鄧志敏 吳瑪麗 代芳芳 程艷香

卵巢癌是病死率最高的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤,由于缺少有效的早期診斷手段,大多數(shù)患者在確診時已為中晚期[1]。臨床上常以腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合紫杉醇、鉑類化療為主要治療方案,但晚期患者的5年生存率不足30%[2]。盡管分子靶向技術(shù)和免疫治療等新療法在不斷改進(jìn),但療效欠佳[3]。中國傳統(tǒng)醫(yī)藥講究“扶本祛邪”,在延長患者生存時間和改善生活質(zhì)量等方面具有一定優(yōu)勢,許多中藥復(fù)方和中藥注射液已應(yīng)用于腫瘤臨床治療,并獲得良好效果[4]。Wang等[5]研究證實,中草藥聯(lián)合化療可顯著提高治療效果,減少毒性不良反應(yīng),改善中醫(yī)證候和癥狀,并提高患者遠(yuǎn)期生存率。

艾迪注射液是提純?nèi)藚?、斑蝥、黃芪等中藥的抗腫瘤免疫活性物質(zhì)制成的抗癌針劑,具有清熱解毒、消瘀散結(jié)之功[6]。既往研究發(fā)現(xiàn),卵巢癌患者術(shù)后化療過程中,聯(lián)合使用艾迪注射液可起到減毒增效的作用[7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是利用算法及分析軟件,基于“藥物-靶點-疾病”互作網(wǎng)絡(luò),多維層面觀察藥物對疾病的干預(yù)與影響,開啟中醫(yī)藥多靶標(biāo)與疾病間復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的新研究[8]。因此,本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和細(xì)胞實驗對艾迪注射液治療卵巢癌的關(guān)鍵靶點及分子機(jī)制進(jìn)行分析。

資料與方法

1.艾迪注射液活性成分篩選及靶點預(yù)測:利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)對人參、黃芪、斑蝥以生物利用度≥30%、類藥性≥0.18且藥物半衰期≥4h作為閾值進(jìn)行篩選,得到艾迪注射液的藥物作用靶點。

2.卵巢癌相關(guān)靶點的篩選:通過癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫下載并處理卵巢癌原始的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)。并從基因型-組織表達(dá)(Genotype-Tissue Expression,GTEx)數(shù)據(jù)庫中得到健康人類捐贈者的卵巢轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)。在R軟件中使用“l(fā)imma”包以log2FC>2且Padj.<0.05為篩選條件獲得卵巢癌組和正常組之間差異表達(dá)的基因。

3.蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)和藥物-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建:在Venny 2.1.0平臺進(jìn)行交集分析獲得艾迪注射液作用于卵巢癌的可能靶點,而后將交集基因錄入STRING平臺,得到蛋白質(zhì)互作(protein protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)。

接著構(gòu)建艾迪注射液藥物-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò),并采用Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化分析。

4.富集分析:使用R包“clusterprofiler”對交集基因進(jìn)行基因本體論(gene ontology,GO)富集和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析。只有P和q值同時<0.05的GO和KEGG富集條目被認(rèn)為是有意義的。

5.交集基因生存預(yù)后分析和表達(dá)情況研究:在GEPIA2數(shù)據(jù)庫中對交集基因進(jìn)行生存預(yù)后分析,P<0.05視為與卵巢癌預(yù)后相關(guān)的核心靶基因,可能是艾迪注射液治療并延長卵巢癌患者生存期的重要靶點。并在人類蛋白圖譜(Human Protein Altas,HPA)數(shù)據(jù)庫中獲得核心靶基因在腫瘤組和正常組的免疫組化染色情況。

圖1 艾迪注射液作用于卵巢癌關(guān)鍵基因篩選

圖2 交集基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖和艾迪注射液-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 交集基因的富集分析圖

圖4 艾迪注射液干預(yù)卵巢癌交集關(guān)鍵基因生存預(yù)后分析

圖5 艾迪注射液作用于卵巢癌關(guān)鍵預(yù)后基因免疫組化染色

圖6 艾迪注射液對卵巢癌細(xì)胞增殖及關(guān)鍵預(yù)后基因表達(dá)水平的影響

6.細(xì)胞培養(yǎng):人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3購自上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。于DMEM(Dulbecco's modified eagle medium)培養(yǎng)基中加入10%的胎牛血清和1%的青霉素-鏈霉素后配成RPMI 1640培養(yǎng)基用于培養(yǎng)SKOV3。細(xì)胞培養(yǎng)于含5%二氧化碳,溫度37℃的培養(yǎng)箱中,每天更換1次培養(yǎng)基。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行藥物處理。

7.藥物和試劑:艾迪注射液購自貴州益佰制藥股份有限公司。細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(CCK-8)購自日本Gojindo公司。實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)試劑盒購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

8.CCK-8檢測艾迪注射液對SKOV3細(xì)胞增殖能力的影響:將SKOV3細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液后以5000個/孔的密度接種于96孔板中,種板24h后細(xì)胞貼壁,實驗組加入含有50mg/ml艾迪注射液的RPMI1640培養(yǎng)基,對照組加入等量培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24h和48h,每孔中加入配好的CCK-8檢測液(10μl),置于培養(yǎng)箱中孵育1h,最后用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光度。

9.RT-qPCR分析艾迪注射液影響卵巢癌預(yù)后的基因表達(dá)水平:按Trizol Reagant說明書提取添加或不加艾迪注射液的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24h卵巢癌細(xì)胞的總RNA,并用紫外分光光度計定量并檢測純度,將1μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。目的基因和內(nèi)參基因的引物序列詳見表1,以GAPDH作為內(nèi)參,進(jìn)行相對表達(dá)量的計算,每組重復(fù)3次,取平均值。

表1 目的基因和內(nèi)參基因引物序列

結(jié) 果

1.卵巢癌靶點基因的篩選:整合TCGA和GTEx數(shù)據(jù)后得到卵巢癌基因表達(dá)矩陣,共篩選出610個差異基因(圖1A),其中上調(diào)基因277個,下調(diào)基因333個。圖1B為在腫瘤組和正常組組間差異表達(dá)最大的前20個基因的熱圖。

2.艾迪注射液作用于卵巢癌的可能靶點及網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建:通過TCSMP數(shù)據(jù)庫獲得人參、黃芪、斑蝥這3種中藥的有效成分及其作用的靶點共193個。將193個藥物靶點與610個疾病差異基因取交集,得到13個交集基因。接著將這13個交集基因?qū)隨TRING檢索PPI信息,得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖(置信度>0.40,圖2A)。根據(jù)藥物有效成分、ID信息、篩選得到的交集基因,構(gòu)建艾迪注射液-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò),借助Cytoscape進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化分析(圖2B、表2)。

表2 艾迪注射液-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)詳細(xì)信息

3.富集分析結(jié)果:13個交集基因在R中富集分析篩選得到353條GO條目(圖3A)(P<0.05,q<0.05),涉及生物過程、細(xì)胞組成和分子功能的前10條通路呈現(xiàn)于圖3B。主要富集在氧化應(yīng)激通路相關(guān)酶活性、細(xì)胞連接和染色體復(fù)制、營養(yǎng)物的代謝和傷口愈合等生物學(xué)過程。主要涉及到細(xì)胞凋亡、鉑耐藥、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、Toll樣受體(Toll-like receptor)和白細(xì)胞介素-17(interleukin-17,IL-17)等相關(guān)信號通路(圖3中C、D)。

4.生存分析結(jié)果:將13個靶基因輸入到GEPIA2平臺分析,發(fā)現(xiàn)3個基因?qū)β殉舶╊A(yù)后影響有統(tǒng)計學(xué)意義,分別為細(xì)胞間緊密連接蛋白4(claudin 4,CLDN4)、分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制因子(secretory leukocyte peptidase inhibitor,SLPI)和桿狀病毒IAP重復(fù)序列包含5(baculoviral IAP repeat containing 5,BIRC5)。其中,BIRC5為卵巢癌保護(hù)性因素,而CLDN4和SLPI是卵巢癌預(yù)后危險因素(圖4)。

5.艾迪注射液作用于卵巢癌關(guān)鍵基因免疫組化分析:在HPA數(shù)據(jù)庫中探究艾迪注射液干預(yù)卵巢癌的關(guān)鍵預(yù)后基因的差異表達(dá)情況。免疫組化染色結(jié)果表明,卵巢癌預(yù)后危險因素CLDN4和SLPI確實在腫瘤組中表達(dá)更高,在正常組中表達(dá)偏低,而卵巢癌保護(hù)性因素BIRC5則是正常組的表達(dá)比腫瘤組高(圖5)。

6.艾迪注射液對卵巢癌細(xì)胞增殖及關(guān)鍵預(yù)后基因表達(dá)水平的影響:進(jìn)行CCK-8實驗研究艾迪注射液對SKOV3細(xì)胞的增殖抑制作用,圖6A可見對照組細(xì)胞24h增殖率約為100%,艾迪注射液50mg/ml處理24h組增殖率下降至66%,48h后對照組增殖率為164%,而實驗組增殖率繼續(xù)下降至50%。實驗組增殖率均低于對照組(P<0.01)。提示艾迪注射液對SKOV3細(xì)胞具有生長抑制作用,且隨作用時間延長,抑制作用愈加明顯。

在mRNA水平進(jìn)一步研究艾迪注射液對卵巢癌預(yù)后關(guān)鍵基因表達(dá)水平的影響。由圖6B可以看出,艾迪注射液50mg/ml處理24h后卵巢癌危險因素SLPI和CLDN4的mRNA表達(dá)水平與對照組比較均有明顯降低,且艾迪注射液處理也使卵巢癌保護(hù)性因素BIRC5呈現(xiàn)大幅提高。

討 論

目前卵巢癌的一線化療方案為紫杉醇聯(lián)合鉑類藥物,但是化療帶來的不良反應(yīng)及化療耐藥問題為卵巢癌患者的遠(yuǎn)期生存帶來了極大的阻礙[9]。既往研究發(fā)現(xiàn),中草藥的有效成分與化療藥物聯(lián)用能起到增效減毒的作用,這為卵巢癌的治療帶來了新希望[10]。艾迪注射液中含有人參、斑蝥、黃芪等多種中藥有效成分,其中人參皂苷Rg3已被證明能抑制腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和腫瘤血管生成,并調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能,改善腫瘤免疫微環(huán)境[11,12];而斑蝥抗腫瘤的主要成分是斑蝥素,可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長[13]。另外黃芪多糖作為一種補(bǔ)氣中藥,可阻滯細(xì)胞周期、減少活性氧自由基含量發(fā)揮抗癌活性[14]。艾迪注射液已被報道輔助治療卵巢癌時可以有效降低腫瘤標(biāo)志物水平,改善免疫功能,減輕不良反應(yīng),療效確切[15,16]。

本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索艾迪注射液的活性成分并預(yù)測對應(yīng)的靶點、構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)、富集分析和生存分析,挖掘艾迪注射液治療卵巢癌的作用靶點。本研究共篩選到卵巢癌相關(guān)基因610個,艾迪注射液作用基因靶點193個,進(jìn)一步篩選到艾迪注射液作用于卵巢癌的交集靶點共13個,這些基因主要富集在凋亡增殖、鉑耐藥和IL-17相關(guān)信號通路中,與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展以及化療耐藥密切相關(guān),可能是艾迪注射液增效減毒卵巢癌治療的機(jī)制。生存分析進(jìn)一步篩選后共發(fā)現(xiàn)3個艾迪注射液調(diào)控卵巢癌的預(yù)后關(guān)鍵基因,分別為CLDN4(P=0.014)、SLPI(P=0.008)和BIRC5(P=0.013),生存分析結(jié)果顯示,CLDN4和SLPI的低表達(dá)與患者更長的總生存期相關(guān),而BIRC5的低表達(dá)與卵巢癌不良預(yù)后相關(guān)。此外,免疫組化染色分析結(jié)果顯示,CLDN4和SLPI在腫瘤組織中表達(dá)更高,在正常組中表達(dá)偏低,而BIRC5在正常組中的表達(dá)高于腫瘤組。

CLDN4是一種細(xì)胞緊密連接蛋白,在人卵巢癌中高度表達(dá),研究發(fā)現(xiàn),CLDN4可通過Wnt/β-catenin信號通路活化促進(jìn)卵巢癌增殖和侵襲,并介導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞對紫杉醇的耐藥[17～19]。分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑SLPI在卵巢癌細(xì)胞中過表達(dá),與卵巢癌患者腫瘤分期相關(guān)[20]。而BIRC5是凋亡抑制因子基因家族的成員,編碼Survivin蛋白[21]。研究表明,NF-κB介導(dǎo)的Survivin表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞對順鉑和紫杉醇的敏感度[22]。總之,根據(jù)免疫組化染色和生存分析結(jié)果顯示,CLDN4和SLPI為卵巢癌的預(yù)后危險因素,在卵巢癌中高表達(dá),而BIRC5為保護(hù)性因素,在正常組織中表達(dá)較高,本研究結(jié)果與既往相關(guān)文獻(xiàn)研究結(jié)果吻合。

進(jìn)一步使用艾迪注射液對卵巢癌細(xì)胞系SKOV3進(jìn)行細(xì)胞層面研究。CCK-8實驗檢測結(jié)果顯示,艾迪注射液可顯著抑制卵巢癌細(xì)胞增殖能力,且隨著用藥時間的延長,抑制作用加強(qiáng)。而RT-qPCR檢測也證實艾迪注射液的使用可降低SLPI和CLDN4這兩個卵巢癌預(yù)后危險因子的表達(dá),同時大幅提高卵巢癌保護(hù)性因素BIRC5的水平,從而實現(xiàn)抗腫瘤效果。因此,艾迪注射液可能通過調(diào)節(jié)這些關(guān)鍵基因的表達(dá)影響腫瘤相關(guān)信號通路,從而實現(xiàn)抗腫瘤作用,同時通過影響卵巢癌細(xì)胞對化療藥物的敏感度實現(xiàn)增強(qiáng)化療效果的作用。

綜上所述,本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段,初步研究艾迪注射液在殺傷卵巢癌細(xì)胞的潛在靶點,可通過影響細(xì)胞增殖和影響化療耐藥性等方式實現(xiàn)多成分、多靶點、多途徑抗卵巢癌和聯(lián)合化療增效減毒的作用,為開展進(jìn)一步實驗研究提供了良好的理論依據(jù)。然而,本研究主要基于數(shù)據(jù)庫分析開展,雖進(jìn)行了部分細(xì)胞層面的驗證,但是具體的分子機(jī)制還需更深入的研究。未來需要進(jìn)行更多細(xì)胞層面信號通路機(jī)制的探索,并在動物水平進(jìn)行艾迪注射液藥代動力學(xué)的研究以及分子機(jī)制的驗證,為艾迪注射液在卵巢癌的臨床應(yīng)用奠定了研究基礎(chǔ)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。