王麗紅 楊曉麗 李 靜

新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizing enterocolitis, NEC)是一種嚴重的急性腸道炎癥性疾病。據(jù)報道,其發(fā)生率為3%～15%[1]。其中高達50%的患兒需進行手術治療,且術后發(fā)生嚴重并發(fā)癥(如腦癱和認知障礙)的可能性很大[2,3]。研究發(fā)現(xiàn),該病病死率為18.5%～28.8%,而且在過去幾十年里并沒有明顯變化[4]。此外,NEC 患兒住院時間更長,治療費用更高[5]。因此,探索NEC的發(fā)病機制及治療方法已成為臨床研究的重點。

NEC有復雜的、多因素的病理生理學,潛在的作用機制尚不明確。Qiao等[6]研究顯示,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)可誘發(fā)腸道炎癥,導致腸黏膜屏障破壞,進而誘發(fā)多種疾病。大量研究表明,ERS與克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎等炎癥性腸病及結(jié)腸癌的發(fā)病機制有關[7,8]。Lau等[9]研究表明,ERS也可能與急性腸道損傷的發(fā)病機制有關。Zhu等[10]報道,與腸道炎癥密切相關的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是NEC發(fā)病機制的關鍵參與者,抑制ERS可改善NEC大鼠腸道損傷。研究表明,自噬激活發(fā)生在NEC腸道組織中,抑制自噬可以對NEC起保護作用[11, 12]。王國琴等[13]研究顯示,ERS和自噬兩者之間存在著重要的聯(lián)系。ERS介導的自噬機制非常復雜,但目前國內(nèi)外對ERS誘導的自噬和NEC關系研究甚少。

本課題組在前期實驗中已成功建立新生大鼠NEC模型[14]。在此基礎上,本課題擬從體外細胞實驗開展進一步研究:建立新生大鼠NEC模型,分離提取出腸上皮細胞,檢測炎性細胞因子、ERS標志物和自噬相關蛋白等的表達,探究抑制ERS誘導的自噬是否對NEC有保護作用,闡明其對NEC作用機制的影響,旨在為NEC的治療提供實驗參考。

材料與方法

1.實驗動物與主要試劑:健康新生清潔級Sprague-Dawley (SD)大鼠10只,雌雄不限,體質(zhì)量5～10g,由山西省人民醫(yī)院動物實驗室(實驗動物許可證號:SCXK晉2019-0001)提供,按無特定病原體(specific pathogen free, SPF)級要求飼養(yǎng)。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,血清型055:B55)購自北京Sloarbio公司;衣霉素(tunicamycin,Tm,ERS誘導劑)、4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA,ERS抑制劑)均購自上海Macklin公司;LC3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒、p62 ELISA 試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)試劑盒均購自日本TaKaRa 公司;BCA蛋白含量檢測試劑盒、LC3及p62抗體、羊抗兔IgG-HRP均購自江蘇凱基生物技術股份有限公司;引物由通用生物(安徽)股份有限公司合成。代乳品配制:雅培嬰兒配方奶粉5g,脂肪乳50ml,蛋白粉8g,加滅菌水至100ml。

2.NEC動物模型的建立:所有動物實驗方案均經(jīng)山西省人民醫(yī)院動物保護委員會批準[倫理學審批號:(2019)省醫(yī)倫審字第105號]。通過人工喂養(yǎng)+缺氧+冷刺激+LPS灌胃多因素聯(lián)合在新生SD大鼠中誘導NEC模型。每天于8:00、12:00、16:00、20:00時人工喂養(yǎng)新生大鼠4次配方奶(起始量為0.15ml,后逐漸增加);每天于8:00、20:00時進行缺氧應激(暴露于純氮氣60s),然后置于冰箱進行冷暴露(4℃,10min);后于每天16:00時經(jīng)灌胃針注入LPS(10mg/kg稀釋于配方奶中),連續(xù)2天?？崭?2h后以頸椎脫臼法處死動物,收集腸組織(回盲部近端2cm)用于后續(xù)實驗。

3.腸上皮細胞的提取、培養(yǎng):如汪煜鵬[15]所述,先進行試劑配制:①細胞洗液:50ml磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)+0.5ml青霉素(100U/ml)、鏈霉素(0.1mg/ml)雙抗;②消化液:15ml DMEM/F12培養(yǎng)基+1.5mg中性蛋白酶Ⅱ(0.1mg/ml)+4.5mg膠原蛋白酶Ⅺ(0.3mg/ml);③分散液:1.00g山梨醇+2.5ml胎牛血清+普通DMEM/F12培養(yǎng)基定容至50ml;④完全培養(yǎng)基:5ml胎牛血清+0.5ml青鏈霉素雙抗+0.4ml EGF(2.5μg/ml)稀釋液+DMEM/F12培養(yǎng)基定容至50ml。

參照沈雁等[16]的方法,用細胞洗液將獲取的腸組織反復沖洗3～5次后將其剪碎,吸取含碎腸組織的溶液到15ml的離心管中。加10ml的冰PBS溶液,輕柔地吹打,反復幾次直至上清液變澄清,16099×g離心3min,棄上清。向沉淀中加入適量消化液在37℃下消化30min,每隔10min搖勻1次,靜置1min后取上清入15ml離心管中,重復上述操作2次。向上清液中加10ml分散液,吹打混勻,16099×g離心3min,棄上清。沉淀用分散液重懸,重復5～6次,直到上清液澄清。加入5ml完全培養(yǎng)基重懸,接種于培養(yǎng)瓶中,放入細胞培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)進行細胞培養(yǎng),每2～3天換液1次,當細胞密度達80%～90%后進行后續(xù)實驗。

4.分組及干預方法:取對數(shù)生長期的細胞分為3組:對照組(用不含藥物的完全培養(yǎng)基孵育)、抑制組(加5mmol/L的4-PBA處理細胞)、誘導組(加10μg/ml的Tm處理細胞),均處理24h[6]。

5.ELISA檢測炎性細胞因子:將待測樣本室溫放置20min,于各反應孔中依次加入標準品和樣本50μl,每孔加入酶標試劑100μl,空白孔除外。用封板膜封板后振蕩、混勻后置37℃溫育60min。每孔加洗滌液人工洗滌5次,后加入50μl顯色劑A、B,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15min,加終止液50μl終止反應。以空白孔調(diào)零,采用酶標儀記錄450nm波長處各孔的吸光度(A)值,繪制標準曲線并計算出各組樣本腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、腸脂酸結(jié)合蛋白(intestinal fatty acid binding protein,I-FABP)的質(zhì)量濃度。

6.RT-qPCR檢測ERS標志物:利用Trizol試劑從培養(yǎng)的腸上皮細胞中分離總mRNA。然后,通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA合成為互補DNA。取cDNA以β-actin為內(nèi)參進行RT-qPCR檢測,運用RT-qPCR儀參照試劑盒說明書設置程序:95℃變性10min,然后95℃變性15s,60℃退火20s,72℃延伸28個循環(huán)40s。完成循環(huán)步驟后,72℃再延伸5min。采用2-ΔΔCT法計算葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)、氧調(diào)節(jié)蛋白150(oxygen-regulated protein 150,ORP150)相對基因表達量。

表1 RT-qPCR引物序列

7.Western blot法檢測自噬相關蛋白:處理后的細胞在含有1%苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl flouride,PMSF)、10%蛋白酶抑制劑和1%磷酸化抑制劑的冷RIPA(radioimmunoprecipitation assay,RIPA裂解液)溶液中裂解30min,收集蛋白用于后續(xù)實驗。通過聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid,BCA)蛋白試劑盒測定樣品的蛋白質(zhì)濃度?？偟鞍讟悠方?jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)電泳并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上。經(jīng)5%脫脂牛奶室溫封閉2h后,把膜與相應的一抗4℃下孵育過夜。次日,膜經(jīng)Tris緩沖鹽吐溫-20溶液(tris buffered saline tween-20,TBST)洗滌3次后,與相應的二抗室溫下孵育2h,TBST洗膜3次。采用成像分析系統(tǒng)掃描獲得的印跡,用Gel-Pro32軟件進行灰度值分析。通過將條帶強度歸一化為GAPDH帶強度來確定每個通道的LC3Ⅱ/Ⅰ、p62蛋白表達水平。

結(jié) 果

1.各組腸上皮細胞炎性細胞因子比較:ELISA檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,抑制組TNF-α、I-FABP水平明顯降低,而誘導組的表達水平顯著增高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),詳見圖1。

圖1 各組細胞炎性細胞因子表達比較

2.各組腸上皮細胞ERS標志物mRNA比較:RT-qPCR檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,抑制組GRP78、ORP150的mRNA相對表達量明顯降低,而誘導組明顯增高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),詳見圖2。

圖2 各組細胞ERS標志物mRNA相對表達量比較

3.各組腸上皮細胞內(nèi)自噬相關蛋白比較:Western blot法檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,抑制組p62蛋白水平明顯升高,LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白水平顯著降低;而誘導組則相反,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),詳見圖3、圖4。

圖3 各組細胞自噬相關蛋白條帶

圖4 各組細胞自噬相關蛋白表達比較

討 論

NEC的發(fā)病機制極其復雜,其發(fā)病與早產(chǎn)、配方奶喂養(yǎng)、腸道微生物菌群失調(diào)、炎癥、缺氧缺血性損傷等有關,隨之引發(fā)一系列病理生理變化,最終導致腸黏膜屏障功能障礙、通透性改變、發(fā)生不可逆性損傷[17]。參與NEC的炎性介質(zhì)包括TNF-α、白細胞介素等,TNF-α參與活化多種炎性細胞,促進其釋放大量的氧自由基和蛋白酶導致腸組織損傷[18];還可誘導線粒體發(fā)生功能障礙甚至使其凋亡,引發(fā)腸上皮細胞發(fā)生凋亡[19]。I-FABP在腸道缺血性疾病中的表達水平明顯增高,可反映腸黏膜損傷程度和通透性變化[20]。此外,它還被認為是一種可預測NEC發(fā)展并與腸組織壞死程度相關的生物學標志物[21]。ERS和自噬在多種胃腸道疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要參與蛋白質(zhì)的加工和修飾,指導其正確的折疊和組裝。在各種不利刺激的作用下,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能發(fā)生紊亂,大量錯誤折疊蛋白質(zhì)堆積就會啟動ERS[22]。重度或持續(xù)的ERS則會激活炎癥小體,甚至引起細胞凋亡[23]。在ERS發(fā)生時,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白GRP78首先從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上解離,以幫助被破壞的蛋白質(zhì)重新折疊或降解,其表達水平可反映ERS的嚴重程度,被認為是ERS的生物學標志物之一[24]。

ORP150作為一種機體應對應激時產(chǎn)生的重要ERS伴侶分子標志物,它的高表達與許多ERS相關疾病密切相關[25]。當ERS無法清除超負荷的折疊紊亂蛋白時,細胞自噬將被激活以清除這類蛋白維持細胞穩(wěn)態(tài)。據(jù)報道,ERS是NEC新生大鼠自噬的一種潛在誘導劑[26]。自噬是一種廣泛且高度保守的細胞降解過程。LC3是自噬的關鍵指標,由于可溶性LC3Ⅰ型轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)結(jié)合型LC3Ⅱ型是自噬的典型特征,因此使用LC3Ⅱ/Ⅰ比率來評估自噬程度[27]。p62是一種能與LC3結(jié)合并被降解的應激蛋白,其含量與自噬水平呈負相關,也被認為是一種自噬程度的標志物[28]。研究表明,NEC組TNF-α水平高于健康新生兒組,而且隨疾病嚴重程度呈上升趨勢,說明其濃度與NEC臨床分期密切相關[29]。ERS可調(diào)節(jié)腸上皮細胞的炎性反應,持續(xù)的ERS會誘導細胞凋亡,抑制ERS可能對NEC的腸道有保護作用[30,31]。抑制ERS能夠減輕細胞凋亡程度和抑制NEC的發(fā)展[32]。在嚴重燒傷小鼠中,抑制ERS可減輕燒傷誘導的自噬激活,使腸道通透性減弱,減輕腸道損傷[33]。因此,以上研究表明,ERS-自噬通路與腸黏膜屏障功能受損疾病(如NEC)的發(fā)病機制緊密相關,抑制ERS誘導的自噬可以減輕NEC腸組織的炎性反應。

本實驗發(fā)現(xiàn),與對照組比較,抑制組的TNF-α、I-FABP、GRP78、ORP150mRNA表達水平明顯降低,LC3Ⅱ/Ⅰ表達水平下調(diào),p62表達水平上調(diào),提示炎性細胞因子、ERS相關標志物表達降低,自噬水平顯著下調(diào),誘導組結(jié)果明顯相反,證明抑制ERS通過阻止細胞內(nèi)自噬激活顯著降低NEC刺激的炎性細胞因子釋放,減輕NEC腸上皮細胞的炎性反應,表明抑制ERS誘導的自噬可能是NEC腸組織損傷的保護機制。所以抑制ERS-自噬通路可作為NEC腸組織損傷的治療靶點。

綜上所述,抑制ERS可減輕NEC腸上皮細胞的炎性反應,其作用機制可能與阻斷細胞的ERS-自噬通路有關。本研究從ERS和自噬方面揭示了NEC的發(fā)病機制,為探索NEC的治療提供了新思路。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。