馬海峰，常青，賈聚娟，張耀元，宋愛霞

（河北北方學院附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，河北 張家口 075000）

缺血性腦卒中是臨床常見的致殘性、致死性疾病。流行病學研究顯示超過1/3的卒中患者可出現(xiàn)不同程度的卒中后抑郁，患者通常存在興趣缺失、情緒低落等狀態(tài)或表現(xiàn)，卒中后抑郁不僅可延緩患者認知和神經(jīng)功能的恢復，還會加重家庭和社會的負擔，增加致殘和致死的風險[1-3]。細胞分裂周期蛋白42（cell division cycle protein 42, CDC42）是一種小谷氨酸-丙酮酸氨基轉(zhuǎn)移酶，參與大部分神經(jīng)細胞的發(fā)育，近些年其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的研究逐漸增多，可能成為精神分裂癥、腦卒中、癲癇等疾病中潛在的治療靶點[4-5]。研究顯示，CDC42在缺血性腦卒中患者外周血淋巴細胞中的表達明顯降低，因此考慮CDC42與缺血性腦卒中的發(fā)病存在一定相關(guān)性[6]。輔助性T細胞17（helper T cells 17, Th17）是T細胞的亞群之一，Th17細胞因子表達量的增加能夠誘導Th1細胞分化從而促進炎癥反應增強，導致神經(jīng)損傷加重，其與腦卒中發(fā)病機制的關(guān)系仍是臨床研究的熱點[7-8]。本研究旨在觀察缺血性腦卒中患者外周血CDC42、Th17細胞的表達并探究其與患者抑郁程度的相關(guān)性，期望為腦卒中焦慮、抑郁、認知障礙的診治提供外周血生物標志和科學依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2022年1月—2023年1月河北北方學院附屬第一醫(yī)院收治的200例缺血性腦卒中患者為觀察組，另選取同期本院200例體檢健康者為對照組。納入標準：①根據(jù)《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[9]相關(guān)診斷標準，局灶性腦神經(jīng)功能缺損持續(xù)時間＞ 24 h，經(jīng)CT或MRI檢查顯示有新發(fā)梗死灶；②發(fā)病后24 h內(nèi)入院；③年齡18～80歲。排除標準：①合并嚴重感染、炎癥或自身免疫性疾病；②失語、偏癱無法配合研究；③顱內(nèi)出血；④既往有精神病病史或服用抗精神病藥物；⑤既往有酒精、藥物依賴。兩組性別構(gòu)成、年齡、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index, BMI）、文化程度、吸煙史、飲酒史比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（見表1）。采用蒙哥馬利抑郁評定量表[10]評估患者的抑郁狀態(tài)。該量表共10個項目，采用7級評分法，每項0～6分，滿分60分；得分＜ 12分為無抑郁，12～21分為輕度抑郁，22～29分為中度抑郁，30～34分為重度抑郁，得分≥35分為極度抑郁。根據(jù)得分將觀察組分為無抑郁組116例、輕度抑郁組38例、中度抑郁組31例、重度抑郁組15例。所有研究對象均在實驗前知曉本實驗的目的并簽署知情同意書。本研究實驗流程經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準，并遵循赫爾辛基宣言和相應的規(guī)章制度。

表1 兩組一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 干預方法 觀察組入院后接受常規(guī)抗血小板聚集、降脂等對癥支持治療，并采用多感官刺激方案對患者進行持續(xù)干預。①觸覺感覺刺激：患者清潔雙手并修剪指甲，取正坐位，指導患者將手指分開呈扇形，略微彎曲并放置在前額頭皮處，略微用力使用指腹按壓頭皮，從額頭前發(fā)際往上方游走，從百會穴向頸部風府穴等穴區(qū)進行按壓，行至穴位時稍微停頓并向下稍用力按壓持續(xù)數(shù)秒。按壓輕重程度根據(jù)患者主觀感覺確定，力度以感覺肌膚松弛、頭部酸脹為準。②視聽感覺刺激：利用視頻播放器和音樂播放器播放視頻和音頻，視頻內(nèi)容主要為森林、山川、海洋、江河、風土民俗、節(jié)日慶典等自然及人文景觀，通過色彩鮮明的景象刺激患者的視覺感受器。音樂播放器播放α波音樂，音量控制為20～60分貝，患者閉眼，醫(yī)護人員或家屬引導患者回憶視頻中的內(nèi)容，α波音樂有利于調(diào)節(jié)腦波，將其控制在60～70節(jié)拍、頻率8～14的α波狀態(tài)，有利于緩解焦慮、抑郁等負性情緒。③嗅覺感覺刺激：使用薰衣草精油（已使用葡萄籽油稀釋，比例1滴精油∶5 mL葡萄籽油），分別在患者的耳后、前額處涂抹精油，以患者面部表情舒緩、呼吸平穩(wěn)為標準，患者閉眼感受、細嗅精油的特殊氣味。若患者對其不耐受則改用香橙精油，兩種精油均有利于放松身心、改善睡眠、改善記憶力，可緩解焦慮抑郁狀態(tài)。

1.2.2 醫(yī)院焦慮抑郁量表（hospital anxiety and depression scale, HADS） HADS量表分為焦慮（hospital anxiety and depression scale anxiety subscale,HADS-A）評分和抑郁（hospital anxiety and depression scale depression subscale, HADS-D）評分，每個量表均包含7個項目，采用4級評分法，每項1～4分，總分7～28分，得分越高表示焦慮、抑郁越嚴重[11]。

1.2.3 簡易精神狀態(tài)評價量表（mini-mental state examination, MMSE）評分 MMSE評分包含定向力、計算力、注意力、語言能力等19個問題，共30項，總分30分，得分27～30分為正常，＜ 27分為認知功能障礙[12]。

1.2.4 觀察組干預前后日常生活活動能力（activities of daily living, ADL）評分 ADL評分共包含步行、上下樓梯、吃飯、洗澡、穿衣、如廁等項目，總分100分，得分越高表示患者自理能力越好[12]。

1.2.5 外周血CDC42、Th17、調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T-cell, Treg）、Th17/Treg檢測 收集所有研究對象的外周血樣本，清晨采集空腹靜脈血2 mL于抗凝管中，2 mL放于非抗凝管中，4 ℃、3 000 r/min離心20 min。分離血漿并儲存在-80 ℃環(huán)境下。使用血細胞分析儀（XN-350型，日本System株式會社）檢測外周血Th17、Treg細胞比例，計算Th17/Treg；使用實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測血漿CDC42 mRNA相對表達量，正向引物：5'-GCCCGTGA CCTGAAGGCTGTCA-3'，反向引物：5'-TGCTTTTAGTA TGATGCCGACACCA-3'，長度分別為18和22 bp，以GAPDH為內(nèi)參基因，擴增片段407 bp。使用美國Thermo公司的TRIzol試劑提取總DNA，之后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應體系為2 μL 5×RT Buffer，0.5 μL Primer Mix，800 ng RNA，最后使用無核酸酶水補足體積至10 μL。先于37 ℃下進行15 min逆轉(zhuǎn)錄反應，98 ℃下進行5 min酶失活反應，反應結(jié)束后于-20 ℃冰箱冷凍保存。qRT-PCR反應體系按照12.5 μL SYBR Premix Ex Taq，1.0 μL Forward Primer，1.0 μL Uni-miR qPCR Primer，2.0 μL cDNA模板，8.5 μL雙蒸水，總體積25 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s，95℃變性5 s；60 ℃退火20 s，共40個循環(huán)。以2-ΔΔCt法計算CDC42 mRNA相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗；相關(guān)性分析用Pearson法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察組與對照組HADS評分、MMSE評分比較

觀察組與對照組HADS-A評分、HADS-D評分和MMSE評分比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），觀察組HADS-A評分、HADS-D評分均高于對照組，MMSE評分低于對照組。見表2。

表2 觀察組與對照組HADS評分、MMSE評分比較（n =200，±s）

表2 觀察組與對照組HADS評分、MMSE評分比較（n =200，±s）

組別觀察組對照組t 值P 值HADS-A評分12.09±3.26 8.86±1.35 12.946 0.000 HADS-D評分10.57±2.81 8.27±0.59 11.328 0.000 MMSE評分24.61±3.92 28.15±1.73 11.684 0.000

2.2 不同抑郁程度患者HADS評分、MMSE評分比較

各組的HADS-A評分、HADS-D評分、MMSE評分比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。重度抑郁組HADS-A評分、HADS-D評分高于其他組（P＜0.05），MMSE評分低于其他組（P＜0.05）；中度抑郁組HADS-A評分、HADS-D評分高于輕度抑郁組和無抑郁組（P＜0.05），MMSE評分低于輕度抑郁組和無抑郁組（P＜0.05）；輕度抑郁組HADS-A評分、HADS-D評分高于無抑郁組（P＜0.05），MMSE評分低于無抑郁組（P＜0.05）。見表3。

表3 不同抑郁程度患者HADS評分、MMSE評分比較（±s）

表3 不同抑郁程度患者HADS評分、MMSE評分比較（±s）

注：①與無抑郁組比較，P＜0.05；②與輕度抑郁組比較，P＜0.05；③與中度抑郁組比較，P＜0.05。

MMSE評分26.17±1.25 25.51±0.69①24.83±0.84①②24.02±0.85①②③26.489 0.000組別無抑郁組輕度抑郁組中度抑郁組重度抑郁組F 值P 值n 116 38 31 15 HADS-A評分10.12±1.42 10.65±1.18①11.48±1.94①②12.83±2.29①②③17.411 0.000 HADS-D評分7.82±0.54 9.12±1.72①12.08±2.06①②13.67±2.93①②③130.128 0.000

2.3 觀察組與對照組外周血CDC42 mRNA、Th17細胞、Treg細胞、Th17/Treg表達水平比較

觀察組與對照組外周血CDC42 mRNA、Th17細胞、Treg細胞、Th17/Treg表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），觀察組外周血CDC42 mRNA、Treg細胞表達水平低于對照組，外周血Th17細胞、Th17/Treg表達水平高于對照組。見表4。

表4 觀察組與對照組外周血CDC42 mRNA、Th17細胞、Treg細胞、Th17/Treg表達水平比較 （n =200，±s）

表4 觀察組與對照組外周血CDC42 mRNA、Th17細胞、Treg細胞、Th17/Treg表達水平比較 （n =200，±s）

組別觀察組對照組t 值P 值CDC42 mRNA 1.37±0.21 1.56±0.17 9.945 0.000 Th17/%7.25±1.86 2.95±0.71 30.545 0.000 Treg/%4.33±1.06 8.17±1.29 32.525 0.000 Th17/Treg 2.27±0.65 0.36±0.08 41.245 0.000

2.4 不同抑郁程度患者外周血CDC42 mRNA、Th17細胞、Treg細胞、Th17/Treg表達水平比較

各組外周血CDC42 mRNA比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組外周血Th17細胞、Treg細胞、Th17/Treg表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；重度抑郁組Th17細胞、Th17/Treg表達水平高于其他組（P＜0.05），Treg細胞表達水平低于另外組（P＜0.05），中度抑郁組Th17細胞、Th17/Treg表達水平高于輕度抑郁組、無抑郁組（P＜0.05），Treg細胞表達水平低于輕度抑郁組、無抑郁組（P＜0.05），輕度抑郁組Th17細胞、Th17/Treg表達水平高于無抑郁組（P＜0.05），Treg細胞表達水平低于無抑郁組（P＜0.05）。見表5。

表5 不同抑郁程度患者外周血CDC42 mRNA、Th17細胞、Treg細胞、Th17/Treg表達水平比較 （±s）

表5 不同抑郁程度患者外周血CDC42 mRNA、Th17細胞、Treg細胞、Th17/Treg表達水平比較 （±s）

注：①與無抑郁組比較，P＜0.05；②與輕度抑郁組比較，P＜0.05；③與中度抑郁組比較，P＜0.05。

組別無抑郁組輕度抑郁組中度抑郁組重度抑郁組F 值P 值Th17/Treg 1.08±0.23 1.32±0.25①1.77±0.41①②2.31±0.62①②③96.004 0.000 n 116 38 31 15 CDC42 mRNA 1.39±0.19 1.35±0.08 1.36±0.11 1.32±0.14 1.312 0.272 Th17/%5.12±1.47 5.64±1.16①6.82±1.85①②7.53±2.06①②③18.166 0.000 Treg/%4.72±1.18 4.29±0.96①3.85±0.73①②3.26±0.78①②③12.307 0.000

2.5 觀察組干預前后HADS評分、MMSE評分、ADL評分比較

觀察組干預前后HADS-A評分、HADS-D評分、MMSE評分、ADL評分比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），觀察組干預后HADS-A評分、HADS-D評分低于干預前，MMSE評分、ADL評分高于干預前。見表6。

表6 觀察組干預前后HADS評分、MMSE評分、ADL評分比較 （n =200，±s）

表6 觀察組干預前后HADS評分、MMSE評分、ADL評分比較 （n =200，±s）

時間干預前干預后t 值P 值HADS-A評分12.09±3.26 10.84±2.52 4.290 0.000 HADS-D評分10.57±2.81 8.96±1.25 7.403 0.000 MMSE評分24.61±3.92 25.74±2.58 3.405 0.001 ADL評分51.39±14.83 63.72±12.05 9.125 0.000

2.6 觀察組干預前后外周血CDC42 mRNA、Th17細胞、Treg細胞、Th17/Treg表達水平比較

觀察組干預前后外周血CDC42 mRNA表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。觀察組干預前后外周血Th17細胞、Treg細胞、Th17/Treg表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），觀察組干預后外周血Th17細胞、Th17/Treg表達水平低于干預前，外周血Treg細胞表達水平高于干預前。見表7。

表7 觀察組干預前后外周血CDC42 mRNA、Th17細胞、Treg細胞、Th17/Treg表達水平比較 （n =200，±s）

表7 觀察組干預前后外周血CDC42 mRNA、Th17細胞、Treg細胞、Th17/Treg表達水平比較 （n =200，±s）

時間干預前干預后t 值P 值CDC42 mRNA 1.37±0.21 1.39±0.18 1.023 0.307 Th17/%7.25±1.86 5.94±1.22 8.329 0.000 Treg/%4.33±1.06 5.28±1.27 8.122 0.000 Th17/Treg 2.27±0.65 1.48±0.37 14.938 0.000

2.7 觀察組患者外周血CDC42 mRNA、Th17細胞、Treg細胞、Th17/Treg表達水平與HADS評分的相關(guān)性分析

觀察組患者外周血Th17細胞、Th17/Treg表達與HADS評分呈正相關(guān)（r=0.673和0.603，P=0.007和0.011），外周血Treg細胞表達與HADS評分呈負相關(guān)（r=-0.586，P=0.013），外周血CDC42 mRNA與HADS評分無相關(guān)性（r=-0.375，P=0.194）。見圖1～4。

圖1 外周血CDC42 mRNA與HADS評分的相關(guān)性散點圖

圖2 外周血Th17細胞表達與HADS評分的相關(guān)性散點圖

圖3 外周血Treg細胞表達與HADS評分的相關(guān)性散點圖

圖4 外周血Th17/Treg表達水平與HADS評分的相關(guān)性散點圖

3 討論

卒中后抑郁是缺血性腦卒中患者的常見的合并癥，其病理機制與多種因素有關(guān)，同時涉及精神病學領(lǐng)域和神經(jīng)病學范疇，目前比較認同的機制包括分子生物學和社會心理學，其中分子生物學是臨床研究最重要的領(lǐng)域[13-14]。因此，臨床研究缺血性腦卒中的發(fā)病機制，對提出更優(yōu)化的康復治療方案、行為干預措施，提高患者生活質(zhì)量，促進全民健康，減輕家庭、社會負擔具有重要意義。隨著分子生物學的發(fā)展，CDC42、Th17等生物學標志物被逐漸引入。有研究顯示，卒中患者通過降低促炎細胞Th17水平，有利于降低抑郁的發(fā)生率，考慮抗炎治療可能有利于降低卒中后抑郁發(fā)生的風險[15]。CDC42、Th17等與缺血性腦卒中的發(fā)病密切相關(guān)，有望成為腦卒中焦慮、抑郁、認知功能障礙等事件的生物指標或治療靶點，為該病的臨床診治提供依據(jù)[16-17]。

本研究結(jié)果顯示，觀察組HADS評分高于對照組，MMSE評分低于對照組，提示缺血性腦卒中患者存在焦慮、抑郁等負性情緒及認知功能損傷。缺血性腦卒中患者在發(fā)病后短時間即可出現(xiàn)語言和肢體功能障礙，同時也可發(fā)生神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)損傷，而部分精神癥狀的發(fā)生相對滯后[18]。下丘腦作為缺血性腦卒中的好發(fā)部位，也是表達情緒的重要部位，下丘腦受損后可對下丘腦-垂體-腎上腺軸和自主神經(jīng)的結(jié)構(gòu)和功能造成影響，引起細胞免疫水平降低，患者精神狀態(tài)的變化可能與免疫功能的變化有關(guān)[19-20]。

本研究結(jié)果顯示，觀察組外周血CDC42表達低于對照組，提示CDC42表達可能與缺血性腦卒中的發(fā)病機制有關(guān)，CDC42在神經(jīng)細胞的生長、遷移等生理過程中均有參與，神經(jīng)細胞發(fā)育時，軸突從細胞體向外延伸，并和其他細胞形成突觸聯(lián)系，CDC42缺失的神經(jīng)細胞絲狀足生長較慢、數(shù)量較少，CDC42對于軸突的生長仍有缺陷，考慮在軸突的發(fā)育和延伸過程中CDC42具有調(diào)節(jié)作用，因此CDC42的表達可在一定程度上反映缺血性腦卒中患者的神經(jīng)損傷[21-22]。另有研究顯示，CDC42蛋白表達水平和陽性率在缺血性腦卒中患者外周血淋巴細胞中均明顯降低，缺血性腦卒中患者發(fā)病后CDC42活性受到影響，而?；L素釋放肽對于神經(jīng)功能具有保護作用，對軸突生長具有促進作用，能夠緩解腦損傷[23]。既往研究通過蛋白質(zhì)組學發(fā)現(xiàn)CDC42參與了神經(jīng)突的生長過程；此外CDC42還是屏障功能和內(nèi)皮細胞遷移的調(diào)節(jié)因子，經(jīng)炎癥作用影響血管內(nèi)皮細胞的修復，對中性粒細胞遷移進行調(diào)節(jié)，參與缺血性腦卒中患者神經(jīng)損傷的修復[24]。本研究結(jié)果顯示，不同抑郁程度缺血性腦卒中患者CDC42 mRNA表達比較無明顯差異，提示缺血性腦卒中患者的抑郁程度與其外周血CDC42表達無相關(guān)性，其原因可能是輕度抑郁組、中度抑郁組、重度抑郁組中樣本量較小，對統(tǒng)計學結(jié)果造成一定影響。

本研究結(jié)果顯示，觀察組外周血Th17細胞、Th17/Treg表達水平高于對照組，Treg表達水平低于對照組，并且隨著抑郁程度加重，外周血Th17細胞、Th17/Treg表達水平呈升高趨勢，Treg細胞表達呈下降趨勢，提示患者抑郁程度與外周血Th17細胞、Treg細胞、Th17/Treg的表達存在一定相關(guān)性。卒中后抑郁的發(fā)病機制較為復雜，可受到多種因素影響，如免疫系統(tǒng)激活、炎癥反應、基因多態(tài)性等[25-27]。CD4+T淋巴細胞可分化為Th17細胞和Treg細胞，Th17細胞特征性分泌白細胞介素-17，與受體結(jié)合后，可促進炎癥因子表達，刺激T細胞活化，增強組織炎癥反應[28]。Treg細胞能起到免疫抑制作用，對于抑制性T細胞具有活化作用，能夠分泌多種抗炎因子如白細胞介素-10，參與自身免疫調(diào)節(jié)[29]。兩者對免疫功能起到互反的調(diào)節(jié)作用，相互拮抗，調(diào)節(jié)機體炎癥和免疫炎癥的動態(tài)平衡，最后可能影響到神經(jīng)遞質(zhì)異常，從而影響卒中后抑郁的發(fā)生[30]。

另外觀察組干預后HADS評分、MMSE評分、ADL評分及外周血Th17細胞、Treg細胞、Th17/Treg表達水平均有所改善，提示合理干預，有利于減輕焦慮抑郁等負性情緒，防止病情加重，提高患者生活質(zhì)量。本研究通過多感官刺激方案進行干預，有利于提高患者的皮質(zhì)可塑性，對于皮質(zhì)功能的重塑、重組具有促進作用，能夠代償受損神經(jīng)，改善患者的認知功能。另外該方案通過多個感官刺激吸引患者視聽感覺的注意力，促進患者與環(huán)境的溝通交互，放松身心，減輕抑郁。

綜上所述，缺血性腦卒中患者外周血CDC42表達明顯降低、Th17表達明顯升高，其可能參與了缺血性腦卒中的發(fā)病，并且Th17的表達與患者抑郁程度呈正相關(guān)，對于臨床診治卒中后抑郁具有一定的參考價值，臨床根據(jù)患者病情采取相應的干預措施有利于減輕抑郁情緒，控制病情發(fā)展。而CDC42與患者的抑郁程度無相關(guān)性，可能與樣本量較小有關(guān)，CDC42與卒中后抑郁的聯(lián)系與作用機制有待進一步研究驗證。