熊致立，王 瑞，朱曉云，付彤飛，李成銀，吳俊松，王林群，沈銀峰，巴元明*

1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，湖北 武漢 430000

2. 湖北省中醫(yī)院，湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，湖北省中醫(yī)藥研究院，湖北 武漢 430000

膿毒癥是一種危及生命的臨床綜合征，是危重患者死亡的主要原因，而腎臟是最易受影響的器官之一。膿毒癥患者的急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）發(fā)生率為54%[1]。膿毒血癥通常由細(xì)菌感染引起，進(jìn)而產(chǎn)生毒素進(jìn)入血液循環(huán)并釋放多種炎癥介質(zhì)，這些炎癥介質(zhì)在一定程度上會(huì)擴(kuò)張血管、增加血管通透性，進(jìn)而可能影響腎小球的濾過(guò)和腎小管的功能[2]。相關(guān)研究認(rèn)為缺血再灌注損傷、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等均可以導(dǎo)致腎組織內(nèi)細(xì)胞凋亡的增加[3]。合理控制細(xì)胞凋亡成為有效干預(yù)AKI一種重要的治療策略。中醫(yī)藥在保護(hù)腎功能、緩解炎癥方面有巨大潛力。但當(dāng)前針對(duì)膿毒癥相關(guān)性AKI 的中醫(yī)藥研究存在機(jī)制不明確等問(wèn)題。黃連解毒湯最早記載于東晉葛洪《肘后備急方》[4]，為清熱劑代表方，并且在臨床應(yīng)用中取得了一定的療效[5]。本研究考察了黃連解毒湯治療膿毒癥相關(guān)性AKI的作用及潛在機(jī)制，為研究治療膿毒癥相關(guān)性AKI的藥物提供新的策略。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性C57BL/6 小鼠，6 周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自河南省斯克貝斯生物科技股份有限公司，許可證號(hào)SCXK（豫）2020-0005。小鼠飼養(yǎng)于12 h 光照/黑暗循環(huán)的環(huán)境中，溫度（23±2）℃，相對(duì)濕度（55±5）%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)HUCMS-202302007）。

1.2 藥材

黃連解毒湯及其制備工藝源于《肘后備急方》，由黃連9 g、黃芩6 g、黃柏6 g、梔子9 g 4 味藥組成，黃連（批號(hào) 2323080122）和黃芩（批號(hào)2323090105）購(gòu)自湖北辰美中藥有限公司，黃柏（批號(hào)232309025）購(gòu)自天濟(jì)藥業(yè)有限公司，梔子（批號(hào)230801）購(gòu)自湖北潤(rùn)康藥業(yè)有限公司。經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)生藥研究院杜鴻志副教授分別鑒定為毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch. 的干燥根莖、唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi. 的干燥根、蕓香科植物黃檗PhellodendronamurenseRupr.的干燥樹(shù)皮、茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis. 的干燥果實(shí)。

1.3 藥品與試劑

肌酐比色測(cè)定試劑盒（批號(hào)E-BC-K188-M）、尿素氮比色測(cè)定試劑盒（批號(hào)E-BC-K183-M）均購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒（批號(hào)P0010）購(gòu)自武漢碧云天生物技術(shù)研究所；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，批號(hào)GC205009）、AB-PAS 染液套裝（批號(hào)G1049）、蘇木素-伊紅（HE）染液套裝（批號(hào)GB23303）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，批號(hào)GC305010）、組化試劑盒 DAB 顯色劑（批號(hào)G1212）、重組β-actin 抗體（批號(hào)GB15003-100）、抗兔蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）抗體（批號(hào)GB111114）、HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗（批號(hào)GB23301）、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗（批號(hào)GB23303）均購(gòu)自武漢塞維爾生物科技公司；B 淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）單克隆抗體（批號(hào)13-8800）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）單克隆抗體（批號(hào)MA5-14003）、色譜純甲醇均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司； 磷脂酰肌醇 3- 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）單克隆抗體（批號(hào)60225-1-Ig）購(gòu)自武漢三鷹生物科技有限公司；p-Akt 抗體（批號(hào)AF0832）、磷酸酯酶與張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）抗體（批號(hào)af6351）均購(gòu)自美國(guó)親科生物科技公司；p-PI3K 抗體（批號(hào)BS-5570R）購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；色譜純甲酸購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；去離子水由湖北中醫(yī)藥大學(xué)科技中心提供。

1.4 儀器

D3024R 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（北京大龍公司）；Epoch 酶標(biāo)檢測(cè)儀（美國(guó)Bio-Tek 公司）；垂直電泳儀、轉(zhuǎn)印電泳儀（武漢塞維爾生物科技公司）；RM2016 型病理切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司）；UltiMate 3000 RS 型色譜儀、Q Exactive 高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）。

2 方法

2.1 黃連解毒湯的制備及成分分析

2.1.1 黃連解毒湯的制備 按處方比例稱(chēng)取黃連、黃芩、黃柏、梔子，加6 倍量水，浸泡30 min，煎煮45 min；再加6 倍量水，煎煮30 min，合并濾液，減壓濃縮（60 ℃）至相對(duì)密度1.08～1.10 的浸膏，噴霧干燥得干膏粉。采用真空干燥法測(cè)定其出膏率為17.61%，并將干膏于-20 ℃保存。

2.1.2 樣品處理 取黃連解毒湯水煎液100 μL，加入300 μL 甲醇，渦旋10 min。4 ℃、20 000×g離心10 min，取上清液上機(jī)分析。

2.1.3 色譜條件 Welch AQ-C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫：1～5 min，98%～80% A；5～10 min，80%～50% A；10～15 min，50%～20% A；15～20 min，20%～5% A；20～27 min，5% A；27～28 min，5%～98% A；28～30 min，98% A。柱溫35 ℃；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度10.0 ℃；進(jìn)樣體積5.00 μL；體積流量0.30 mL/min。

2.1.4 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）；正負(fù)離子切換掃描；檢測(cè)方式為Full MS/dd-MS2，F(xiàn)ull MS 分辨率為70 000，dd-MS2分辨率為17 500；掃描范圍m/z100～1 500；電噴霧電壓為±3.2 kV；毛細(xì)管溫度 300 ℃；碰撞氣為高純氬氣（體積分?jǐn)?shù)≥99.999%）；碰撞能為30、40、60 eV；鞘氣為氮?dú)猓w積分?jǐn)?shù)≥99.999%），體積流量800 L/h；輔助氣為氮?dú)猓w積分?jǐn)?shù)≥99.999%），體積流量300 L/h，溫度350 ℃；數(shù)據(jù)采集時(shí)間30.0 min。

2.2 動(dòng)物分組、造模及給藥

將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和黃連解毒湯低、中、高劑量（50、100、150 mg/kg）[6]組，每組8 只。各給藥組ig 相應(yīng)藥物，對(duì)照組和模型組ig 等體積生理鹽水，1 次/d，連續(xù)3 d。末次給藥2 h 后，模型組和各給藥組ip LPS（10 mg/kg），對(duì)照組ip 等體積生理鹽水。造模24 h 后，所有小鼠安樂(lè)死，收集腎臟和血清。將小鼠左腎固定于4%多聚甲醛溶液中，乙醇洗脫后，石蠟包埋，并將剩余樣品儲(chǔ)存在-80 ℃下用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 試劑盒檢測(cè)血清中肌酐和尿素氮水平

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)分別測(cè)定各組小鼠血清中肌酐和尿素氮水平。

2.4 HE 和PAS 染色檢測(cè)腎組織病理變化

各組腎組織石蠟切片放入環(huán)保型脫蠟液后，自來(lái)水洗，HE 或PAS 染色，中性樹(shù)膠封片固定，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.5 免疫組化檢測(cè)腎組織Bax 和Bcl-2 表達(dá)

取各組腎組織石蠟切片，根據(jù)免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用SP 兩步法進(jìn)行抗原修復(fù)，封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，孵育抗體，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 TUNEL 檢測(cè)腎組織細(xì)胞凋亡情況

取各組腎組織石蠟切片，根據(jù)TUNEL 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行標(biāo)記染色，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.7 Western blotting 檢測(cè)腎組織PTEN、PI3K、p-PI3K、Akt 和p-Akt 蛋白表達(dá)

取各組腎組織，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液提取蛋白，使用BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，于5%脫脂牛奶中封閉1 h，分別加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；TBST 洗滌后，加入二抗，孵育1.5 h，加入化學(xué)發(fā)光試劑顯影，并分析條帶灰度值。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用GraphPad Prism 9.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用x±s表示。數(shù)據(jù)滿(mǎn)足正態(tài)分布且方差齊時(shí)采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 黃連解毒湯主要成分分析

HPLC-MS 采集的數(shù)據(jù)通過(guò)CD 3.3（Compound Discoverer 3.3）完成數(shù)據(jù)初步整理后進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)（mzCloud）檢索比對(duì)。HPLC/MS 總離子流圖見(jiàn)圖1，鑒定出的31 個(gè)主要活性成分見(jiàn)表1。黃連解毒湯主要成分有咖啡酸、小檗堿以及黃芩素等。

圖1 負(fù)、正離子模式下的總離子流圖Fig.1 Total ion flow chart under negative and positive ion modes

3.2 黃連解毒湯對(duì)膿毒癥相關(guān)性AKI 小鼠血清中尿素氮和肌酐水平的影響

如圖2 所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清尿素氮和血肌酐水平均明顯升高（P＜0.001）；與模型組比較，各給藥組血肌酐水平均顯著降低，黃連解毒湯中、高劑量組血清尿素氮水平顯著降低（P＜0.01、0.001）。提示黃連解毒湯可能在緩解膿毒血癥導(dǎo)致的急性腎損傷過(guò)程中起到了保護(hù)作用。

圖2 黃連解毒湯對(duì)膿毒癥相關(guān)性AKI 小鼠血清中尿素氮和肌酐水平的影響 (±s, n = 5)Fig.2 Effect of Huanglian Jiedu Decoction on levels of urea nitrogen and creatinine in serum of sepsis related-AKI mice(±s, n = 5)

3.3 黃連解毒湯對(duì)膿毒癥相關(guān)性AKI 小鼠腎臟組織病理變化的影響

如圖3 所示，HE 染色可見(jiàn)對(duì)照組小鼠腎臟組織形態(tài)正常，無(wú)明顯病變。模型組小鼠腎臟組織腎小管結(jié)構(gòu)失常，可見(jiàn)管型，腎小管上皮細(xì)胞脫落，細(xì)胞核輪廓不清晰，說(shuō)明在LPS 誘導(dǎo)下發(fā)生小管凝固性壞死。與模型組比較，各給藥組不同程度減輕了膿毒血癥對(duì)腎臟組織的損傷，腎小管壞死情況明顯改善。

圖3 黃連解毒湯對(duì)膿毒癥相關(guān)性AKI 小鼠腎臟組織病理變化的影響 (×200)Fig.3 Effect of Huanglian Jiedu Decoction on pathological changes of renal tissue in sepsis related-AKI mice (× 200)

PAS 染色通常用于測(cè)定微絨毛、基底膜和主要在組織中的多糖積累[7]。對(duì)照組小鼠中觀察到廣泛的PAS 染色區(qū)域的管狀微絨毛和基底層，表明腎組織的結(jié)構(gòu)相對(duì)完整。模型組小鼠腎臟中結(jié)構(gòu)完整區(qū)域顯著減少，可見(jiàn)輕微擴(kuò)張的腎小管和腫脹的腎小管細(xì)胞[8]。給予黃連解毒湯干預(yù)后，結(jié)構(gòu)失常的腎小管和腎小管細(xì)胞顯著恢復(fù)。

3.4 黃連解毒湯對(duì)膿毒癥相關(guān)性AKI 小鼠腎組織Bax 和Bcl-2 表達(dá)的影響

Bax 和Bcl-2 是調(diào)控細(xì)胞凋亡的2 個(gè)關(guān)鍵蛋白，Bax 和Bcl-2 間的平衡決定了細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡[9]。為了驗(yàn)證在小鼠膿毒癥相關(guān)性AKI 過(guò)程中是否存在細(xì)胞損傷和凋亡，通過(guò)免疫組化技術(shù)檢測(cè)Bax/Bcl-2 在模型小鼠腎組織中的蛋白表達(dá)和分布情況。如圖4 所示，模型組小鼠腎組織中觀察到強(qiáng)烈的Bax 信號(hào)，Bcl-2 表達(dá)微弱。與模型組比較，各給藥組小鼠腎組織Bax 表達(dá)降低，說(shuō)明黃連解毒湯在一定程度上能夠延緩和減輕細(xì)胞凋亡的進(jìn)程，進(jìn)而發(fā)揮治療作用。

圖4 黃連解毒湯對(duì)膿毒癥相關(guān)性AKI 小鼠腎組織Bax 和Bcl-2 表達(dá)的影響 (×200)Fig.4 Effect of Huanglian Jiedu Decoction on Bax and Bcl-2 expressions in kidney tissue of sepsis related-AKI mice (× 200)

3.5 黃連解毒湯對(duì)膿毒癥相關(guān)性AKI 小鼠腎組織細(xì)胞凋亡的影響

為了進(jìn)一步探究黃連解毒湯對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，采用TUNEL 染色法檢測(cè)腎組織細(xì)胞凋亡情況。如圖5 所示，細(xì)胞核復(fù)染后為藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核為綠色。模型組小鼠腎組織中TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加，黃連解毒湯各劑量組小鼠腎組織凋亡細(xì)胞顯著減少。

圖5 黃連解毒湯對(duì)膿毒癥相關(guān)性AKI 小鼠腎組織細(xì)胞凋亡的影響 (×400)Fig.5 Effect of Huanglian Jiedu Decoction on cell apoptosis in kidney tissue of sepsis related-AKI mice (× 400)

3.6 黃連解毒湯對(duì)膿毒癥相關(guān)性AKI 小鼠腎組織PTEN/PI3K/Akt 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖6 所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠腎組織PI3K和Akt蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），p-Akt、p-PI3K 和PTEN 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組p-Akt 和p-PI3K 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）；黃連解毒湯中、高劑量組Akt 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；黃連解毒湯高劑量組PI3K 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），PTEN 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。

圖6 黃連解毒湯對(duì)膿毒癥相關(guān)性AKI 小鼠腎組織PTEN/PI3K/Akt 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 (±s, n = 5)Fig.6 Effect of Huanglian Jiedu Decoction on expressions of PTEN/PI3K/Akt pathway related-proteins in renal tissue of sepsis related-AKI mice (±s, n = 5)

4 討論

本研究結(jié)果顯示，LPS 誘導(dǎo)的小鼠腎組織出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞壞死、變性，腎小管擴(kuò)張等病理學(xué)損傷，這與先前相關(guān)研究報(bào)道基本一致[10]。經(jīng)黃連解毒湯干預(yù)后，腎組織損傷出現(xiàn)不同程度減輕，表明黃連解毒湯對(duì)腎臟具有保護(hù)作用，并能夠抑制腎細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡由多種因素誘導(dǎo)，其中炎癥是膿毒癥相關(guān)性AKI 中最顯著的因素之一。免疫組化結(jié)果顯示，黃連解毒湯能夠調(diào)節(jié)腎臟組織中Bax/Bcl-2 的表達(dá)水平，表明黃連解毒湯可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)來(lái)減輕AKI 小鼠細(xì)胞凋亡。PI3K/Akt 通路由于腎細(xì)胞中的凋亡增加而被顯著抑制，并伴隨有PTEN 表達(dá)的激活。而黃連解毒湯干預(yù)后，可呈劑量相關(guān)性地激活PI3K/Akt，并且與二者的磷酸化水平密切相關(guān)，這表明抑制腎細(xì)胞凋亡可能是延遲膿毒癥相關(guān)性AKI 進(jìn)展的關(guān)鍵機(jī)制。

長(zhǎng)期或過(guò)度的炎癥反應(yīng)可能會(huì)對(duì)組織造成損害，甚至導(dǎo)致疾病的發(fā)生和進(jìn)展。這時(shí)，細(xì)胞凋亡就會(huì)介入其中。細(xì)胞凋亡是一種精確調(diào)控的程序性死亡方式，通常被認(rèn)為是維持組織穩(wěn)態(tài)和免疫平衡的關(guān)鍵機(jī)制之一[11]。在細(xì)胞凋亡中，受到損傷或異常的細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)一系列信號(hào)通路，最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡[12]。因此在治療過(guò)程中，合理調(diào)控炎癥與細(xì)胞凋亡將會(huì)對(duì)膿毒癥相關(guān)性AKI 的預(yù)后產(chǎn)生重要的作用。在前期研究中，PTEN/PI3K/Akt 通路在細(xì)胞凋亡過(guò)程中扮演著重要的角色[13]。特別是該通路涉及多個(gè)關(guān)鍵分子，包括PTEN、PI3K 和Akt，它們相互作用以調(diào)節(jié)細(xì)胞平衡。PTEN 是一個(gè)重要的信號(hào)分子，其主要功能是通過(guò)去磷酸化作用，將磷脂酰肌醇 3,4,5 三磷酸（phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate，PIP3）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇4,5 二磷酸（phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate，PIP2）[14]，從而降低PI3K/Akt 通路的活性。PI3K 被激活后會(huì)催化PIP2 轉(zhuǎn)化為PIP3，進(jìn)而促進(jìn)Akt 的活化。Akt是重要的細(xì)胞生存信號(hào)傳導(dǎo)分子，其活化可以通過(guò)磷酸化多個(gè)底物來(lái)促進(jìn)細(xì)胞生存、增殖和抵抗凋亡[15]。正常情況下，PTEN 通過(guò)抑制PI3K/Akt 通路的活性，從而維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到外界的凋亡信號(hào)，比如DNA 損傷或細(xì)胞環(huán)境的壓力，通路的平衡遭到破壞，導(dǎo)致Akt 的活性下降。PTEN/PI3K/ Akt 通路的變化對(duì)多個(gè)凋亡調(diào)控因子的表達(dá)和活性產(chǎn)生影響，Bcl-2 家族蛋白是一個(gè)重要的例子，它們?cè)诩?xì)胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通常，高活化的Akt 會(huì)抑制Bcl-2 家族凋亡抑制蛋白的表達(dá)，從而減少細(xì)胞凋亡的傾向[16]。然而，當(dāng)PTEN 活性增加，導(dǎo)致Akt 活性降低時(shí)，細(xì)胞中的Bcl-2 家族凋亡促進(jìn)蛋白的表達(dá)增加，進(jìn)而促使細(xì)胞走向凋亡途徑[17]。此外，Akt 在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中還通過(guò)調(diào)控其他通路和底物來(lái)發(fā)揮作用。例如，Akt 可以通過(guò)抑制Bad 蛋白的磷酸化來(lái)促進(jìn)細(xì)胞生存，而磷酸化的Bad 可以與Bcl-2 蛋白家族相互作用以減少凋亡的傾向。同時(shí)，Akt 還可以通過(guò)調(diào)節(jié)FoxO 轉(zhuǎn)錄因子的活性[18]，影響多個(gè)與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。

中醫(yī)認(rèn)為膿毒癥相關(guān)性AKI 可根據(jù)其疾病表現(xiàn)歸于“關(guān)格”“癃閉”等范疇，《景岳全書(shū)》[19]云：“五臟之傷，窮必及腎?！蹦I乃先天之本，是全身臟腑陰陽(yáng)之本，膿毒血癥起病急迫，其病因病機(jī)多為濕熱內(nèi)蘊(yùn)，毒擾心神[20]。濕熱熏蒸于腎，腎氣失于氣化，或三焦決瀆無(wú)權(quán)，通調(diào)水道失職或外感濕邪，郁而化熱，濕熱之邪循經(jīng)下注，蘊(yùn)結(jié)于腎，移于膀胱，水與熱結(jié)，形成濕熱內(nèi)盛，致使膀胱氣機(jī)不暢，故常見(jiàn)少尿、無(wú)尿[21]；本病總屬虛實(shí)夾雜、本虛標(biāo)實(shí)。主要由于正氣不足、熱毒濕濁羈留，但如邪毒不除，瘀滯絡(luò)脈，則脾不能升清降濁、化生氣血，腎不能氣化固攝，故精微不斷流失而使正氣愈虛、水濕濁毒羈留進(jìn)一步損傷正氣，病來(lái)洶涌，危及生命，形成惡性循環(huán)。在臨床實(shí)踐中，膿毒血癥作為一種嚴(yán)重的全身性炎癥反應(yīng)，多見(jiàn)高熱、口渴、煩躁以及神志不清等表現(xiàn)，根據(jù)溫病學(xué)派“到氣方可清氣”的學(xué)術(shù)思想[22]，此階段多屬于氣分證邪正交爭(zhēng)，由淺及深的關(guān)鍵階段，可見(jiàn)陽(yáng)明熱盛、濕熱中阻等臨床表現(xiàn)，故當(dāng)清解氣分熱毒。黃連解毒湯由黃連、黃芩、黃柏、梔子等組成，性苦寒直折，針對(duì)三焦熱盛證，功能瀉火解毒[23]。Zheng 等[24]研究認(rèn)為黃連解毒湯在干預(yù)結(jié)腸炎小鼠的過(guò)程中可減輕DSS-V 小鼠的抑郁樣行為，同時(shí)降低白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-10和DNAX 相關(guān)蛋白12（DNAX-associated protein 12，Dap12）mRNA 的表達(dá)，起到了抗炎、抗氧化作用。黃連解毒湯的現(xiàn)代藥理學(xué)[25]研究證明其主要成分來(lái)源于黃芩、黃連、黃柏3 味藥材，具體包括小檗堿、黃連堿、黃柏堿等，前期的研究已充分證實(shí)了其在炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的抑制中具有顯著療效。而本研究意在進(jìn)一步闡明黃連解毒湯作用于細(xì)胞凋亡的深層機(jī)制[26]。

本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了黃連解毒湯能夠減輕小鼠膿毒癥相關(guān)性AKI 的進(jìn)展并起到了腎臟保護(hù)作用。黃連解毒湯在緩解細(xì)胞凋亡中的治療作用可能歸因于PTEN/PI3K/Akt 信號(hào)通路的激活。這些發(fā)現(xiàn)將為黃連解毒湯的臨床應(yīng)用提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持，同時(shí)有助于更好地闡釋中藥復(fù)方在腎病防治中的科學(xué)內(nèi)涵。在未來(lái)的研究中，將會(huì)聚焦細(xì)胞研究以及臨床研究，深度挖掘黃連解毒湯對(duì)于膿毒癥相關(guān)性AKI 的分子調(diào)控機(jī)制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突