趙芳玲 綦鈺瑩 蔡劍平 戴大鵬

高質(zhì)量的大片段基因組文庫的構(gòu)建是基于圖譜的基因克隆和物理圖譜構(gòu)建的必要技術(shù)平臺,這極大地方便了基因組學(xué)的研究工作,成為人類基因組計(jì)劃順利進(jìn)行的重要支撐[1～3]。最早使用的克隆載體是λ噬菌體,其插入片段為20kb左右,且僅能應(yīng)用于一般基因的克隆。隨后發(fā)展出的Cosmid載體的插入片段增大到45kb,但仍不能滿足于較大的基因簇的研究。20世紀(jì)80年代起酵母人工染色體YAC作為最早發(fā)展的真正意義上的人工染色體應(yīng)運(yùn)而生[4]。YAC能夠構(gòu)建完整基因組文庫,但其穩(wěn)定性較差、轉(zhuǎn)化率低、基因分離難度大。隨后以大腸桿菌F因子為基礎(chǔ)的BAC載體系統(tǒng)迅速發(fā)展并被廣泛應(yīng)用[5]。BAC載體的插入片段最高可達(dá)300kb,因以大腸桿菌為寄主故轉(zhuǎn)化率高,較YAC文庫更容易構(gòu)建,且復(fù)制子來源于F因子,無嵌合現(xiàn)象可穩(wěn)定遺傳[6]。這些優(yōu)點(diǎn)使得BAC載體成為基因組文庫構(gòu)建和較大基因簇研究的主要工具。

BAC載體經(jīng)研發(fā)應(yīng)用后也不斷被改造優(yōu)化以更方便基因組克隆。pBeloBAC11載體是第2代BAC載體的代表,其在第1代載體pBAC108L的克隆位點(diǎn)中引入了lacZα基因可通過藍(lán)白斑篩選作為重組子選擇標(biāo)記。但是pBeloBAC11載體是單拷貝復(fù)制,且提取質(zhì)粒DNA時還需進(jìn)行CsCl-EB密度梯度離心純化[7]。因此很難得到大量高純度的質(zhì)粒DNA。高拷貝復(fù)合載體pCUGIBAC1的出現(xiàn)很好地解決了這一問題[8]。該載體由高拷貝克隆用載體pGEM-4Z與BAC載體plndigoBac536融合連接組成,既保留了BAC載體容納大片段的特性,又顯著提高了質(zhì)?？截悢?shù),進(jìn)而降低了質(zhì)粒純化及后續(xù)分子克隆操作的難度。

本研究在此原理上將pBeloBAC11與pGEM-3Z兩載體進(jìn)行改進(jìn)融合改造,同時增加多克隆酶切位點(diǎn)數(shù)目,以方便后期外源基因的接入,最終得到高拷貝復(fù)合BAC載體pBAC-BJH。利用該載體本研究將CYP2A6基因大片段DNA導(dǎo)入雙酶切后的線性BAC載體并成功用于單倍型分析。

材料與方法

1.試劑與材料:大腸桿菌(E.coli)菌株DH10B購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司;質(zhì)粒pGEM-3Z購自美國Promega公司;質(zhì)粒pBeloBAC11購自北京諾鑫盛源科技有限公司;NEB bufferr2.1購自美國NEB公司;DNA Ligation Kit購自日本TaKaRa公司;HindⅢ、BamHⅠ內(nèi)切酶購自北京蘭博利德商貿(mào)有限公司;瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;KOD One PCR Master Mix購自日本Toyobo公司。引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成。

2.中間載體pGEM-3Z-BJH和pBAC-LOW的構(gòu)建:合成表1中的退火上游和下游引物,分別稀釋至100μmol/L,各取10μl與2.2μl 10×NEB buffer 2混合,運(yùn)行如下程序退火:95℃保持3min,90℃保持1min,85℃保持1min,80℃保持1min,75℃保持1min,70℃保持1min,65℃保持1min,60℃保持1min,55℃保持1min,50℃保持1min,45℃保持1min,40℃保持1min,35℃保持1min,30℃保持1min,25℃保持1min,然后冷卻至4℃。退火產(chǎn)物稀釋100倍后取2μl與30～50ng BamHⅠ/HindⅢ雙酶切的pGEM-3Z或pBeloBAC11質(zhì)粒,TaKaRa連接kit 16℃連接30min后轉(zhuǎn)化DH10B感受態(tài)細(xì)胞,并在含100μg/ml氨芐青霉素(pGEM-3Z)或12.5μg/ml氯霉素(pBeloBAC11)的LB固體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng),利用T7和SP6引物進(jìn)行菌落聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)篩選陽性克隆。原載體為陰性對照,2%瓊脂糖凝膠電泳挑選條帶增加127bp的菌落并提取質(zhì)粒,獲得重組中間載體pGEM-3Z-BJH及pBAC-LOW并利用T7進(jìn)行測序以驗(yàn)證序列是否正確。

表1 所用引物及序列信息表

3.目的載體高拷貝質(zhì)粒pBAC-BJH的構(gòu)建:HindⅢ單酶切pGEM-3Z-BJH及pBAC-LOW 37℃ 2h,酶切產(chǎn)物回收后取60ng pGEM-3Z-BJH與30ng的pBAC-LOW進(jìn)行連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH10B感受態(tài)細(xì)胞后均勻涂布于含100μg/ml氨芐青霉素及12.5μg/ml氯霉素抗性的平板并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取藍(lán)色菌斑,使用通用引物M13上游引物和M13下游引物進(jìn)行菌落PCR。由于目標(biāo)載體內(nèi)應(yīng)會含有2段lacZα,陽性克隆擴(kuò)增后會分別得到一條2909bp和一條166bp大小的條帶。測序驗(yàn)證后提取目的質(zhì)粒命名為pBAC-BJH。

4.重組載體pBAC-BJH應(yīng)用于CYP2A6基因組大片段克隆:使用NCBI網(wǎng)站的Primer-BLAST在線工具設(shè)計(jì)CYP2A6擴(kuò)增上游引物(含BstBⅠ位點(diǎn))及下游引物(含MluⅠ位點(diǎn)),參照STI PCR文獻(xiàn)[9],利用在線工具calGC確認(rèn)擴(kuò)增條件為ProgamⅠ,n=10。參照使用說明,利用KOD One PCR Master Mix擴(kuò)增CYP2A6的啟動子區(qū)及全部外顯子區(qū)(9576bp),產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后,切膠回收目的條帶并使用BstBⅠ與MluⅠ37℃雙酶切2h,酶切產(chǎn)物純化后備用。使用BstBⅠ與MluⅠ雙酶切2μg新構(gòu)建的pBAC-BJH載體,1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收7.5kb的BAC載體,并與同樣酶切純化后的CYP2A6 PCR產(chǎn)物連接,熱激轉(zhuǎn)化DH10B感受態(tài)細(xì)胞后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選實(shí)驗(yàn),次日挑取白色菌斑,使用克隆篩選引物進(jìn)行菌落PCR。提取陽性克隆質(zhì)粒,并使用外顯子1測序引物及外顯子3測序引物對不同克隆中包含的2A6外顯子1和外顯子3進(jìn)行測序分析,以鑒定CYP2A6樣本包含的不同SNP是否位于同一條DNA鏈上。

結(jié) 果

1.中間質(zhì)粒載體的構(gòu)建:本研究對比分析了兩種市售常用T載體pGEM-3Z和pMD19-T中l(wèi)acZα基因的蛋白序列,發(fā)現(xiàn)氨基酸存在差異的部分集中在N端,據(jù)此推測,N端的編碼基因改變可能不會影響lacZα基因功能的正常行使。為此,本研究在克隆載體pGEM-3Z及BAC載體pBeloBAC11的BamHⅠ酶切位點(diǎn)之間加入了SphⅠ、PmeⅠ、SacⅡ、PacⅠ、NheⅠ、MluⅠ、BstBⅠ等7個酶切位點(diǎn),獲得兩個中間載體pGEM-3Z-BJH及pBAC-LOW,在保證lacZα維持正常功能的同時,增加后續(xù)基因操作時的便捷性(圖1)。藍(lán)白斑篩選實(shí)驗(yàn)證實(shí),新加入的酶切位點(diǎn)確實(shí)未影響lacZα基因的正常功能。

圖1 lacZα編碼基因的改造

2.目的載體高拷貝質(zhì)粒pBAC-BJH的構(gòu)建路徑:使用HindⅢ單酶切中間載體pGEM-3Z-BJH及pBAC-LOW并連接,由于兩個中間載體的lacZα基因完全相同,兩者連接可得到lacZα尾尾相連或頭尾串聯(lián)兩種類型的重組質(zhì)粒,但只有l(wèi)acZα頭尾串聯(lián)重組的菌株保持兩個完整的lacZα基因,從而在藍(lán)白斑篩選中呈現(xiàn)藍(lán)斑。挑取藍(lán)斑測序驗(yàn)證最終得到同時具有高拷貝特性及擴(kuò)增大片段能力的載體pBAC-BJH(圖2)。

圖2 pBAC-BJH載體構(gòu)建流程圖

圖3 利用構(gòu)建的BAC載體對CYP2A6新突變355A>T開展單倍型分析

3.pBAC-BJH可用于大片段DNA的克隆及分型鑒定:為驗(yàn)證新構(gòu)建BAC載體的有效性,本研究利用STI PCR方法成功擴(kuò)增了CYP2A6的啟動子區(qū)及全部外顯子區(qū),產(chǎn)物長度為9576bp(圖3A),利用傳統(tǒng)的限制性內(nèi)切酶酶切與連接的方式,將擴(kuò)增產(chǎn)物與同樣雙酶切的pBAC-BJH載體連接并化學(xué)轉(zhuǎn)化大腸桿菌(圖3B),通過對獲得的不同BAC克隆進(jìn)行測序分析,對CYP2A6的不同單倍型進(jìn)行基因分型解析。前期研究中筆者團(tuán)隊(duì)在1例漢族志愿者中檢測到了一種新的SNP突變355A>T,該SNP位于CYP2A6基因的外顯子3,可引起第119位的氨基酸由絲氨酸突變?yōu)榘腚装彼?即S119C),同時PCR產(chǎn)物測序發(fā)現(xiàn),該突變攜帶者在外顯子1還存在另外兩個SNP位點(diǎn),分別是22C>T及51A>G(圖3C)。隨機(jī)挑選4個BAC克隆并進(jìn)行測序分析,發(fā)現(xiàn)全部克隆均攜帶新突變355A>T及51A>G,但并不攜帶22C>T。據(jù)此,本研究認(rèn)為,攜帶者的22C>T、51A>G、355A>T 3個SNP單倍型分析結(jié)果為CGT。

討 論

BAC載體在基因組文庫構(gòu)建、物理圖譜制作、基因組測序等研究中有著不可取代的位置[10～12]。BAC載體相較λ噬菌體、Cosmid黏粒以及YAC載體,同時兼?zhèn)洳迦肫未?、無嵌合現(xiàn)象、轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點(diǎn)。但其低拷貝的特性導(dǎo)致BAC質(zhì)粒提取時需大量培養(yǎng)菌體,且純化過程復(fù)雜,制備成本較高[7, 13]。為解決這一問題,Luo等[8]將高拷貝的pGEM-4Z克隆載體與低拷貝的BAC載體pLindigoBac536偶聯(lián),得到高拷貝復(fù)合載體pCUGIBAC1。使用時該載體利用EcoRⅠ或HindⅢ單酶切的方式,可將連入的pGEM-4Z部分去除,獲得與低拷貝BAC載體同樣特性的接收載體,用于外源大片段DNA的插入。隨后該載體成功應(yīng)用于鯊魚、對蝦等物種的基因組測序分析[14, 15]。但另一方面,隨著測序技術(shù)的更迭及大規(guī)模基因組計(jì)劃的完成,人們已不再需要將數(shù)百kb的大片段基因組DNA克隆入BAC載體進(jìn)行測序分析,反而需要對僅數(shù)kb的片段進(jìn)行亞克隆,并對其包含的眾多SNP進(jìn)行單倍型分析。傳統(tǒng)BAC載體通常僅使用EcoRⅠ或HindⅢ等少數(shù)幾種內(nèi)切酶單酶切以用于外源DNA片段的插入,這種方式一方面容易造成載體自連,另一方面可用內(nèi)切酶的數(shù)量稀少,大大限制了不同基因克隆時的應(yīng)用范圍。為此,本研究對兩個入門的載體pGEM-3Z及pBeloBAC11進(jìn)行了遺傳改造,在BamHⅠ和HindⅢ之間加入了BstBⅠ等7種酶切位點(diǎn),大幅提升了BAC載體在大片段基因克隆時的適用性,同時又保證lacZα正常功能的行使,方便利用藍(lán)白斑篩選來鑒定載體中是否有外源DNA片段的插入(圖1、圖2)。雙酶切方式的引入,一方面降低了載體自連的概率,同時又提高了外源基因的插入效率,即便使用熱激轉(zhuǎn)化的低效質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方式仍然可以獲得較高的陽性克隆效率(圖3)。

細(xì)胞色素p450(簡稱CYP或p450)酶系是一類最重要的藥物代謝酶,參與超過80%的臨床藥物的體內(nèi)代謝,其編碼基因呈現(xiàn)高度遺傳多態(tài)性,且在不同種族、不同地域間存在顯著差異,是造成個體間藥物代謝能力差異的最重要原因之一[16]。根據(jù)藥物基因變異聯(lián)盟PharmVar(Pharmagene Variation Consortium)網(wǎng)站的信息,多數(shù)CYP等位基因同時包含多個SNP位點(diǎn),且新等位基因申請時必須提供攜帶者包含的各SNP的單倍型信息[17]。CYP2A6是CYP2家族中的重要成員,該酶參與約3%臨床常用藥物的體內(nèi)代謝或活化[16]。與其他CYP基因類似,CYP2A6基因也呈現(xiàn)高度的遺傳多態(tài)性,并進(jìn)一步影響各變異體的藥物代謝活性[18]。

本研究利用新構(gòu)建的高拷貝復(fù)合載體pBAC-BJH,成功對新發(fā)現(xiàn)的CYP2A6突變355A>T(非同義突變,可導(dǎo)致S119C變異)的攜帶者進(jìn)行了單倍型分析,結(jié)果表明,該載體及基因克隆和分型策略完全可應(yīng)用于其他CYP基因的遺傳分型分析。配合其他基因表達(dá)載體,該載體未來也可應(yīng)用于較大基因的克隆和表達(dá)分析[19]。需要指出的是,本研究由于采用了熱激轉(zhuǎn)化的方式將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌,雖然降低了使用門檻,無需購置價(jià)格高昂的電轉(zhuǎn)化儀,但獲得的陽性克隆數(shù)較少,且存在短片段插入干擾的問題。后期采用電轉(zhuǎn)化的方式有望進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化效率和分型效率。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。