吳江雷 劉先華 黃 勝

江西省湖口縣人民醫(yī)院 1 消化內(nèi)科 2 檢驗科 332599

肝硬化作為消化系統(tǒng)的慢性疾病,具有較高的發(fā)病率,但其起病隱匿,臨床早期可無特異性癥狀以及體征[1]。肝硬化可由各種病因?qū)е旅庖呦到y(tǒng)的慢性損害,臨床上多表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、乏力、食欲減退、消化不良等非特異性表現(xiàn)。腸道菌群是一個復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng),當(dāng)腸道菌群失衡時,會損害胃腸黏膜屏障的完整性,導(dǎo)致病菌及其產(chǎn)物進入肝臟,促進炎癥因子的釋放,加劇肝纖維化的發(fā)展[2]。從消化內(nèi)科的發(fā)展趨勢來看,腸道靶向微生物標(biāo)志物可作為肝炎疾病進展的有力診斷工具,靶向代謝組學(xué)具有特異性強、定量測序準(zhǔn)確、檢測靈敏度高等優(yōu)點,通過新一代的MS/MS質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù),可以更快地實現(xiàn)實時動態(tài)監(jiān)測,同時增強代謝產(chǎn)物的檢測數(shù)量[3-4]。但目前的研究大多存在于動物研究中[5],需通過大量的人類樣本研究,為臨床疾病預(yù)防提供理論支持。基于此,本研究考慮將靶向代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于乙型肝炎肝硬化患者的腸道菌群檢測中,探討其對病情評估以及預(yù)后判斷的臨床效果,推動消化內(nèi)科臨床研究水平的發(fā)展進步。

1 資料與方法

1.1 一般資料 經(jīng)我院倫理委員會審批同意后,選取2020年7月—2022年7月于我院確診的81例乙型肝炎肝硬化患者作為研究對象,根據(jù)肝硬化的病程發(fā)展將其分為代償期組45例與失代償期組36例,另選取同期于我院進行體檢的健康志愿者40例作為對照組。對照組:年齡23～60歲,平均年齡(45.89±7.02)歲,男29例,女11例。代償期組:年齡27～61歲,平均年齡(45.38±7.33)歲,男34例,女11例。失代償期組:年齡28～62歲,平均年齡(46.12±7.52)歲,男27例,女9例。三組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合乙型肝炎肝硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。(2)年齡18～65歲。(3)近1個月未使用抗生素藥物。(4)近1個月未服用腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑等胃腸道藥物。(5)對照組志愿者的身體各項檢查正常。(6)患者及家屬均知曉本研究并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)存在除乙型肝炎病毒外的其他病毒、細(xì)菌、真菌感染。(2)合并胃腸道疾病者。(3)哺乳期、孕期婦女。(4)存在特殊飲食習(xí)慣者,如素食者。(5)合并代謝性疾病患者。(6)合并肝腎功能損害患者。

1.2 方法 代償期組和失代償期患者均接受基礎(chǔ)的抗病毒治療。留取所有受試者治療結(jié)束時糞便標(biāo)本3～5g,置于-80℃冰箱保存待檢;樣本采集過程應(yīng)避免污染。統(tǒng)一對三組研究人員的糞便樣本進行腸道菌群檢測,根據(jù)細(xì)菌引物進行擴增,采用Illumina Miseq高通量測序方法進行腸道菌群測序,并提取高質(zhì)量DNA序列,采用物種分類學(xué)和分類單元聚類分析(Operational taxonomic unit,OTU)分析其群落結(jié)構(gòu)和Alpha指數(shù)。測量步驟:(1)提取DNA,完成后使用1%瓊脂糖凝膠電泳。(2)使用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)擴增儀(TransGen AP221-02:TransStart Fastpfu DNA Polymerase)進行擴增,擴增完成后在2%瓊脂糖中進行電泳檢測。(3)PCR產(chǎn)物熒光定量檢測。(4)Illumina PE250文庫構(gòu)建。對熒光定量檢測結(jié)果進行overlap關(guān)系拼接、質(zhì)控和過濾,完成后進行OTU聚類分析和物種分類學(xué)分析。在上述分析的基礎(chǔ)上,再根據(jù)菌群豐富度將乙型肝炎肝硬化患者分為高豐度組和低豐度組,對比兩組菌群豐富度與預(yù)后發(fā)展的相關(guān)性。

1.3 觀察指標(biāo) (1)菌群分類學(xué)組成:對比三組人員腸道內(nèi)所有菌群的分類學(xué)組成[7],門分類包括厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、酸桿菌門,屬分類包括雙歧桿菌屬、腸桿菌屬、布勞特氏菌屬、瘤胃菌屬、鏈球菌屬。(2)菌群多樣化指數(shù):根據(jù)Alpha多樣性反應(yīng)對比三組人員的腸道菌群情況[8],Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)反映腸道菌群豐富度,Shannon指數(shù)和simpson指數(shù)反映腸道菌群多樣性,腸道菌群失衡度參數(shù)(Cirrhosis dysbiosis index of genus,CDIG):CDIG指數(shù)=原籍有益菌群相對豐度(梭菌屬+梭菌屬)/非原籍有害菌屬相對豐度(嗜血桿菌屬+鏈球菌屬+羅斯氏菌屬+韋榮氏球菌屬)。(3)病情進展與腸道菌群的相關(guān)性:將三組人員的菌群屬水平與疾病進展進行相關(guān)性分析。(4)菌群豐度與預(yù)后發(fā)展的相關(guān)性:將肝硬化患者進行亞分組后,對比高豐度組和低豐度兩組患者的菌群豐度與預(yù)后發(fā)展的相關(guān)性,預(yù)后情況根據(jù)患者的疾病進展進行評定,代償期乙型肝炎肝硬化分為Ⅰ期和Ⅱ期。失代償期乙型肝炎肝硬化根據(jù)生化指標(biāo)以及病情嚴(yán)重程度分為A、B、C三級。兩組患者6個月后通過門診回訪,再次評定患者疾病發(fā)展情況,患者進展1級以上或發(fā)展為肝癌甚至死亡記為預(yù)后不良。預(yù)后不良率=(總例數(shù)-穩(wěn)定例數(shù))/總例數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 三組菌群分類學(xué)組成比較 門分類中, 三組人員腸道內(nèi)的主要菌群為厚壁菌門、放線菌門、變形菌門以及擬桿菌門,其中厚壁菌門占比更高;在屬水平上,對照組與兩組肝硬化患者的腸道微生物組成有所不同,兩組肝硬化患者較對照組雙歧桿菌占比有所下降,鏈球菌屬占比上升。詳見表1。

表1 三組菌群分類學(xué)組成比較

2.2 三組菌群多樣化指數(shù)比較 代償期組與失代償期組患者的豐富度指數(shù)Chao1、ACE以及CDIG指數(shù)均較對照組降低,且失代償期組降低更明顯(P<0.05),但三組患者的多樣性指數(shù)Shannon、simpson差異不明顯(P>0.05)。詳見表2。

表2 三組菌群多樣化指數(shù)比較

2.3 病情進展與腸道菌群的相關(guān)性分析 病情進展與Chao1、ACE以及CDIG指數(shù)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),與Shannon、simpson指數(shù)的無顯著相關(guān)性(P>0.05)。詳見表3。

表3 病情進展與腸道菌群的相關(guān)性分析

2.4 菌群豐度與預(yù)后發(fā)展的相關(guān)性分析 Kapian-Meier生存曲線分析顯示6個月后高豐度組預(yù)后良好效果高于低豐度組[Log Rank(Mantel-Cox)=7.014,P=0.008],詳見圖1。

圖1 菌群豐度與預(yù)后發(fā)展的相關(guān)性分析

3 討論

腸道菌群在生理狀況下可與機體維持平衡狀態(tài),保證人體正常、穩(wěn)定的代謝、免疫、防御功能,腸道菌群狀況與腸道免疫功能的和平共生關(guān)系保障著腸道吸收營養(yǎng)和限制細(xì)菌、病毒等通過門靜脈系統(tǒng)進入肝臟的有效作用[9]。生物標(biāo)志物可以反映機體的生理變化,提示某種特定物質(zhì)功能或結(jié)構(gòu)上的改變,而其提供的信息可用于早期疾病診斷、療效評價、預(yù)后評估中具有重要意義。在消化內(nèi)科的發(fā)展過程中,靶向腸道微生物標(biāo)志物可稱為病毒性肝炎發(fā)展診斷的有力工具。而靶向代謝組學(xué)技術(shù)作為代謝組學(xué)研究的重要組成部分,使得生物標(biāo)志物的檢測和代謝產(chǎn)物的量性分析成為可能,通過研究生物結(jié)構(gòu)、性質(zhì)相似的代謝產(chǎn)物,為相關(guān)疾病的研究提供高效的解決方法。

本研究發(fā)現(xiàn),腸道內(nèi)的主要菌群為厚壁菌門、放線菌門、變形菌門及擬桿菌門,其中厚壁菌門占比更高,在屬水平上,對照組與兩組肝硬化患者的腸道微生物組成有所不同,雙歧桿菌在三組中占比最高,但兩組肝硬化患者較對照組占比有所下降,鏈球菌屬占比上升,表示通過靶向代謝組學(xué)技術(shù)可較直觀地檢測出乙型肝炎肝硬化患者的腸道菌群的種類組成。隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的發(fā)展[10],代謝組學(xué)得以快速發(fā)展,靶向代謝組學(xué)作為其重要組成部分,靶向代謝組學(xué)的質(zhì)譜檢測技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于物質(zhì)檢測中。本研究中采用的串聯(lián)質(zhì)譜檢測可以更容易觀察腸道菌群的差異性,利于對相關(guān)毒性菌群的尋找,同時只需對樣本進行簡單的處理,即可直接進行樣本檢測。

本研究利用靶向代謝組學(xué)技術(shù)對肝硬化患者進行腸道菌群檢測發(fā)現(xiàn),兩組肝硬化患者的豐富度指數(shù)Chao1、ACE以及CDIG指數(shù)均低于對照組,其中失代償期組降低更加明顯,且疾病進展與Chao1、ACE以、CDIG指數(shù)呈正相關(guān),表明腸道菌群可用于肝硬化患者的病情評估。在調(diào)節(jié)腸壁內(nèi)外物質(zhì)運輸過程中,腸道屏障的完整性發(fā)揮著重要作用,當(dāng)腸道菌群失衡時,腸道黏膜屏障受損,病菌及其產(chǎn)物會進入門靜脈系統(tǒng),最終到達(dá)肝臟,激活肝臟免疫系統(tǒng),釋放促炎細(xì)胞因子,加劇肝纖維化的發(fā)展[11]。乙型肝炎肝硬化患者的腸道因受到病毒的侵害,導(dǎo)致腸道黏膜屏障不能有效阻止有毒菌群侵害肝臟,導(dǎo)致肝纖維化的進一步發(fā)展,加重疾病發(fā)展,因此病情越嚴(yán)重的患者,腸道菌群豐度就越低,腸道菌群失衡越嚴(yán)重。

本研究根據(jù)腸道菌群豐度將肝硬化患者進行亞分組后還發(fā)現(xiàn),低豐度組患者的預(yù)后不良率高于高豐度組,表示腸道菌群的豐度情況可用于肝硬化患者的預(yù)后判斷中。腸道菌群在正常生理狀況菌群豐度較高,肝硬化患者若不能及時糾正腸道菌群的豐富性,則會加重腸道菌群的失衡,導(dǎo)致疾病進展得越快。相關(guān)研究在肝衰竭患者的腸道微生物研究中也發(fā)現(xiàn),菌群豐度越低,疾病進展越迅速[12]。在今后的研究中應(yīng)以腸道菌群失衡治療作為肝硬化患者的研究方向,提供更安全、有效的防治方法,改善患者預(yù)后情況。

綜上所述,靶向代謝組學(xué)技術(shù)揭示了腸道菌群在肝硬化病情評估和預(yù)后判斷的有效作用,為臨床選擇生物標(biāo)志物和預(yù)防治療提供了可靠的數(shù)據(jù)支持。本研究的不足之處在于樣本量較小,且為單中心研究,研究普遍性受限,后期需進行多中心的大樣本研究,進一步驗證本研究結(jié)論。