張 季，楊 沙，羅玉航，侯 睿，馬新雨，朱小蘭*

（1.遵義市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測院，貴州 遵義 563099；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 四川現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院，四川 成都 611430；3.安捷倫科技（中國）有限公司成都分公司，四川 成都 610213）

“高溫制曲、高溫堆積發(fā)酵、高溫餾酒”的工藝特點造就了醬香型白酒“醬香突出、幽雅細(xì)膩、柔綿醇厚、回味悠長”的獨特風(fēng)味[1]。經(jīng)其特殊工藝制成的大曲含有豐富的微生物及酶類，釀酒原料中蛋白質(zhì)的酶降解、發(fā)酵過程中微生物的代謝產(chǎn)物和發(fā)酵完畢后微生物細(xì)胞的自溶是氨基酸生成的重要途徑[2]。白酒中的氨基酸既是微生物生長所需的重要營養(yǎng)物質(zhì)，又是白酒中風(fēng)味化合物的重要前體，與高級醇和酯類的生成密切相關(guān)[3]，其本身可以呈現(xiàn)的風(fēng)味如酸、鮮、甜、苦等還會對白酒的風(fēng)味及口感產(chǎn)生重要影響[4]，YIN H等[5]研究表明，可以通過添加氨基酸來修飾芳香化合物。此外，氨基酸等非揮發(fā)性的含氮化合物還具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化和降血壓等功能[4]。張莊英等[2]研究表明，醬香型白酒所含氨基酸種類最多；張巧玲等[3]建立非成對數(shù)據(jù)比較分析判別模型實現(xiàn)了對醬香型白酒大曲類別的有效判別；柳習(xí)月等[6]利用蛋白組學(xué)揭示了苯丙氨酸代謝對醬香大曲風(fēng)味的影響，研究表明，氨基酸的種類及含量對醬香型白酒的風(fēng)味特征具有重要影響。

氨基酸的檢測主要有薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）[7-8]、液相色譜法（liquid chromatography，LC）[9-10]、液質(zhì)聯(lián)用法（liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS）[11-12]、氣相色譜法（gas chromatography，GC）[13]、氣質(zhì)聯(lián)用法（gaschromatography-massspectrometer，GC-MS）[14-16]；非色譜分離方法有毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）法[17-18]。檢測方法包括質(zhì)譜（mass spectrometer，MS）和分光光度檢測器，如紫外（ultraviolet，UV）[19-20]、可見光（visible spectrophotometry，VIS）和熒光檢測（fluorescence detector，F(xiàn)LD）[21-22]。但由于其具有衍生物不穩(wěn)定、反應(yīng)條件繁瑣、操作時間長等問題，不利于氨基酸的快速分析[23]。目前，氨基酸檢測涉及標(biāo)準(zhǔn)主要有GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測定》[24]、GB/T 30987—2020《植物中游離氨基酸的測定》[25]、QB/T 4356—2012《黃酒中游離氨基酸的測定高效液相色譜法》[26]等，但沒有白酒中氨基酸的分析標(biāo)準(zhǔn)，原因在于白酒中氨基酸的含量較低。已有相關(guān)研究方法利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法實現(xiàn)對紫薯[27]、瘧疾生物樣品[28]等的氨基酸快速檢測，但針對白酒的報道較少。

本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）儀，建立了白酒中21種氨基酸含量的快速測定方法，并對其方法學(xué)進行考察。旨在為實現(xiàn)白酒中氨基酸快速檢測，適用于白酒樣品的快速分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

40份白酒樣品（清香型白酒2份，濃香型白酒19份，醬香型白酒19份）：市售。

甲醇、乙腈（均為質(zhì)譜純）：美國杰帝貝柯公司；甲酸（質(zhì)譜純）：安捷倫科技有限公司；甲酸銨和氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）：成都克洛瑪生物科技有限公司；正己烷、無水硫酸鈉（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1290II-6470B超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀：安捷倫科技有限公司；ALC-210.4型電子天平：德國賽多利斯公司；KQ-500超聲儀：昆山市超聲儀器有限公司；Lab Dancer渦旋器：德國艾卡集團；Mini Spin Plus離心機：德國艾本德公司。

1.3 方法

1.3.1 白酒樣品預(yù)處理

取1.0 mL白酒樣品于1.5 mL離心管，12 000 r/min離心5 min，取上清液直接用于儀器分析。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)品儲備溶液的制備：每種氨基酸各稱取10 mg，加入體積分?jǐn)?shù)60%的甲醇溶液10 mL，常溫條件下超聲溶解30 min，得到質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL儲備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：每種氨基酸儲備液各取100 μL至15 mL離心管，加入體積分?jǐn)?shù)70%的甲醇溶液至10 mL，得到質(zhì)量濃度為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。取混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用體積分?jǐn)?shù)70%的甲醇溶液依次稀釋，得到質(zhì)量濃度分別為10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL的溶液，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 白酒樣品中氨基酸含量分析

（1）色譜條件

Agilent InfinityLabPoroshell 120 HILIC-Z色譜柱（2.1×100 mm，2.7 μm），柱溫40 ℃，流動相A為20 mmol/L甲酸銨-水溶液（pH=3）；B為20 mmol/L水相甲酸銨（pH=3），溶于乙腈∶水（9∶1，V/V）溶液，進樣量0.5 μL，柱溫30 ℃，流速0.4 mL/min，梯度洗脫程序：0～11.5 min，100%B；11.5～11.6 min，70%～40%B；11.6～15 min，40%B。

（2）質(zhì)譜條件

電噴霧離子（electrospray ionization，ESI+）源，多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，干燥氣溫度330 ℃，氣體流速13.0 L/min，霧化器35 psi，鞘氣溫度390 ℃，鞘氣流速12 L/min，毛細(xì)管電壓1 500 V，噴嘴電壓0 V，定性離子、定量離子見表1。

表1 氨基酸的定性離子和定量離子Table 1 Qualitative and quantitative ions of amino acids

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分析

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖見圖1。由圖1可知，21種氨基酸可在15 min內(nèi)檢出，具有良好的分離能力及峰形。

圖1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of amino acid standards

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計算檢出限（limit of detection，LOD）及定量限（limit of quantitation，LOQ），結(jié)果見表2。由表2可知，除賴氨酸外，所有化合物的線性相關(guān)系數(shù)R2均＞0.995。21種氨基酸的檢出限范圍為0.1～8.0 ng/mL，定量限范圍為0.2～20.0 ng/mL。

表2 氨基酸的線性回歸方程、線性范圍、檢出限及定量限Table 2 Linear regression equation, linear range, detection limit and quantitation limit of amino acids

2.2.2 精密度試驗

平行配制5份質(zhì)量濃度為100 ng/mL的溶液，每份進樣1次，測定氨基酸的峰面積，并分別計算保留時間和峰面積結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。結(jié)果見表3。

表3 精密度試驗結(jié)果Table 3 Results of precision experiments

由表3可知，21種氨基酸的保留時間RSD范圍為0.00～0.29%，峰面積RSD范圍為1.54%～10.33%，根據(jù)GB/T27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》中精密度規(guī)定，被測組分含量為100 μg/kg時，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜15%，故本試驗精密度良好。

2.2.3 加標(biāo)回收率試驗

取某一酒樣，分別加入50 ng/mL、100 ng/mL和500 ng/mL氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，同一樣品平行測定3次，其結(jié)果見表4。

表4 加標(biāo)回收率試驗結(jié)果Table 4 Results of adding standard recovery experiments

由表4可知，21種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品添加量為50 ng/mL、100 ng/mL時，平均回收率為80.76%～119.28%，標(biāo)準(zhǔn)品添加量為500 ng/mL時，平均回收率為93.55%～127.43%，根據(jù)GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》中回收率中規(guī)定，被測組分含量為1～100 μg/kg時，回收率范圍為90%～110%，被測組分含量＞100 μg/kg時，回收率范圍為95%～105%，除個別氨基酸回收率略微偏離外，整體回收率較為滿意。

2.3 樣品測定

對40個白酒樣品的氨基酸含量進行測定，結(jié)果見圖2A。由圖2A可知，清香型白酒、濃香型白酒和醬香型白酒的氨基酸總含量分別為15.62～37.29 ng/mL、44.53～377.33 ng/mL和135.38～5 461.19 ng/mL，整體來說醬香型白酒中氨基酸含量比較高，含量最高的為貴州茅臺鎮(zhèn)的一個樣品，氨基酸總量為5 500 ng/mL。對所有的氨基酸含量求平均值，結(jié)果見圖2B。由圖2B可知，亮氨酸和丙氨酸的含量相對較高，含量分別為6.99～237.35 ng/mL和8.64～150.13 ng/mL。同樣香型的白酒中氨基酸的含量差異也很大，例如同是醬香型白酒，亮氨酸和丙氨酸的含量分別為48.92～1 159.09 ng/mL和15.85～786.83 ng/mL，最低和最高含量的差異為23.7和49.6倍。這表明白酒工藝的一致性還有待提升，需要一些先進的技術(shù)手段還保證產(chǎn)品穩(wěn)定性，從而保證白酒的品質(zhì)。

圖2 不同香型白酒中氨基酸總含量（A）及其在不同白酒樣品中的平均含量（B）Fig.2 Total content of amino acids in different flavor Baijiu (A) and their average content in different Baijiu samples (B)

3 結(jié)論

本研究通過液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀建立白酒中21種氨基酸含量的分析方法，能夠有效地對目標(biāo)化合物進行分離，在質(zhì)量濃度為10～1000 ng/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均＞0.99，在質(zhì)量濃度為100 ng/mL時，保留時間RSD和峰面積RSD分別為0～0.29%和1.54%～10.33%，檢出限和定量限范圍分為0.1～8.0 ng/mL和0.2～20 ng/mL，當(dāng)添加濃度分別為50 ng/mL、100 ng/mL和500 ng/mL時，加標(biāo)回收率為80.76%～127.43%，該方法快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可實現(xiàn)白酒中未衍生化氨基酸的痕量分析，可用于白酒中氨基酸含量的準(zhǔn)確測定。通過對不同香型白酒進行分析，結(jié)果表明，醬香型白酒中氨基酸的含量高于濃香型白酒，而清香型白酒幾乎不含氨基酸，該研究為白酒中高沸點風(fēng)味物質(zhì)分析技術(shù)的建立提供了參考。