2 精密度試驗(yàn)
平行配制5份質(zhì)量濃度為100 ng/mL的溶液,每份進(jìn)樣1次,測(cè)定氨基酸的峰面積,并分別計(jì)算保留時(shí)間和峰面積結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)。結(jié)果見表3。
表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of precision experiments
由表3可知,21種氨基酸的保留時(shí)間RSD范圍為0.00~0.29%,峰面積RSD范圍為1.54%~10.33%,根據(jù)GB/T27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》中精密度規(guī)定,被測(cè)組分含量為100 μg/kg時(shí),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<15%,故本試驗(yàn)精密度良好。
2.2.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)
取某一酒樣,分別加入50 ng/mL、100 ng/mL和500 ng/mL氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液,同一樣品平行測(cè)定3次,其結(jié)果見表4。
表4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of adding standard recovery experiments
由表4可知,21種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品添加量為50 ng/mL、100 ng/mL時(shí),平均回收率為80.76%~119.28%,標(biāo)準(zhǔn)品添加量為500 ng/mL時(shí),平均回收率為93.55%~127.43%,根據(jù)GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》中回收率中規(guī)定,被測(cè)組分含量為1~100 μg/kg時(shí),回收率范圍為90%~110%,被測(cè)組分含量>100 μg/kg時(shí),回收率范圍為95%~105%,除個(gè)別氨基酸回收率略微偏離外,整體回收率較為滿意。
對(duì)40個(gè)白酒樣品的氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見圖2A。由圖2A可知,清香型白酒、濃香型白酒和醬香型白酒的氨基酸總含量分別為15.62~37.29 ng/mL、44.53~377.33 ng/mL和135.38~5 461.19 ng/mL,整體來說醬香型白酒中氨基酸含量比較高,含量最高的為貴州茅臺(tái)鎮(zhèn)的一個(gè)樣品,氨基酸總量為5 500 ng/mL。對(duì)所有的氨基酸含量求平均值,結(jié)果見圖2B。由圖2B可知,亮氨酸和丙氨酸的含量相對(duì)較高,含量分別為6.99~237.35 ng/mL和8.64~150.13 ng/mL。同樣香型的白酒中氨基酸的含量差異也很大,例如同是醬香型白酒,亮氨酸和丙氨酸的含量分別為48.92~1 159.09 ng/mL和15.85~786.83 ng/mL,最低和最高含量的差異為23.7和49.6倍。這表明白酒工藝的一致性還有待提升,需要一些先進(jìn)的技術(shù)手段還保證產(chǎn)品穩(wěn)定性,從而保證白酒的品質(zhì)。
圖2 不同香型白酒中氨基酸總含量(A)及其在不同白酒樣品中的平均含量(B)Fig.2 Total content of amino acids in different flavor Baijiu (A) and their average content in different Baijiu samples (B)
本研究通過液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀建立白酒中21種氨基酸含量的分析方法,能夠有效地對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分離,在質(zhì)量濃度為10~1000 ng/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)R2均>0.99,在質(zhì)量濃度為100 ng/mL時(shí),保留時(shí)間RSD和峰面積RSD分別為0~0.29%和1.54%~10.33%,檢出限和定量限范圍分為0.1~8.0 ng/mL和0.2~20 ng/mL,當(dāng)添加濃度分別為50 ng/mL、100 ng/mL和500 ng/mL時(shí),加標(biāo)回收率為80.76%~127.43%,該方法快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好,可實(shí)現(xiàn)白酒中未衍生化氨基酸的痕量分析,可用于白酒中氨基酸含量的準(zhǔn)確測(cè)定。通過對(duì)不同香型白酒進(jìn)行分析,結(jié)果表明,醬香型白酒中氨基酸的含量高于濃香型白酒,而清香型白酒幾乎不含氨基酸,該研究為白酒中高沸點(diǎn)風(fēng)味物質(zhì)分析技術(shù)的建立提供了參考。