邱顯平，黃 橋，楊 靜，田 蕾，劉 英，林宜錦，關(guān)統(tǒng)偉*

（1.四川全興酒業(yè)有限公司，四川 成都 611637；2.西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；3.食品微生物四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610039）

中國(guó)白酒歷史悠久，內(nèi)涵豐富，是傳統(tǒng)文化的代表符號(hào)之一。由于生產(chǎn)原料、工藝以及地理環(huán)境的差異，中國(guó)白酒經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的發(fā)展和演變形成了以三大香型（濃香、醬香和清香）為主導(dǎo)的產(chǎn)業(yè)格局。其中，濃香型白酒以其芳香濃郁、綿柔甘冽、余味悠長(zhǎng)的風(fēng)格和口感深受消費(fèi)者的青睞，獨(dú)占市場(chǎng)鰲頭[1-2]。

濃香型白酒是以糧谷為原料，采用濃香大曲為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)泥窖固態(tài)發(fā)酵、固態(tài)蒸餾、陳釀、勾調(diào)而成[3]。其風(fēng)味物質(zhì)主要來(lái)自酒曲、原料及微生物發(fā)酵過(guò)程，其中微生物發(fā)酵是白酒風(fēng)味的主要來(lái)源[4]。如乳酸菌產(chǎn)生大量有機(jī)酸，芽孢桿菌（Bacillussp.）產(chǎn)生特殊的風(fēng)味成分，釀酒酵母（Saccharomyces）發(fā)酵產(chǎn)生酒精，而非釀酒酵母則負(fù)責(zé)代謝如酯類、酸類、高級(jí)醇類、醛類和萜烯類化合物[5-6]。因此，明確白酒發(fā)酵過(guò)程中相關(guān)微生物作用及其與特征風(fēng)味的關(guān)系對(duì)其品質(zhì)提升具有重要意義。而窖池是濃香型白酒發(fā)酵微生物主要來(lái)源之一，其四壁覆蓋的窖泥中擁有豐富的微生物資源，特別是細(xì)菌和古菌[7]。這些微生物經(jīng)過(guò)窖內(nèi)低氧、低pH、高乙醇等極端環(huán)境的長(zhǎng)期篩選，形成有益于濃香型白酒生香的群落結(jié)構(gòu)，與白酒品質(zhì)密切相關(guān)[8-9]。在無(wú)氧發(fā)酵過(guò)程中，窖泥和酒醅中的微生物借助固、液、氣三相系統(tǒng)相互擴(kuò)散和遷徙，該過(guò)程調(diào)控著窖池內(nèi)部的物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量代謝，最終決定了發(fā)酵的進(jìn)程和結(jié)果[10-11]。

一般認(rèn)為，窖池越老，酒質(zhì)越好[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，與新窖泥相比，老窖泥中更豐富的菌屬組成形成了完整的窖泥菌群代謝網(wǎng)絡(luò)[13]。老窖泥中更加豐富的瘤胃菌科（Ruminococcaceae）和梭菌屬（Clostridium）[14]，可以降解乳酸生成己酸、丁酸和乙酸等；沉積物棒菌屬（Sedimentibacter）和氨基酸桿狀菌屬（Aminobacterium）[15]可以降解氨基酸生成乙酸和丁酸等；互養(yǎng)單胞菌屬（Syntrophomonas）[16]可以降解中鏈的脂肪酸形成乙酸和丙酸等。老窖泥中各類微生物相互作用，形成完整的窖泥菌群代謝鏈，其豐富的微生物群落也使得其生產(chǎn)的濃香型白酒風(fēng)味更佳，品質(zhì)更好。目前，對(duì)于窖池的探索更多的集中在不同窖齡或不同空間位置窖泥中微生物群落結(jié)構(gòu)的演替與區(qū)別[17-18]，以及窖泥中微生物群落與理化指標(biāo)的相關(guān)性研究[19]，對(duì)于新、老窖池中發(fā)酵酒醅微生物群落演替規(guī)律差異性研究較少。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)解析成都市某酒廠濃香型白酒酒醅在新、老窖池發(fā)酵過(guò)程中的微生物群落動(dòng)態(tài)演替特征以及多樣性組成，以期為濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程微生態(tài)研究提供更多的有益信息，同時(shí)也為認(rèn)識(shí)不同窖齡對(duì)濃香型酒醅微生物群落的具體影響提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

酒醅樣品：成都某酒業(yè)有限公司，發(fā)酵周期為95 d。

1.1.2 試劑

Power SoilR脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）分離試劑盒：美國(guó)MO Bio Laboratories公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）純化試劑盒：日本TaKaRa公司；Illumina TruSeq DNA樣品制備LT試劑盒：美國(guó)Life公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Pico-21臺(tái)式離心機(jī)：美國(guó)Thermo Fisher公司；GL-88B旋渦混合器：海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；3614 ZONKIA USTC Zonkia低速離心機(jī)：安徽科學(xué)儀器有限公司；TND03-H-H均勻型干式恒濕器：深圳拓能達(dá)科技有限公司；DYCZ-21電泳槽：北京市六一儀器廠；Qubit2.0熒光儀：新加坡Invitrogen公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集方法

從新（S組）、老窖池（T組）中采集濃香型白酒酒醅樣品，新、老窖池分別經(jīng)過(guò)了6年和30年的連續(xù)使用。為了滿足生物學(xué)重復(fù)，每組樣本由隨機(jī)選擇的3個(gè)平行窖池組成。依據(jù)發(fā)酵溫度的變化過(guò)程，分別在發(fā)酵第0、7、15、25、45、70和95天收集酒醅樣本，每個(gè)窖池樣本由6個(gè)子樣本（每個(gè)子樣本200 g）均勻混合而成（圖1）。新窖池樣品編號(hào)為S0、S7、S15、S25、S45、S70、S95，老窖池樣品編號(hào)為T(mén)0、T7、T15、T25、T45、T70、T95。酒醅樣本的采集和運(yùn)輸過(guò)程遵循無(wú)菌原則，樣本保存在-80 ℃保存條件下備用。

圖1 酒醅樣品采樣示意圖Fig.1 Sampling diagram of fermented grains

1.3.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增與Illumina Miseq高通量測(cè)序

稱取酒醅樣品6 g，根據(jù)Power SoilRDNA分離試劑盒的操作說(shuō)明提取基因組DNA，以其為模板，采用包含barcode的引物對(duì)338F/806R和ITS1F/ITS2R[20]分別PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S DNA V3-V4和真菌ITS1的高變區(qū)基因序列，PCR擴(kuò)增條件及體系參考TAN Y W等[21]的方法。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化，并根據(jù)Illumina TruSeq DNA樣品制備LT試劑盒的說(shuō)明書(shū)構(gòu)建文庫(kù)，最后在Illumina Miseq（PE2500）平臺(tái)上機(jī)測(cè)序。原始數(shù)據(jù)保存在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為PRJNA622890。

1.3.3 序列處理

原始序列通過(guò)QIIME pipeline（v.1.8.0）進(jìn)行處理[22]：①序列解復(fù)用，去除標(biāo)簽、引物和接頭序列；②過(guò)濾序列長(zhǎng)度＜110 bp、模糊堿基＞2以及平均得分＜30的低質(zhì)量序列；③使用Uchime評(píng)估并去除嵌合體；④經(jīng)過(guò)Uclust將過(guò)濾后的高質(zhì)量序列按照最小置信閾值（0.97）聚類成不同的操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）；最后，排除可能是葉綠體或線粒體的序列，并計(jì)算相應(yīng)的Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)（按照最低序列數(shù)進(jìn)行歸一化處理）。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）中的Duncan檢驗(yàn)計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)的組間差異；采用基于Bray-Curtis距離系數(shù)的主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA）比較新、老窖池發(fā)酵過(guò)程中微生物群落的組成和結(jié)構(gòu)差異，并使用相似性分析（analysis of similarities，ANOSIM）檢驗(yàn)顯著性；通過(guò)計(jì)算屬間的Spearman等級(jí)關(guān)聯(lián)度揭示微生物群落之間的關(guān)系，為了降低網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性，只有顯著的相關(guān)性（P＜0.05）才被認(rèn)為是有效的相關(guān)性。通過(guò)Gephi對(duì)微生物之間的相互關(guān)系進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 新、老窖池濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中酒醅微生物菌群的α-多樣性分析

α-多樣性是能夠反映特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)生物豐富度和多樣性的綜合指標(biāo)[21]。新、老窖池濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中酒醅樣品微生物菌群的α-多樣性見(jiàn)圖2。由圖2可知，整體而言，兩組窖池濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中酒醅樣品微生物菌群的α-多樣性呈先增后減的變化趨勢(shì)，并且細(xì)菌菌群的豐富度和多樣性都遠(yuǎn)高于真菌菌群。在發(fā)酵前7 d，細(xì)菌和真菌菌群的α-多樣性都有大幅度的提高，表明大量的微生物開(kāi)始復(fù)蘇增殖。在新窖池組中，細(xì)菌和真菌菌群的多樣性分別在第7天和第15天達(dá)到最高，估計(jì)物種的總數(shù)分別為703種和116種。相比之下，老窖池組中細(xì)菌和真菌菌群的多樣性要明顯低于新窖池組。值得注意的是，老窖池組中細(xì)菌菌群多樣性的增長(zhǎng)趨勢(shì)要滯后于新窖池組，而真菌菌群則呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。在發(fā)酵70～95 d微生物菌群α-多樣性降低，推測(cè)是因?yàn)榘l(fā)酵后期酒醅中乙醇含量和酸度過(guò)高，而有機(jī)物與氧含量過(guò)低所致[23]。

圖2 新、老窖池濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌（A）與真菌（B）菌群的α-多樣性分析結(jié)果Fig.2 Analysis results of α-diversity of bacteria (A) and fungi (B) during strong-flavor Baijiu fermentation in new and old pits

2.2 新、老窖池濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中酒醅微生物群落差異

在了解新、老窖池組內(nèi)微生物菌群多樣性的基礎(chǔ)上，通過(guò)PCoA比較新、老窖池濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中酒醅樣品組間微生物群落的多樣性，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 基于Bray-Curtis距離系數(shù)新、老窖池酒醅樣品細(xì)菌（A）和真菌（B）菌群的主坐標(biāo)分析結(jié)果Fig.3 Principal coordinate analysis results of bacterial (A) and fungal (B) communities in fermented grains samples of new and old pits based on Bray-Curtis distance coefficient

由圖3可知，整體而言，細(xì)菌群落的動(dòng)態(tài)演替在新、老窖池濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中高度相似。兩組酒醅樣品在PCoA坐標(biāo)空間中沒(méi)有形成明顯的聚集，說(shuō)明細(xì)菌群落在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程都處在不斷的演替之中，而且發(fā)酵前期的結(jié)構(gòu)變化較大，而后期則趨于穩(wěn)定。相比之下，真菌群落的演替在兩組窖池濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中有明顯的差異，形成各自的集簇。盡管如此，兩組窖池發(fā)酵酒醅樣品S0、T0的細(xì)菌和真菌菌群在PCoA坐標(biāo)空間相互接近或重合，說(shuō)明發(fā)酵初始酒醅樣本中細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)十分相似，這可能歸因于新、老窖池入池的初始糟醅是一樣的結(jié)果所致[24]。

2.3 新、老窖池濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中酒醅微生物群落的組成及其動(dòng)態(tài)演替特征

2.3.1 細(xì)菌群落組成及動(dòng)態(tài)演替特征

在目和屬水平，新、老窖池濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中酒醅細(xì)菌群落組成見(jiàn)圖4，本研究將在某一樣品中相對(duì)豐度＞1%的微生物定義為優(yōu)勢(shì)微生物。由圖4A可知，新、老窖池濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中具有高度相似的種群動(dòng)態(tài)。乳桿菌目（Lactobacillales）、腸桿菌目（Enterobacteriales）和芽孢桿菌目（Bacillales）是新、老窖池酒醅樣品S0、T0中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌目。但是，這些優(yōu)勢(shì)細(xì)菌目在發(fā)酵進(jìn)行的前7天逐漸被厭氧繩菌目（Anaerolineales）、擬桿菌目（Bacteroidales）以及其他迅速增殖的類群所取代，這一動(dòng)態(tài)過(guò)程代表了發(fā)酵早期（0～7 d）細(xì)菌群落的演替模式（方向）。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，乳桿菌目的相對(duì)豐度逐漸回升并在中后期成為最主要的類群，這期間其他所有類群的相對(duì)豐度都呈連續(xù)下降趨勢(shì)。厭氧繩菌目和擬桿菌目維持其優(yōu)勢(shì)地位直到發(fā)酵進(jìn)行的第25天左右，隨后相對(duì)豐度進(jìn)一步下降至1%以下。值得注意的是，乳桿菌目在新窖池組中的增長(zhǎng)趨勢(shì)要明顯快于老窖池組，乳桿菌目是乳酸和醋酸等有機(jī)酸的主要生產(chǎn)者[25]，所形成的酸脅迫可能會(huì)抑制酸敏感類群的微生物正常生長(zhǎng)，如芽孢桿菌屬（Bacillus），而其中的蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）是重要的己酸產(chǎn)生菌[26]，這也可能是導(dǎo)致新窖池己酸乙酯含量偏低的一個(gè)主要因素。此外，其他優(yōu)勢(shì)細(xì)菌目還包括梭菌目（Clostridiales）（0.1%～6.6%）、假單胞菌目（Pseudomonadales）（0.2%～6.8%）、甲基球菌目（Methylococcales）（0～4.5%）、β變形桿菌目（Betaproteobacteriales）（0～3.0%）和微球菌目（Micrococcales）（0～4.5%）。這些類群大都在第7天大量出現(xiàn)，并隨著發(fā)酵進(jìn)行而逐漸減少。其中，梭菌目、假單胞菌目和甲基球菌目的相對(duì)豐度在老窖池組的發(fā)酵過(guò)中普遍高于新窖池組。有研究表明，梭菌目的相對(duì)豐度隨著窖齡的增加而增加，而梭狀芽孢桿菌（如科氏梭菌（Clostridium kluyveri））可以利用乙醇和乙酸產(chǎn)生己酸，是重要的己酸菌之一[27]，這可能會(huì)使得老窖生產(chǎn)的濃香型白酒含有更高的己酸乙酯。

圖4 基于目（A）和屬水平（B）新、老窖池濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中酒醅細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Dynamic changes of bacterial community structure in fermented grains during strong-flavor Baijiu fermentation in new and old pits based on order(A)and genus level(B)

由圖4B可知，乳桿菌屬（Lactobacillus）（1.05%～91.24%）是乳桿菌目的代表菌屬，也是發(fā)酵過(guò)程中最具優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌類群，該菌屬相對(duì)豐度的變化趨勢(shì)與乳桿菌目基本一致。有研究表明，乳桿菌屬（Lactobacillus）在發(fā)酵后期很大程度上主導(dǎo)了細(xì)菌群落的演替過(guò)程[28]。除此之外，乳桿菌目中的魏斯氏菌屬（Weissella）（0.07%～17.57%）和片球菌屬（Pediococcus）（0.01%～11.31%）只在酒醅樣本S0、T0中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，并且魏斯氏菌屬在酒醅樣品T0（17.57%）中的相對(duì)豐度要顯著高于S0（12.08%）。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，兩者的相對(duì)豐度都呈連續(xù)下降的趨勢(shì)。有研究發(fā)現(xiàn)，窖池發(fā)酵前期出現(xiàn)的Weissella、Pediococcus和部分Lactobacillus菌株能夠快速產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸，從而降低發(fā)酵體系的pH，抑制雜菌生長(zhǎng)，代謝產(chǎn)生的二氧化碳則有助于維持發(fā)酵體系的厭氧環(huán)境，為后期乳酸菌的生長(zhǎng)創(chuàng)造了有利的環(huán)境[29]。然而，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，白酒發(fā)酵體系的酸度、乙醇濃度增加，含氧量降低，這些乳酸菌的生長(zhǎng)受到了抑制而逐漸衰亡，直到消失，繼而出現(xiàn)更耐酸、耐高濃度乙醇、耐低含氧量的乳酸菌完成后續(xù)發(fā)酵過(guò)程[30]。在芽孢桿菌目（Bacillales）中芽孢桿菌屬（Bacillus）（0.27%～13.42%）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）（0.06%～9.15%）的相對(duì)豐度在酒醅樣品T0中也顯著高于S0，前者的相對(duì)豐度在發(fā)酵前25天內(nèi)都＞1%。Kosakonia（0.01%～21.18%）和泛菌屬（Pantoea）（0.01%～10.78%）是腸桿菌目中的優(yōu)勢(shì)代表，其中，泛菌屬在酒醅樣品S0中的相對(duì)豐度（10.78%）顯著高于T0（3.79%）。目前對(duì)泛菌屬的研究主要集中在醫(yī)療與疾病方面，在白酒中還少有報(bào)道。有研究表明，泛菌屬能夠有效降解鄰苯二甲酸酯[31]，有助于控制白酒安全，但其對(duì)風(fēng)味的具體影響還需繼續(xù)挖掘。除上述優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬之外，其他優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬還包括Proteiniphilum（0～4.69%）、假單胞菌屬（Pseudomonas）（0.02%～3.08%）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）（0.01%～4.17%）、擬桿菌屬（Bacteroides）（0.05%～1.37%）、厭氧粘菌屬（Anaeromyxobacter）（0～1.72%）、Fermentimonas（0～1.88%）、Saccharofermentans（0～1.14%）、互營(yíng)菌屬（Syntrophus）（0～1.07%）、黃桿菌屬（Flavobacterium）（0～1.48%）、Longilinea（0～2.9%）等。黃桿菌屬在土壤中廣泛發(fā)現(xiàn)，但是在白酒酒醅中極少被鑒定為優(yōu)勢(shì)菌屬，其具有高產(chǎn)α-淀粉酶能力，有利于原料中淀粉的利用[32]。綜上，新、老窖池濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中酒醅細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的演替較為相似。

2.3.2 真菌群落的多樣性及動(dòng)態(tài)演替特征

在目和屬水平，新、老窖池濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中酒醅真菌群落的組成見(jiàn)圖5。

圖5 基于目水平（A）和屬水平（B）新、老窖池濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中酒醅真菌群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化Fig.5 Dynamic changes of fungal community structure in fermented grains during strong-flavor Baijiu fermentation in new and old pits based on order (A) and genus level (B)

由圖5A可知，真菌群落的演替特征主要表現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)類群散囊菌目（Eurotiales）向酵母菌目（Saccharomycetales）的過(guò)渡，且這種過(guò)渡演替的速率在新、老窖池濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中存在顯著差異。在新窖池組中，酵母菌目的相對(duì)豐度在7 d內(nèi)從最初的30.58%上升至83.47%，對(duì)應(yīng)的散囊菌目相對(duì)豐度從61.24%下降至8.75%。然而，相似過(guò)程在老窖池組中在發(fā)酵第25天才完成。除此之外，毛霉目（Mucorales）是發(fā)酵前期的優(yōu)勢(shì)真菌目之一（5.24%～9.12%），并且在老窖池組中的相對(duì)豐度顯著高于新窖池組（P＜0.05）。毛霉代謝形成亞油酸乙酯和油酸乙酯，亞油酸乙酯具有花果的香氣，使酒體結(jié)構(gòu)更加豐滿，有研究表明，油酸乙酯是茅臺(tái)空杯香的主要物質(zhì)，并且油酸乙酯也是鑒定不同窖齡白酒的重要標(biāo)記物[33-34]。相反，絲孢酵母目（Trichosporonales）在新窖池組的相對(duì)豐度要普遍高于老窖池組，這可能就是新窖池的出酒率高于老窖池的主要原因。寡囊盤(pán)菌目（Thelebolales）在整個(gè)發(fā)酵階段含量比較少（相對(duì)豐度＜0.5%），僅在老窖池組的中后期（45～70 d）短暫的成為優(yōu)勢(shì)真菌目（4.35%～8.62%）。寡囊盤(pán)菌目與白酒相關(guān)性的研究十分少見(jiàn)，但在有關(guān)土壤的研究中發(fā)現(xiàn)其與纖維素降解密切相關(guān)[35]。

由圖5B可知，在新、老窖池濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中，哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）（0.01%～79.33%）和釀酒酵母屬（Saccharomyces）（0～23.50%）是酵母的代表類群。在宜賓的濃香型白酒產(chǎn)區(qū)中發(fā)現(xiàn)的酵母代表類群除這兩類外，還包括拜氏接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）與林生地霉（Geotrichum silvicola）[36]。在發(fā)酵前7 d時(shí)，哈薩克斯坦酵母屬經(jīng)歷爆發(fā)式增長(zhǎng)，另外老窖池組在發(fā)酵25～95 d時(shí)哈薩克斯坦酵母屬的相對(duì)豐度要明顯高于新窖池組。而釀酒酵母屬僅在新窖池組的發(fā)酵過(guò)程中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位。已有研究表明，哈薩克斯坦酵母屬能夠在乳酸發(fā)酵過(guò)程中同化乳酸，并水解葡萄糖醛糖苷作為異型發(fā)酵乳酸菌的代謝底物，促進(jìn)其利用果糖產(chǎn)乙酸[37]，到目前為止，哈薩克斯坦酵母屬只有少數(shù)幾個(gè)種的代謝特性被表征。JOOD I等[38]研究發(fā)現(xiàn)，哈薩克斯坦酵母屬的部分菌種具有積極的風(fēng)味特性，但其發(fā)酵力要弱于釀酒酵母（Saccharomyces）。初步推測(cè)這是新窖池的產(chǎn)酒量較高，而老窖風(fēng)味更優(yōu)的原因之一。曲霉屬（Aspergillus）（1.42%～41.20%）和嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）（0.06%～37.06%）隨著發(fā)酵的進(jìn)行持續(xù)下降，且在老池組的相對(duì)豐度普遍高于新窖池組。曲霉屬（Aspergillus）是諸多胞外酶（如淀粉酶和糖化酶）的主要貢獻(xiàn)者，參與大分子物質(zhì)的降解代謝，有利于白酒發(fā)酵的進(jìn)行[39]。此外，老窖池組中假散囊菌屬（Pseudeurotium）在發(fā)酵25～70 d呈現(xiàn)爆發(fā)式增長(zhǎng)，相對(duì)豐度顯著高于新窖池組。Apiotrichum（0～4.81%）則在新窖池組發(fā)酵的25～95 d有明顯優(yōu)勢(shì)，相對(duì)豐度高于老窖池組。其他優(yōu)勢(shì)真菌屬還包括絲孢酵母（Trichosporon）（0.11%～4.08%）、青霉屬（Penicillium）（0～3.24%）、德巴利酵母屬（Debaryomyces）（0～7.54%）、復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）（0.01%～0.45%）、畢赤酵母（Pichia）（0.01%～1.46%）和Naumovozyma（0～1.97%）。之前有研究從冰葡萄汁中分離獲得德巴利酵母菌，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)糖、SO2、乙醇和酸均有較強(qiáng)的耐受性，可作為冰酒釀造的菌株[40]，另外德巴利酵母能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)D-阿拉伯糖醇顯著改善酒精飲品的品質(zhì)[41]，但其在白酒發(fā)酵的相關(guān)研究中少有報(bào)道，值得深入挖掘。綜上，新、老窖池濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中酒醅真菌群落結(jié)構(gòu)的演替差異較大。

2.3.3 微生物間的相關(guān)性與穩(wěn)定性分析

有研究表明，微生物代謝物的多樣化與其復(fù)雜多樣相互作用有關(guān)，而微生物間相互作用則與微生物的演替與多樣性相關(guān)[20]。采用基于Spearman等級(jí)相關(guān)性的共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)分析評(píng)估新、老窖池組優(yōu)勢(shì)微生物屬的相互作用關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，在新、老窖池組中分別得到62和56個(gè)有效的連接節(jié)點(diǎn)，以及158和234對(duì)穩(wěn)定的相關(guān)關(guān)系。與新窖池組的網(wǎng)絡(luò)分析相比，老窖池組的微生物網(wǎng)絡(luò)具有更高的聚集程度，微生物群落的共存關(guān)系更加復(fù)雜，穩(wěn)定性更高，并且細(xì)菌之間的聯(lián)系會(huì)比真菌更加緊密。另外發(fā)現(xiàn)同一種微生物在新、老窖池中表現(xiàn)出不同的相關(guān)性，如在新窖池中Aspergillus僅與Kazachstania呈現(xiàn)顯著相關(guān)性（P＜0.05），但在老窖池中Aspergillus與Lactobacillus、Saccharomyces、Bacteroides等微生物均呈現(xiàn)顯著相關(guān)（P＜0.05）。之前有研究表明，環(huán)境會(huì)影響微生物代謝從而改變微生物之間的相互作用[8]。窖池微生物群在窖池環(huán)境長(zhǎng)時(shí)間的篩選下，不斷適應(yīng)窖池環(huán)境，形成更加穩(wěn)定的群落結(jié)構(gòu)。

圖6 新（A）、老（B）窖池濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中酒醅優(yōu)勢(shì)微生物屬網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果Fig.6 Network analysis results of dominant microbial genera in fermented grains during strong-flavor Baijiu fermentation in new (A) and old (B) pits

3 結(jié)論

本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)分析酒醅的微生物群落演替與組成結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，老窖池中酒醅樣品的細(xì)菌和真菌菌群多樣性較低，且細(xì)菌菌群多樣性的增長(zhǎng)趨勢(shì)也要滯后于新窖池，而真菌菌群多樣性相反。新、老窖池酒醅樣品中的真菌群落組成及演替規(guī)律存在明顯差異，而細(xì)菌群落較為相似。老窖池酒醅樣品中，曲霉屬（Aspergillus）與哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）的相對(duì)豐度更高，而在新窖池酒醅樣品中釀酒酵母（Saccharomyces）更具優(yōu)勢(shì)。通過(guò)相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，隨著窖池使用時(shí)間的增加，窖池中酒醅的微生物互作網(wǎng)絡(luò)具有更高的聚集程度，微生物群落的共存關(guān)系也更加復(fù)雜，穩(wěn)定性更高。后期研究中還需結(jié)合全基因組測(cè)序與代謝組學(xué)分析，進(jìn)一步探究這些差異性菌株對(duì)濃香型白酒風(fēng)味的影響機(jī)制，從而更好的為濃香型白酒的高質(zhì)量發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。