楊 寒 寧 波

暨南大學(xué)附屬?gòu)V州紅十字會(huì)醫(yī)院神經(jīng)外科,廣東省廣州市 510220

膠質(zhì)瘤是一種常見(jiàn)的原發(fā)性中樞神經(jīng)惡性腫瘤,惡性程度非常高,5年生存率不足5%[1]。早期可通過(guò)手術(shù)切除,但手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)大,致殘率高。目前膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制尚不明確,治療方式存在很大缺陷,嚴(yán)重危害人們的健康。miRNA是一種分子大小約22個(gè)核苷酸的非編碼RNA, 研究發(fā)現(xiàn)部分miRNA對(duì)腫瘤具有抑制作用[2],miR-29a在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有重要作用,具有靶向治療腫瘤及作為腫瘤診斷標(biāo)記物的潛力[3]。研究發(fā)現(xiàn)miR-29a通過(guò)靶向PI3K/AKT/HIF-1α通路的負(fù)調(diào)控,減少糖酵解能量供應(yīng),從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖,從而增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡[4]。神經(jīng)叢蛋白A1(Plexin-A1)是一種跨膜蛋白受體,參與神經(jīng)細(xì)胞傳遞信息、器官發(fā)育、血管生成、腫瘤發(fā)生和免疫調(diào)節(jié)[5]。研究發(fā)現(xiàn)[6]Plexin-A1在腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)升高,且與腫瘤患者預(yù)后相關(guān)。近期的研究發(fā)現(xiàn),在腫瘤細(xì)胞中miR-29a與Plexin-A1存在靶向關(guān)系,但在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中兩者的關(guān)系尚不明確,本研究擬討論在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-29a與Plexin-A1的關(guān)系,探究膠質(zhì)瘤的分子機(jī)制,以期為治療膠質(zhì)瘤提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和主要試劑 人HEB細(xì)胞購(gòu)自豐暉生物科技有限公司、人U87細(xì)胞購(gòu)自上海美灣生物科技有限公司;miR-29a-3p擬合物和對(duì)照擬合物由廣州伯信生物科技有限公司提供。DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) Gibco公司;Lipofectamine 2000試劑購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司;總RNA提取試劑盒Magzol購(gòu)自上海邁跟生物科技有限公司。miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自廣州復(fù)能基因有限公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自翌圣生物科技(上海)股份有限公司。GAPDH和神經(jīng)叢蛋白A1抗體均由深圳市文樂(lè)生物科技有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染。人腦正常膠質(zhì)HEB細(xì)胞與膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞分別于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)條件為:溫度37℃、CO2濃度5%。細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%融合度時(shí)使用胰酶消化,按1∶3比例傳代,取生長(zhǎng)狀態(tài)良好,處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染或檢測(cè)。

1.2.2 qPCR法檢測(cè)HEB細(xì)胞與U87細(xì)胞中miR-29a和神經(jīng)叢蛋白A1 mRNA水平。使用Trizol試劑從HEB細(xì)胞與U87細(xì)胞中提取總 RNA,將miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性10min;94℃變性10s,60 ℃退火30s,72℃延伸20s,40個(gè)循環(huán)。miR-29a相對(duì)表達(dá)量以U6為內(nèi)參照,引物序列見(jiàn)表1,Plexin-A1以gadph為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法對(duì)細(xì)胞中 miR-29a和Plexin-A1 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量分析。每個(gè)樣本設(shè) 3 個(gè)副孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 引物序列

1.2.3 免疫印跡法檢測(cè)HEB細(xì)胞與U87細(xì)胞中Plexin-A1蛋白的表達(dá)。收集細(xì)胞,PSB清洗,裂解,提取細(xì)胞總蛋白,電泳后轉(zhuǎn)膜。加脫脂奶粉室溫密封2h。使用TBST洗滌,加GAPDH和Plexin-A1一抗(1∶1 000),在4 ℃溫度孵育過(guò)夜,加二抗IgG(1∶1 000)后在室溫下孵育21h,顯影、分析、計(jì)算。使用 ImageLab 圖像分析軟件,以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算Plexin-A1蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞。根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染細(xì)胞:將膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞分為3組,對(duì)照組不處理,miR-NC組轉(zhuǎn)染陰性mimic,miR-29a組轉(zhuǎn)染miR-29a-3p mimic。

1.2.5 qPCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后U87細(xì)胞中miR-29a水平。轉(zhuǎn)染后48h,收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),方法與前面相同。若測(cè)得對(duì)照組與miR-NC組miR-29a水平存在差異,則使用細(xì)胞重新轉(zhuǎn)染,若測(cè)得對(duì)照組與miR-NC組miR-29a水平無(wú)差異且miR-29a組miR-29a水平明顯升高,說(shuō)明轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)成功,選取miR-NC組與miR-29a組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 CCK8法檢測(cè)U87細(xì)胞增殖能力。收集轉(zhuǎn)染后的 U87細(xì)胞,以每孔104個(gè)細(xì)胞接種到96孔板中;37℃,5%CO2培養(yǎng)箱,分別于24h、48h、76h和98h每孔加入10μl CCK8溶液,繼續(xù)避光孵育1～2h,終止培養(yǎng);用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)U87細(xì)胞凋亡率。收集轉(zhuǎn)染后的 U87細(xì)胞接種于6孔板中,接種細(xì)胞密度為4×104/ml,每孔接種400μl/孔。在培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后,胰酶消化并離心去掉上清液,輕懸浮細(xì)胞后加入AnnexinV/FITC與PI溶液,混合后在室溫下避光孵育5min,使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.8 qPCR法和免疫印跡法檢測(cè)U87細(xì)胞中Plexin-A1 mRNA和蛋白水平。在轉(zhuǎn)染48h后,收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),方法同前。

2 結(jié)果

2.1 HEB細(xì)胞與U87細(xì)胞在miR-29a、Plexin-A1 mRNA及蛋白中的表達(dá)差異 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與HEB細(xì)胞相比,U87細(xì)胞中miR-29a低表達(dá)(t=12.54,P<0.001),而Plexin-A1的mRNA(t=3.693,P<0.05)及蛋白(t=4.426,P<0.05)均為高表達(dá),見(jiàn)圖1。說(shuō)明在膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中,miR-29a表達(dá)水平較正常膠質(zhì)細(xì)胞HEB細(xì)胞降低,Plexin-A1表達(dá)升高。

圖1 HEB細(xì)胞與U87細(xì)胞的miR-29a、Plexin-A1 mRNA及蛋白表達(dá)差異a. miR-29a表達(dá)量 b. Plexin-A1 mRNA表達(dá)量 c. Plexin-A1蛋白表達(dá)量 d.Plexin-A1蛋白條帶。*表示P<0.05;***表示P<0.001

2.2 miR-29a在U87細(xì)胞中的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染后,miR-29a細(xì)胞的miR-29a表達(dá)水平較陰性組顯著升高(t=32.23,P<0.001)且miR-NC組miR-29a水平較對(duì)照組未改變(t=1.216,P>0.05),說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功,見(jiàn)圖2。

圖2 miR-29a在U87細(xì)胞中的表達(dá)以及miR-29a對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響a.miR-29a轉(zhuǎn)染后U87細(xì)胞中miR-29a的表達(dá)差異 b.CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 c.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。ns表示P>0.05;*表示P<0.05;***表示P<0.001

2.3 miR-29a過(guò)表達(dá)抑制U87細(xì)胞增殖,促進(jìn)凋亡 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與miR-NC組相比,miR-29a的U87細(xì)胞增殖能力降低(t= 0.026 3,P<0.05);在48h時(shí),miR-29a的U87細(xì)胞的總凋亡率較陰性組增加6.52%(t=3.808,P<0.05),見(jiàn)圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明miR-29a抑制U87細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡。

2.4 miR-29a抑制U87細(xì)胞Plexin-A1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與陰性對(duì)照組相比,miR-29a細(xì)胞中Plexin-A1的mRNA(t=4.098,P<0.05)和蛋白質(zhì)表達(dá)均降低(t=8.483,P<0.01),見(jiàn)圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明miR-29a抑制了U87細(xì)胞Plexin-A1 mRNA和蛋白表達(dá)。

圖3 miR-29a抑制U87細(xì)胞Plexin-A1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)a.Plexin-A1 mRNA表達(dá)量 b.Plexin-A1 蛋白表達(dá)量 c.Plexin-A1蛋白條帶。*表示P<0.05;**表示P<0.01

3 討論

膠質(zhì)瘤是一種常見(jiàn)的中樞神經(jīng)惡性腫瘤,生存率低,惡性程度高,目前臨床上主要的治療方式為手術(shù)聯(lián)合放化療、靶向治療,但手術(shù)切除的局限性、放療的耐藥性和耐透析性導(dǎo)致生存周期短、死亡率高和復(fù)發(fā)率高。因此,研究膠質(zhì)瘤的分子機(jī)制對(duì)開(kāi)發(fā)新的膠質(zhì)瘤治療方法具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn),腫瘤的發(fā)生與基因的異常表達(dá)相關(guān),降低過(guò)表達(dá)的促癌基因或升高低表達(dá)的抑癌基因,可以抑制腫瘤的進(jìn)展[7]。目前膠質(zhì)瘤的靶向治療方法十分有限,且治療效果仍然有很大的提升空間。膠質(zhì)瘤的靶向治療主要有兩個(gè)方面,一方面是通過(guò)抑制血管生成,主要藥物是貝伐珠單抗[8];另一方面是通過(guò)抑制表皮生長(zhǎng)因子受體達(dá)到治療效果,主要藥物有西妥昔單抗[9]、尼妥珠單抗[10]以及小分子酪氨酸激酶抑制劑如吉非替尼[11]。較肺癌和乳腺癌等其他惡性腫瘤相比,膠質(zhì)瘤的靶向治療效果較差,這些藥物在一線治療中均未表現(xiàn)出較滿意的療效。

miRNA是一種小分子非編碼RNA,不編碼蛋白質(zhì),但在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。miRNAs[12]已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)具有抑制膠質(zhì)瘤的作用,具有靶向治療膠質(zhì)瘤的潛力,恢復(fù)抑癌miRNA的表達(dá)可以抑制腫瘤的進(jìn)展。因此,研究miRNA和miRNA的作用靶點(diǎn)具有重要意義。

本研究對(duì)miR-29a在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)進(jìn)行了分析,證明上調(diào)miR-29a可以降低Plexin-A1的表達(dá),從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖,促進(jìn)凋亡,從而抑制膠質(zhì)瘤的進(jìn)展。本研究初步驗(yàn)證了miR-29a在膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中低表達(dá),Plexin-A1高表達(dá)。同樣,miR-29a已被證明在肺癌細(xì)胞系中下調(diào)膠原蛋白抑制肺癌轉(zhuǎn)移[13],還有研究發(fā)現(xiàn)miR-29a-3p可以通過(guò)下調(diào)C1QTNF6降低肺腺癌細(xì)胞的遷移率和增殖能力,降低肺腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲可能性[14];miR-29a-3p通過(guò)靶向和抑制AMDM12增強(qiáng)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的放射敏感性[15]。由于miR-29a-3p低表達(dá)明顯與子宮內(nèi)膜癌患者低分化、未分化、FIGO晚期、重度肌肉浸潤(rùn)、淋巴轉(zhuǎn)移陽(yáng)性均相關(guān),因此miR-29a-3p的降低可能作為不良生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[16]。在本研究中,通過(guò)miRna下游靶基因預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)Plexin-A1可能是miR-29a的直接靶點(diǎn)。

Plexin-A1是信號(hào)家族受體之一,它是一種單通路的膜結(jié)合信號(hào)素,最初被認(rèn)為是軸突引導(dǎo)因子。在生理狀態(tài)下,Plexin-A1作為細(xì)胞表面受體,與配體結(jié)合后,向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)信息,調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)凋亡和血管生成等。腫瘤發(fā)生時(shí)常存在細(xì)胞惡性表型的獲得、原癌基因的異常表達(dá)、細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)通路的異常激活、血管的異常生成。在腫瘤中,Plexin-A1異常表達(dá),介導(dǎo)肺癌細(xì)胞自分泌SEMA3A信號(hào)誘導(dǎo)的惡性表型的獲得[17],且異常地激活了食管癌細(xì)胞中的MAPK信號(hào)通路[18]。另外,Plexin-A1可促進(jìn)血管形成,在膠質(zhì)瘤的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中觀察到了同樣的結(jié)果,在血管內(nèi)皮細(xì)胞中Plexin-A1促進(jìn)JAK2-STAT3表達(dá),進(jìn)一步促進(jìn)血管生成[6]。在膠質(zhì)瘤的靶向治療中,針對(duì)腫瘤的血管生成是一種可靠的方式,因此,Plexin-A1可能是一個(gè)十分有效的靶點(diǎn)。筆者推測(cè)miR-29a下調(diào)Plexin-A1后,可能進(jìn)一步影響了膠質(zhì)瘤的異常生長(zhǎng)和信號(hào)通路的異常激活,以及血管的生長(zhǎng),從而多方面對(duì)膠質(zhì)瘤的發(fā)展產(chǎn)生抑制作用。

針對(duì)膠質(zhì)瘤的靶向治療有很大的局限性,本實(shí)驗(yàn)首次在膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中驗(yàn)證了miR-29a與Plexin-A1的關(guān)系,為開(kāi)發(fā)膠質(zhì)瘤的靶向治療提供新思路。本實(shí)驗(yàn)的不足之處在于僅在細(xì)胞水平驗(yàn)證了一種膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的miR-29a和Plexin-A1的表達(dá)水平和作用關(guān)系,后續(xù)需在其他多種細(xì)胞系及動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證,miR-29a降低Plexin-A1的表達(dá)水平對(duì)下游分子的影響尚未驗(yàn)證,miR-29a在膠質(zhì)瘤中可能存在更多的靶基因,miR-29a的作用需進(jìn)一步研究。

綜上所述,在膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中miR-29a低表達(dá),miR-29a抑制U87細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,同時(shí)抑制Plexin-A1的表達(dá),miR-29a在膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中可能通過(guò)抑制Plexin-A1的表達(dá)發(fā)揮抑癌作用。這為開(kāi)發(fā)基于miRNA靶向治療膠質(zhì)瘤的研究提供了理論依據(jù)。