牛明芬 謝田賓 王顏紅 周 強(qiáng) 王鏡然

(1.沈陽建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院,遼寧 沈陽 110168;2.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所,遼寧 沈陽 110016)

近年來,在綠色有機(jī)農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)種植過程中,有機(jī)肥的施加是提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì)的一項(xiàng)有效措施。研究發(fā)現(xiàn),采用有機(jī)肥替代部分化肥施用,可在滿足作物生長需求的同時(shí),獲得產(chǎn)量增長和品質(zhì)提升的效果[1]。王明文等[2-3]研究表明,有機(jī)肥替代40%化肥會(huì)使大蒜增產(chǎn)15.93%,使其維生素C(Vc)、可溶性糖和可溶性蛋白分別提高24.41%、31.77%和72.55%;有機(jī)肥替代20%化肥會(huì)使黃瓜增產(chǎn)59.54%,使其Vc、可溶性糖和粗蛋白分別提高49.46%、16.23%和44.44%。由此看來,有機(jī)肥已成為促進(jìn)綠色農(nóng)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的重要手段。

我國使用的有機(jī)肥大多來自于養(yǎng)殖場的畜禽糞便[4],而隨著現(xiàn)代規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,抗生素的濫用會(huì)導(dǎo)致畜禽糞便中殘留有各種抗生素。已有報(bào)道指出,大部分抗生素不能被動(dòng)物機(jī)體完全吸收,大約有40%～90%的抗生素以原形或代謝物形式隨糞便排出體外[5]。直接施用畜禽糞肥可導(dǎo)致大量抗生素進(jìn)入土壤,隨著抗生素進(jìn)入土壤時(shí)間的增長,土壤中的微生物對抗生素的耐藥性會(huì)增強(qiáng),進(jìn)而產(chǎn)生大量抗藥菌[6]。土壤中抗藥菌的不斷增多,對土壤中其他微生物菌群的群落結(jié)構(gòu)或功能造成影響[7],同時(shí)顯著提升土壤微生物菌群中抗生素抗性基因(ARGs)的豐度[8]。施用未腐熟的有機(jī)肥,長時(shí)間以來土壤中環(huán)境的變化會(huì)導(dǎo)致種植出的農(nóng)產(chǎn)品抗性下降,病蟲害增多[9]。張明[10]和馬鳴超等[11]均研究表明,未腐熟的有機(jī)肥若不加處理直接施入農(nóng)田會(huì)引起病蟲害的產(chǎn)生、提高作物發(fā)病率。因此,對當(dāng)前農(nóng)田土壤中抗生素殘留現(xiàn)狀進(jìn)行研究分析就顯得尤為重要。

1 農(nóng)田土壤抗生素殘留水平

有機(jī)肥施用是保障我國糧食生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)之一,但施用處理不當(dāng)?shù)挠袡C(jī)糞肥,長期累積對農(nóng)田土壤和農(nóng)產(chǎn)品帶來的抗生素殘留問題越來越嚴(yán)重。通過對查閱的文獻(xiàn)進(jìn)行匯總,農(nóng)田土壤抗生素殘留水平如表1所示。

表1 農(nóng)田土壤抗生素的殘留水平1)Table 1 The residual level of antibiotics in farmland soil

隨著有機(jī)綠色農(nóng)業(yè)的持續(xù)發(fā)展和關(guān)注,有機(jī)糞肥的施用量越來越大,國內(nèi)外農(nóng)田土壤中抗生素的殘留水平也不斷升高。農(nóng)田土壤中四環(huán)素類抗生素殘留最為嚴(yán)重。AN等[12]研究表明,沈陽地區(qū)某農(nóng)田土壤中土霉素和金霉素分別高達(dá)1 398.47、1 590.16 μg/kg,四環(huán)素也接近1 000.00 μg/kg。尹春艷等[13]研究發(fā)現(xiàn),山東某典型設(shè)施蔬菜基地土壤中四環(huán)素類抗生素的檢出率為100%,平均為274.00 μg/kg,喹諾酮類抗生素檢出率為85%,平均為73.05 μg/kg。張慧敏等[14]對浙北地區(qū)某農(nóng)田表層土壤檢測發(fā)現(xiàn),土霉素、四環(huán)素和金霉素的檢出率分別為93%、88%和93%,平均殘留量分別為350.00、1 071.00、119.00 μg/kg,分別是未施畜禽糞肥農(nóng)田的39、13、12倍,可以看出施畜禽糞肥會(huì)帶來農(nóng)田土壤抗生素殘留。朱秀輝等[28]在廣州北郊蔬菜基地土壤上四環(huán)素類抗生素的檢出率在90%以上,通過層次分析法表明畜禽糞肥是土壤中四環(huán)素類抗生素的主要來源。由此可見,我國不同地區(qū)的農(nóng)田土壤抗生素殘留水平不同,大多地區(qū)的抗生素含量超出了國際獸藥協(xié)會(huì)(VICH)提出的土壤抗生素生態(tài)毒害效應(yīng)的觸發(fā)值(100.00 μg/kg)[29],表明土壤中普遍存在抗生素殘留。

不僅我國農(nóng)田土壤受到抗生素殘留困擾,國外亦如此。JACOBSEN等[21]發(fā)現(xiàn)丹麥地區(qū)的四環(huán)素類抗生素殘留量高達(dá)14 400.00 μg/kg。HO等[22]在馬來西亞某農(nóng)田土壤中發(fā)現(xiàn),強(qiáng)力霉素和恩諾沙星最高分別達(dá)728.00、378.00 μg/kg,氟甲喹最高達(dá)到了1 331.00 μg/kg,即使在施肥7個(gè)月后,檢測到的恩諾沙星也達(dá)到20.00 μg/kg。CARBALLO等[23]在奧地利某施用糞肥1～2個(gè)月后的農(nóng)田土壤中發(fā)現(xiàn),恩諾沙星和環(huán)丙沙星分別達(dá)到370.00、450.00 μg/kg。HAMSCHER等[24]在德國某施用糞肥后的農(nóng)田表層土(0～10 cm)中發(fā)現(xiàn),四環(huán)素平均為86.20 μg/kg,而在10～20 cm的土層中,增加到198.70 μg/kg?？梢钥闯?隨著畜禽糞肥施用時(shí)間的增長,土壤對抗生素累積的程度越大,隨著土壤深度的增加,殘留的抗生素含量也會(huì)增加。因此施用畜禽糞肥對土壤中抗生素的分布具有明顯影響,且國內(nèi)外的農(nóng)田土壤抗生素殘留情況均不容樂觀,對農(nóng)田土壤環(huán)境影響現(xiàn)狀進(jìn)行分析和評估很有必要。

2 農(nóng)田土壤抗生素殘留檢測方法

由于施用未經(jīng)處理的有機(jī)肥會(huì)對農(nóng)田土壤造成抗生素殘留和累積的影響,造成土壤抗生素污染隨之引發(fā)一系列的問題[30]。成熟有效的農(nóng)田土壤抗生素檢測方法是研究土壤抗生素污染問題的前提。準(zhǔn)確檢測出農(nóng)田土壤中抗生素的種類和含量,對于評估當(dāng)前農(nóng)田土壤抗生素殘留現(xiàn)狀、判斷抗生素對農(nóng)田土壤和農(nóng)產(chǎn)品的影響、防治抗生素污染具有重要意義。目前土壤中抗生素檢測的主要方法有傳統(tǒng)的生物法、免疫分析法以及理化分析法,理化分析法主要包括毛細(xì)管電泳法、液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法[31],不同檢測方法比較見表2。

表2 土壤中抗生素檢測方法比較Table 2 Comparison of detection methods of antibiotics in soil

土壤中抗生素的殘留檢測分析起源于1981年,WARMAN等[32]采用生物法發(fā)現(xiàn)了用雞糞施肥的土壤中存在金霉素,當(dāng)時(shí)該方法的回收率較低,僅為22%～28%。后來隨著技術(shù)的進(jìn)步,研發(fā)出基于碳納米管的免疫分析新方法,韋薇[33]建立可用于土壤中慶大霉素檢測的抑制曲線,測得土壤中慶大霉素在0.198～0.380 ng/g,其檢測限和線性范圍良好。再后來,出現(xiàn)了毛細(xì)管電泳法。左艷麗[34]研究發(fā)現(xiàn),該方法可檢測土壤中磺胺間二甲氧基嘧啶、磺胺甲基嘧啶和磺胺嘧啶分別在≥0.070、≥0.063、≥0.056 mg/kg水平上的殘留。李興華等[35]采用固相萃取前處理,高效毛細(xì)管電泳法檢出養(yǎng)殖場附近土壤中磺胺嘧啶和磺胺噻唑分別為0.044 3、0.043 5 mg/kg。根據(jù)研究發(fā)現(xiàn),農(nóng)田土壤中殘留的抗生素不僅僅以單一的形式存在,而大多是以復(fù)合的形式存在[36]。傳統(tǒng)的一些方法存在單檢測、不全面或無法對大量數(shù)據(jù)進(jìn)行準(zhǔn)確分析等問題,近年來發(fā)展出的一種高效、全面且靈活的手段可以解決這一瓶頸——高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)。通過試驗(yàn)優(yōu)化不同的提取方法,結(jié)果均有良好的回收率和低的檢測限[37],[42-43]。胡鈺等[38]基于固相萃取—超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對6個(gè)不同地區(qū)的農(nóng)田土壤中7類共30種抗生素殘留進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,檢出的17種抗生素中有12種檢出率達(dá)100%,總量為73.4～184.0 μg/kg,說明該方法具有高效靈敏等特點(diǎn)。

傳統(tǒng)的土壤抗生素生物檢測法在過去的一段時(shí)間內(nèi)占主導(dǎo)地位[44],由于其回收率和靈敏度較低等原因逐漸被淘汰。免疫分析法雖然具有良好的檢測限和線性范圍,但是其準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性較差[45]。毛細(xì)管電泳法具有低檢出限、高回收率的特點(diǎn),但是后來隨著高效液相色譜法(HPLC)的出現(xiàn),也慢慢替代了毛細(xì)管電泳法。HPLC可以簡單快速地檢測出土壤樣品中殘留的抗生素,具有很強(qiáng)的分離能力,而后發(fā)展起來的HPLC-MS可以檢測更多種類、更多數(shù)量的抗生素,比HPLC具備準(zhǔn)確度更高、檢測限更低等優(yōu)點(diǎn)[46],該方法儀器設(shè)備成熟,測試結(jié)果接受度高,并且還形成了通用的標(biāo)準(zhǔn)方法。這些方法的比較結(jié)果顯示,無論是靈敏度、還是檢測范圍,HPLC-MS都具有非常明顯的優(yōu)勢。

但是由于土壤環(huán)境相對較復(fù)雜,分析方法的局限性將會(huì)是限制土壤中抗生素殘留研究的一個(gè)重要原因[39]53。而組學(xué)技術(shù)是對一類個(gè)體系統(tǒng)集合的全景分析技術(shù),它依托高通量的現(xiàn)代化分析儀器,基于色譜、質(zhì)譜等獲取的大量數(shù)據(jù)或峰圖[39]54,通過分析其中的特征抗生素來定性。YANG等[47]使用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(HPLC-MS/MS)對非洲肯尼亞不同地區(qū)的農(nóng)田土壤中抗生素進(jìn)行檢測,采用SPSS軟件組學(xué)分析出12種抗生素的濃度存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,采用單因素方差法分析出不同采樣點(diǎn)的抗生素存在組間差異,并且表明肯尼亞農(nóng)田土壤中主要是四環(huán)素和喹諾酮類抗生素污染。

組學(xué)分析方法的出現(xiàn)使得對土壤中多種類抗生素的鑒別更加靈敏,大幅度提高了分析效率,為農(nóng)田土壤中抗生素的檢測和殘留分析提供方法學(xué)基礎(chǔ)。抗生素檢測方法的研究,對加強(qiáng)農(nóng)田土壤抗生素污染監(jiān)控與防治,有著極為重要的意義。對查閱的農(nóng)田土壤抗生素檢測方法文獻(xiàn)進(jìn)行匯總,其應(yīng)用占比如圖1所示。

圖1 抗生素檢測方法應(yīng)用占比Fig.1 Application ratio of antibiotic detection methods

3 抗生素對土壤微生物菌群與ARGs的影響

3.1 抗生素殘留對土壤中微生物菌群的影響

土壤微生物菌群是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,是衡量土壤肥力的重要指標(biāo),大多數(shù)土壤過程都離不開土壤微生物的參與[48]。大量未經(jīng)處理的畜禽糞便作為肥料直接施用于農(nóng)田,某些殘留的抗生素會(huì)被農(nóng)田土壤吸附并積累[49]1435。土壤中累積的抗生素會(huì)抑制其靶標(biāo)微生物的生長繁殖和代謝活動(dòng),選擇性地誘殺土著微生物或誘導(dǎo)耐藥菌的產(chǎn)生,影響了土壤中微生物菌群多樣性;其他未受到抑制的微生物能夠獲得大量資源而快速繁殖,改變了微生物群落結(jié)構(gòu)和功能[50]21,破壞土壤微生態(tài)平衡。

3.1.1 影響土壤微生物的活性

殘留的抗生素進(jìn)入土壤后,由于抗生素本身的作用,能對土壤中微生物產(chǎn)生各種毒性效應(yīng),可以直接殺死土壤環(huán)境中某些微生物菌群或抑制其活性[51]。有研究表明,當(dāng)有機(jī)肥輸入達(dá)到閾值水平(9 000 kg/hm2)時(shí),可以改變土壤抵抗力,過度施用肥料會(huì)抑制土壤微生物活性[52]。還有研究表明,抑制微生物活性的有效抗生素劑量為0.003～7.350 μg/g,這取決于抗生素種類及其土壤吸附,并且根據(jù)分配系數(shù)計(jì)算,0.200～160.000 ng/g的抗生素顯著減少了土壤細(xì)菌的數(shù)量[53]。

據(jù)研究,土壤中抗生素的殘留對土壤微生物的呼吸、氨化、硝化以及磷轉(zhuǎn)化作用等均有抑制作用[54]。土壤呼吸作用是衡量土壤微生物總體活性的指標(biāo)。劉鋒等[55]實(shí)驗(yàn)表明,磺胺類和甲氧芐啶抗生素對土壤呼吸作用影響較大,而四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素對土壤呼吸作用影響不大。袁德梽[56]實(shí)驗(yàn)表明,不同濃度的抗生素殘留對土壤呼吸作用表現(xiàn)出的抑制水平不同,抗生素殘留濃度越大,抑制水平相對越高。楊基峰等[57]研究發(fā)現(xiàn),磺胺嘧啶、氧四環(huán)素和諾氟沙星3種抗生素對土壤呼吸的最大抑制率分別為76.8%、20.7%和21.9%,并且高濃度的抗生素對土壤微生物的硝化作用表現(xiàn)出不同程度的抑制作用。

3.1.2 影響土壤微生物菌群多樣性

抗生素進(jìn)入土壤后會(huì)擾亂土壤中微生物菌群的正常秩序[58],長時(shí)間以來,土壤中的微生物對抗生素的耐藥性增強(qiáng),進(jìn)而產(chǎn)生耐藥菌[59]。SENGELOV等[60]在長期施用豬糞的農(nóng)田中發(fā)現(xiàn)了大量的耐藥菌株：四環(huán)素耐藥菌每毫升高達(dá)8.75×107個(gè),鏈霉素耐藥菌每毫升高達(dá)2.3×107～4.6×107個(gè),且豬糞使用量越大,耐藥菌株的耐藥性越強(qiáng)。隨著耐藥菌的不斷增多,土壤中其他微生物菌群的多樣性將下降,從而導(dǎo)致土壤環(huán)境受影響。曾悅等[61]的研究表明,氟喹諾酮類和四環(huán)素類抗生素在>10 mg/kg時(shí),對土壤中微生物多樣性會(huì)表現(xiàn)出抑制作用,磺胺類抗生素在≥100 mg/kg后,其抑制作用更加顯著。UDDIN等[62]研究表明,水稻土受獸用抗生素污染后可引起細(xì)菌多樣性降低。張海豐等[63]通過模擬實(shí)驗(yàn)論證了土壤受不同濃度磺胺甲惡唑污染后,土壤細(xì)菌的多樣性顯著降低(P<0.05)。抗生素藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與細(xì)菌生長所需的氨基苯甲酸很相似,可與氨苯甲酸競爭二氫葉酸合成酶,妨礙二氫葉酸的形成,最終影響細(xì)菌核蛋白的合成,從而抑制細(xì)菌的生長繁殖[64]。

Chao1和Shannon多樣性指數(shù)是評價(jià)微生物菌群多樣性的重要指標(biāo),多樣性指數(shù)越高表明微生物菌群的豐富度和多樣性越高。馬驛等[65]實(shí)驗(yàn)表明,恩諾沙星影響下土壤微生物菌群的豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)顯著低于空白對照組,且抗生素濃度越高,豐富度和多樣性越小。于曉雯等[66]實(shí)驗(yàn)表明,四環(huán)素類抗生素隨畜禽糞肥進(jìn)入土壤中改變了土壤微生物菌群的相對豐度,對四環(huán)素類抗生素適應(yīng)能力較強(qiáng)的菌群相對豐度升高,對其較敏感的其他菌群相對豐度下降。由此可見,抗生素的殘留會(huì)使土壤中微生物的數(shù)量下降,土壤微生物菌群的多樣性降低。

3.1.3 影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及功能

土壤微生物對土壤環(huán)境的變化非常敏感,通常情況下,土壤中微生物群落組成處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)。殘留抗生素的加入改變了土壤的理化性質(zhì),使得土壤中微生物群落組成和功能發(fā)生相應(yīng)的動(dòng)態(tài)改變[67]。張躍華等[68]和湯瑋婧等[69]曾在早期的實(shí)驗(yàn)中表明,在向土壤中施入抗生素后,細(xì)菌和真菌數(shù)目隨抗生素濃度的增加整體呈減少趨勢,放線菌數(shù)目整體呈上升趨勢。HEUER等[70]實(shí)驗(yàn)表明,通過向土壤中施加含不同質(zhì)量濃度(0、10、100 mg/kg)磺胺嘧啶的豬糞,可導(dǎo)致土壤中細(xì)菌群落受到影響,甚至能持續(xù)兩個(gè)月以上。汪勇等[71]在長期施用新鮮雞糞、新鮮豬糞的土壤中檢測到四環(huán)素抗性細(xì)菌數(shù)量比普通土壤高出3～4個(gè)數(shù)量級,四環(huán)素抗性細(xì)菌占可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)的比例比表施化肥高出37～500倍,抗性細(xì)菌豐度的改變使得糞肥處理的土壤和其他處理有顯著不同的群落結(jié)構(gòu);并且他們還發(fā)現(xiàn)深層土(10～20 cm)中抗性細(xì)菌數(shù)量比表層土(0～10 cm)高出2%～6%。

由于抗生素在土壤中有假持久性,土壤中微生物群落的功能也會(huì)發(fā)生改變。早在2001年,WESTERGAARD等[72]在土培條件下研究了泰樂素對土壤微生物群落功能的影響,結(jié)果表明泰樂素抑制了土壤中某些細(xì)菌類群的生長功能。王加龍等[73]研究表明,較低濃度的恩諾沙星殘留不影響土壤微生物群落功能多樣性,而相對較高濃度的恩諾沙星殘留則能夠降低土壤微生物群落功能多樣性。KONG等[74]將從土壤中提取的微生物群落暴露于含有土霉素的生理鹽水溶液,發(fā)現(xiàn)土壤微生物群落功能多樣性隨土霉素濃度升高顯著降低。

應(yīng)用宏基因組技術(shù)能夠解析復(fù)雜環(huán)境中微生物群落物種組成[75],但是目前該技術(shù)主要應(yīng)用于研究抗生素對水環(huán)境微生物群落的影響[76],而對于抗生素脅迫下土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)變化鮮有報(bào)道。

3.2 抗生素殘留對土壤ARGs的影響

3.2.1 畜禽糞肥施用土壤中的ARGs

含有抗生素的畜禽糞肥進(jìn)入土壤長時(shí)間以來,土壤微生物群落構(gòu)成了選擇壓力,會(huì)導(dǎo)致其產(chǎn)生ARGs[49]1436。雖然EDDTE[77]的研究表明,在未受影響的土壤中,微生物自身擁有豐富多樣的抗藥性及ARGs(比如MARC等[78]就曾在17個(gè)南極土壤樣品中發(fā)現(xiàn)了177種自然存在的ARGs),但是ARGs被認(rèn)定為一種新型的環(huán)境面源污染物,可以通過基因水平轉(zhuǎn)移作用在微生物之間傳播或自我擴(kuò)增[79],具有難被生物降解的特性。土壤中抗生素殘留被認(rèn)為是加劇ARGs形成與傳播的主要因素[80]。土壤微生物群落中ARGs豐度的提高使農(nóng)田土壤成為了ARGs的一個(gè)儲存庫[81]。研究表明,土壤微生物通過產(chǎn)生抗性基因來適應(yīng)含抗生素的土壤,即使最后土壤環(huán)境中的抗生素污染可以消除,已經(jīng)形成抗性的微生物和抗性基因仍然會(huì)在土壤環(huán)境中持續(xù)存在,從而會(huì)對整個(gè)土壤系統(tǒng)造成危害[82]。

抗生素的不規(guī)范使用也會(huì)誘導(dǎo)動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生ARGs,隨畜禽糞便排放后對土壤環(huán)境將造成一定的影響[83]。近年來,有許多學(xué)者從畜禽糞便中檢測出ARGs,如四環(huán)素類ARGs：tetA、tetC、tetE、tetG、tetM、tetO、tetQ和tetT;磺胺類ARGs：sul1、sul2和sul3;喹諾酮類ARGs：oqxB、qnrS和qnrD;鏈霉素類ARGs：strA、strB;氨基糖苷類ARGs：aadA;大環(huán)內(nèi)酯類ARGs：ermB、ermF等[84]3435,[85]6938,[86-87]。這表明畜禽糞便中存在豐富多樣的抗性基因,多種抗性機(jī)制并存已成為一種普遍現(xiàn)象。不同類ARGs在不同糞便中賦存不同,總濃度為雞糞>豬糞>牛糞,且喹諾酮類和磺胺類ARGs的分布最為普遍豐富[85]6939。而土壤中ARGs的相對豐度按類別依次為四環(huán)素類>磺胺類>氯霉素類>氨基糖苷類[88]。

3.2.2 對ARGs種類和豐度的影響

畜禽糞肥的長期施用,抗生素的加入引起土壤理化環(huán)境波動(dòng),會(huì)通過富集或抑制土壤中的相關(guān)菌屬直接影響ARGs豐度,并改變移動(dòng)元件(MGEs)的豐度來對ARGs產(chǎn)生間接作用[50]14,從而影響土壤原有ARGs的組成和豐度。HAN等[89]認(rèn)為施用豬糞和雞糞通過影響土壤的理化性質(zhì),增加土壤中細(xì)菌的豐度,進(jìn)而影響土壤中ARGs和MGEs的豐度;研究表明,46.3%的ARGs變異可以由細(xì)菌群落(27.6%)、MGEs(8.9%)、土壤理化性質(zhì)(4.2%)、細(xì)菌群落+ MGEs(1.5%)、細(xì)菌群落+土壤理化性質(zhì)(1.9%)、MGEs+土壤理化性質(zhì)(1.4%)和細(xì)菌群落+土壤理化性質(zhì)+MGEs(0.8%)解釋。

目前已有多項(xiàng)研究顯示,施用集約化養(yǎng)殖的畜禽糞肥會(huì)引起農(nóng)田土壤中的ARGs種類增加,豐度和檢出率提高[90]。ARGs從糞便到土壤的水平轉(zhuǎn)移會(huì)導(dǎo)致土壤中長期存在ARGs[91],CHEN等[92]在長期施用雞糞的農(nóng)田土壤中發(fā)現(xiàn),130個(gè)不同亞型的ARGs豐度(102～103)均顯著高于無雞糞添加對照組(10-2～10),通過Shannon和Simpson指數(shù)計(jì)算出雞糞處理顯著增加了ARGs的多樣性。TANG等[93]在長期施用糞肥的水稻土中發(fā)現(xiàn),土壤中抗生素殘留質(zhì)量濃度達(dá)8 750 μg/kg,不同地區(qū)的ARGs豐度均上升1～2個(gè)數(shù)量級不等(見圖2),可以看出ARGs的豐度與施用畜禽糞肥的關(guān)系呈顯著正相關(guān)。FANG等[94]在對施用雞糞的蔬菜大棚土壤中ARGs和人類病原菌(HPB)的研究發(fā)現(xiàn),長期施用糞肥的溫室土壤中抗生素、ARGs、HPB種類和HPB中ARGs含量更高,分別為22類、32種、46種和156.2～5 001.4 μg/kg。一旦這些具有抗生素耐藥性的人類致病菌(如假單胞菌屬)進(jìn)入食物鏈,可能會(huì)造成感染風(fēng)險(xiǎn)。并且還有研究表明,施肥3年的土壤中的ARGs豐度最高,比對照土壤高出近3×105倍;施肥年限大于10年的土壤中磺胺類ARGs豐度最高,約為對照土壤的105倍;施肥土壤中耐藥菌率是對照土壤的5倍[95]。

注：數(shù)據(jù)來自文獻(xiàn)[93]。圖2 4個(gè)地區(qū)不施肥與施肥土壤中ARGs豐度對比Fig.2 ARGs abundance in fertilized and unfertilized soils in four regions

隨著科技的發(fā)展,高通量測序、生物信息學(xué)和組學(xué)分析技術(shù)的發(fā)展為多尺度、多層次研究ARGs的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散途徑及機(jī)制提供了科學(xué)手段。例如,ZHU等[84]3438采用高通量熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法對我國3個(gè)商業(yè)養(yǎng)豬場的糞便及施加糞肥的土壤進(jìn)行檢測,共發(fā)現(xiàn)5大類共149種ARGs,其中有63種ARGs的豐度顯著高于對照組192～28 000倍。FORSBERG等[96]對18個(gè)農(nóng)田土壤中18種抗生素進(jìn)行了功能宏基因組選擇,發(fā)現(xiàn)了2 895個(gè)新的ARGs。SU等[97]利用功能基因組學(xué)的方法從土壤樣品中篩選出多種ARGs,同已知ARGs相比,發(fā)現(xiàn)氨基酸水平上只有2%的ARGs相似性在90%以上,而67%以上的ARGs相似性低于60%。這表明環(huán)境中還有很多尚未被認(rèn)識的ARGs,可能會(huì)有更多的ARGs在土壤微生物間傳播轉(zhuǎn)移,致使更多土壤微生物獲得抗性,從而引起更多抗藥細(xì)菌的出現(xiàn),對土壤環(huán)境造成一定的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

3.2.3 ARGs的消減

為了有效扼制ARGs傳播到土壤,眾所周知,高溫堆肥處理是減少畜禽糞便中ARGs的一種有效手段。利用堆肥過程產(chǎn)生的高溫,可有效去除耐藥微生物和耐藥質(zhì)粒,并降解糞便中殘留的抗生素,減少ARGs的水平轉(zhuǎn)移[98]。研究表明,堆肥10 d后,ARGs總量下降了4～6個(gè)數(shù)量級,ARGs的絕對豐度隨著堆肥過程的進(jìn)行而逐漸降低,抗性基因aadA、sul2、mcr-1、oqxB的消減率分別為89.39%、97.99%、99.89%、99.81%,多重耐藥大腸桿菌16S rRNA基因消減速率為0.128 d-1,半消減期為5.41 d,耐藥基因消減規(guī)律符合一級動(dòng)力學(xué)方程[99]。也有研究表明,在堆肥中加入化學(xué)抑制劑(如吲哚、胺類、石灰氮等)可增強(qiáng)ARGs的去除效果,從而降低ARGs的豐度[100]。但是,目前采用的仍是傳統(tǒng)的堆肥法,處理過程中存在多種調(diào)控因素,如堆肥的溫度、高溫持續(xù)時(shí)間、pH、含水量、生物量以及供氧量等,因此還需要進(jìn)一步探討新型ARGs消減技術(shù)。

未經(jīng)處理的畜禽糞肥被認(rèn)為是土壤ARGs的主要來源,施用集約化養(yǎng)殖的畜禽糞肥導(dǎo)致土壤中抗生素殘留擾亂了土壤微生物菌群,造成土壤生態(tài)環(huán)境紊亂,致使土壤產(chǎn)生更多ARGs。相比抗生素帶來的危害,ARGs的出現(xiàn)對農(nóng)業(yè)產(chǎn)地環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品的影響更加嚴(yán)峻,所以對ARGs源頭的控制和削減就尤為重要。

綜上所述,土壤中微生物菌群對土壤中ARGs的賦存具有一定的影響,而ARGs功能的行使需要以微生物為載體,二者之間的變化可以直觀地表明土壤中抗生素殘留的狀況,可以作為評估農(nóng)田土壤抗生素殘留狀況的一種手段。

4 結(jié)論與展望

施用未經(jīng)處理的有機(jī)糞肥可導(dǎo)致農(nóng)田土壤中抗生素殘留風(fēng)險(xiǎn),現(xiàn)代的檢測技術(shù)和組學(xué)理念能更高效、科學(xué)地發(fā)現(xiàn)和解釋土壤抗生素影響水平。抗生素殘留可導(dǎo)致土壤微生物菌群中抗性細(xì)菌數(shù)量增加,土壤中ARGs豐度增加。

目前畜禽糞肥中抗生素殘留對土壤微生物影響的研究已經(jīng)有很多,大多是基于對微生物群落結(jié)構(gòu)和功能變化的現(xiàn)象描述,缺乏更為深入的機(jī)理及影響因素研究。而且抗生素長期存在于土壤環(huán)境中必然誘導(dǎo)抗性基因的產(chǎn)生,目前對抗性基因的傳播擴(kuò)散以及其可能造成的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)尚缺乏系統(tǒng)研究。希望未來可以對以下幾個(gè)方面加強(qiáng)研究：

(1) 鑒于抗生素濫用帶來的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn),亟待加強(qiáng)獸藥抗生素的使用規(guī)范、監(jiān)管,同時(shí)加強(qiáng)集約化養(yǎng)殖場糞尿的無害化處理技術(shù)研究,保障有機(jī)糞肥安全施用。

(2) 畜禽糞肥是土壤環(huán)境中抗生素的重要來源之一,未來還需進(jìn)一步探索其復(fù)雜組分對抗生素影響土壤微生物作用的機(jī)理,以充分了解和掌握殘留抗生素的畜禽糞肥在土地利用時(shí)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。

(3) 深入了解土壤微生物菌群和ARGs之間具體的作用機(jī)理及關(guān)系,利用微生物變化達(dá)到管理控制ARGs的傳播擴(kuò)散,從而為管控抗生素的負(fù)面環(huán)境影響提供科技支撐。