賈小慧,秦雪蓮,劉青,劉亞楠,廉喆

癲癇是兒童期最常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病,約占總?cè)巳喊l(fā)病率的50/10萬[1]。癲癇發(fā)作及合并癥如注意缺陷、焦慮及抑郁等可導(dǎo)致患兒嚴(yán)重生活障礙[2]。生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43(growth associated protein 43,GAP-43)是一種突觸前神經(jīng)末梢富集的胞膜磷蛋白,在神經(jīng)纖維發(fā)育、軸突再生及突觸功能維持等方面發(fā)揮重要的作用[3]。研究發(fā)現(xiàn),GAP-43的降低能夠促進(jìn)顳葉神經(jīng)細(xì)胞損失,促進(jìn)癲癇持續(xù)狀態(tài)的形成[4]。α-突觸核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)是腦神經(jīng)元含量最豐富的蛋白質(zhì)之一,參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放、突觸傳遞及神經(jīng)元凋亡等過程,與阿爾茨海默病、多發(fā)性硬化等神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病關(guān)系密切[5]。有學(xué)者在內(nèi)側(cè)顳葉癲癇患者中發(fā)現(xiàn)海馬神經(jīng)元中α-Syn沉積,其促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎性反應(yīng)及癲癇發(fā)作的發(fā)生[6-7]。目前癲癇患兒血清GAP-43、α-Syn表達(dá)及臨床意義尚不清楚。本研究檢測(cè)癲癇患兒血清GAP-43、α-Syn水平,探討兩者對(duì)癲癇的診斷價(jià)值,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年4月—2022年4月臨汾市人民醫(yī)院兒科診治小兒癲癇患者80例為癲癇組:男46例,女34例,年齡3～14(6.21±0.76)歲;病程2～37(7.34±2.15)個(gè)月;均無明顯誘因及癲癇家族史;癲癇類型:全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作45例,局灶性發(fā)作35例;根據(jù)第4版韋氏兒童智力量表評(píng)分[8]分為認(rèn)知功能障礙27例(評(píng)分≤69分),無認(rèn)知功能障礙53例(評(píng)分>69分)。選取同期醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科診治的暈厥患兒50例為暈厥組:既往均無神經(jīng)內(nèi)科疾病且經(jīng)頭顱影像學(xué)檢查排除器質(zhì)性病變,男27例,女23例,年齡4～12(6.17±0.69)歲。選取同期外科擇期手術(shù)的腹股溝斜疝患兒50例為對(duì)照組,均無神經(jīng)內(nèi)科疾病且經(jīng)頭顱影像學(xué)檢查排除器質(zhì)性病變,男27例,女23例;年齡3～14(6.09±0.71)歲。3組患兒性別、年齡之間比較,差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(T20190313001),患兒家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 癲癇組病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):① 原發(fā)性癲癇診斷符合國(guó)際抗癲癇聯(lián)盟的診斷及分類標(biāo)準(zhǔn)[9],且距離最近一次發(fā)作時(shí)間<1周;②首次發(fā)病,年齡≤14歲;③臨床資料完整。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)頭部計(jì)算機(jī)斷層掃描及磁共振成像等證實(shí)存在器質(zhì)性病變,包括腦外傷、腦發(fā)育畸形、顱內(nèi)占位及腦梗死等;②有癲癇家族史;③有神經(jīng)系統(tǒng)其他疾病;④合并肝腎等臟器功能障礙;⑤既往有抗癲癇治療或免疫抑制劑用藥史。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 血清GAP-43、α-Syn水平檢測(cè):采集研究對(duì)象清晨空腹靜脈血5 ml,室溫靜置1 h后離心留取上層血清,-20℃冰箱保存待測(cè)。以Multiskan FC酶標(biāo)儀(購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清GAP-43、α-Syn水平。GAP-43 ELISA試劑盒購(gòu)自上海臻科生物公司,貨號(hào)ZK-3466。α-Syn ELISA試劑盒購(gòu)自深圳子科生物公司,貨號(hào)ZK-H1620。試驗(yàn)步驟按照試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.3.2 腦電監(jiān)測(cè)及顱腦MR檢查:(1)常規(guī)腦電圖檢查?；純喝朐?2 h內(nèi)使用腦電采集監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)Nicolet one EEG v32)完成常規(guī)腦電圖檢查,出現(xiàn)異常腦電圖及不同頻段腦功能區(qū)功率升高為陽(yáng)性。異常腦電圖包括廣泛性或爆發(fā)性棘波、尖波、尖—慢綜合波、棘—慢綜合波、較多散在3 Hz左右δ波、背景以θ節(jié)律/δ波為主等;腦功能區(qū)功率升高頻段包括δ頻段、α頻段、θ頻段、δ+θ頻段。(2)顱腦多序列檢查。入院72 h內(nèi),采用德國(guó)西門子公司生產(chǎn)的1.5T超導(dǎo)MR成像系統(tǒng)進(jìn)行顱腦多序列檢查,提示顱內(nèi)非特異病變?yōu)殛?yáng)性,表現(xiàn)為腦積水、腦萎縮、腦內(nèi)囊腫、腦室擴(kuò)張、巨腦回形成、丘腦白質(zhì)體積減少、皮質(zhì)發(fā)育異常、脫髓鞘病變等。

1.3.3 癲癇嚴(yán)重程度評(píng)估:參考國(guó)立醫(yī)院癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度量表(National Hospital Seizure Severity Scale,NHS3)評(píng)分[10],評(píng)估癲癇患兒癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度。評(píng)分范圍1～27分,分值越高,癲癇發(fā)作越嚴(yán)重。

2 結(jié) 果

2.1 3組血清GAP-43、α-Syn比較 血清GAP-43水平癲癇組<暈厥組<對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05);血清α-Syn水平癲癇組>暈厥組>對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05),見表1。

表1 3組血清GAP-43、α-Syn水平比較Tab.1 Comparison of serum GAP-43,α-Syn levels in three groups

2.2 血清GAP-43、α-Syn在癲癇患兒不同臨床特征中比較 患兒血清GAP-43在癲癇局灶性發(fā)作、無認(rèn)知功能損害者中升高,α-Syn水平在癲癇局灶性發(fā)作、無認(rèn)知功能損害者中降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05),二者在患兒性別、年齡、腦電圖異常、頭顱MR異常者中比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),見表2。

表2 血清GAP-43、α-Syn在癲癇患兒不同臨床特征中比較Tab.2 Comparison of serum GAP-43,α-Syn in different clinical characteristics of children with epilepsy

2.3 血清GAP-43、α-Syn與癲癇嚴(yán)重程度的相關(guān)性 癲癇組患兒NHS3評(píng)分3～25 (14.57±3.22)分。Pearson相關(guān)性分析顯示,血清GAP-43水平與NHS3評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.645,P<0.001),血清α-Syn水平與NHS3評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.702,P<0.001)。

2.4 血清GAP-43、α-Syn及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)小兒癲癇的診斷價(jià)值 繪制血清GAP-43、α-Syn及兩項(xiàng)聯(lián)合預(yù)測(cè)小兒癲癇的診斷價(jià)值ROC曲線,并計(jì)算曲線下面積(AUC),結(jié)果顯示:血清GAP-43、α-Syn及兩項(xiàng)聯(lián)合預(yù)測(cè)小兒癲癇的AUC分別為0.740、0.738、0.835,二項(xiàng)聯(lián)合預(yù)測(cè)的AUC高于單項(xiàng)預(yù)測(cè),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=4.482、4.391,P均<0.001),見表3、圖1。

圖1 血清GAP-43、α-Syn及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)小兒癲癇的診斷價(jià)值ROC曲線Fig.1 ROC curve of diagnostic value of serum GAP-43,α-Syn and combined detection for pediatric epilepsy

表3 血清GAP-43、α-Syn及兩項(xiàng)聯(lián)合預(yù)測(cè)小兒癲癇的診斷價(jià)值分析Tab.3 Analysis of diagnostic value of serum GAP-43,α-Syn and two joint predictions for pediatric epilepsy

3 討 論

癲癇是嬰幼兒及兒童最常見也是最具有破壞性的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。全球范圍內(nèi),癲癇患病例數(shù)達(dá)5 000萬例,每年死亡例數(shù)達(dá)12.5萬例[11]。目前小兒癲癇的診斷主要根據(jù)間隔24 h的2次或2次以上無源性發(fā)作病史進(jìn)行判斷。雖然腦電圖、腦成像及基因檢測(cè)為癲癇的診斷提供了重要支持,但仍有一定的誤診率[12]。深入研究小兒癲癇的疾病機(jī)制,尋找能夠早期輔助診斷癲癇的血清生物標(biāo)志物,具有重要意義。

GAP-43是一種神經(jīng)細(xì)胞膜上的磷蛋白,在生長(zhǎng)錐及突觸前末梢中表達(dá)較為豐富,是軸突生長(zhǎng)的關(guān)鍵因子。GAP-43主要表達(dá)于嗅球、海馬及皮質(zhì)聯(lián)合區(qū)等可塑性區(qū)域中,神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在腦損傷時(shí)能釋放GAP-43等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)和再生[13]。本研究中,癲癇患兒血清GAP-43水平降低,提示GAP-43可能參與癲癇的發(fā)生。有學(xué)者在幼年大鼠腦可塑性模型中證實(shí),在戊四唑誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作持續(xù)10 h～3 d后,CA3、CA1等區(qū)域的GAP-43 mRNA水平下降,導(dǎo)致大腦內(nèi)神經(jīng)元形成異常的突觸聯(lián)系及病理性神經(jīng)環(huán)路,促進(jìn)癲癇的發(fā)生[14]。此外,癲癇患兒血清GAP-43水平與癲癇嚴(yán)重程度有關(guān),提示GAP-43的降低促進(jìn)癲癇的疾病進(jìn)展。有學(xué)者報(bào)道,癲癇患兒血清GAP-43水平與血鋅水平呈正相關(guān),GAP-43表達(dá)水平的降低導(dǎo)致神經(jīng)元損傷修復(fù)能力減弱,神經(jīng)元過度興奮及癲癇發(fā)作導(dǎo)致大量活性氧等氧自由基的產(chǎn)生,消耗機(jī)體抗氧化劑鋅等微量元素,造成氧化與抗氧化系統(tǒng)平衡失調(diào),加重神經(jīng)元損傷及癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度[15]。另外,Royero等[4]發(fā)現(xiàn),GAP-43的水平降低能夠激活賴氨酸受體,參與癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬中發(fā)生的神經(jīng)元丟失和皮質(zhì)神經(jīng)元的功能重組,促進(jìn)神經(jīng)元內(nèi)鈣離子內(nèi)流,激活鈣離子依賴性蛋白激酶,促進(jìn)神經(jīng)元信號(hào)傳導(dǎo)的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)[4]。本研究中,血清GAP-43水平在全身強(qiáng)直痙攣發(fā)作、伴有認(rèn)知功能損害的癲癇患兒中降低更為明顯。筆者分析,一方面是GAP-43水平降低能夠降低血鋅水平,阻斷抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ氨基丁酸,導(dǎo)致超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶合成不足,促進(jìn)全身強(qiáng)直痙攣發(fā)作[16]。另一方面,GAP-43水平降低導(dǎo)致其神經(jīng)修復(fù)能力減弱,過度氧化應(yīng)激加重小膠質(zhì)細(xì)胞中白介素1β等促炎性因子的表達(dá),誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡,造成患兒認(rèn)知功能損害[17]。因此,GAP-43的水平降低參與小兒癲癇的發(fā)生發(fā)展,是新的小兒癲癇血清標(biāo)志物。

α-Syn在中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前末梢及神經(jīng)元核內(nèi)廣泛表達(dá),是由140個(gè)氨基酸組成的可溶性小分子蛋白質(zhì)。α-Syn可以聚集形成不溶性的寡聚體,影響突觸小泡運(yùn)輸、減少神經(jīng)遞質(zhì)釋放及引起線粒體和突觸功能障礙,在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要作用[18]。近年來發(fā)現(xiàn),成年頑固性癲癇患者的腦脊液和血清中α-Syn水平均明顯升高,有助于頑固性癲癇的鑒別診斷及預(yù)后評(píng)估[19]。本研究中,癲癇患兒血清α-Syn水平升高,提示α-Syn可能參與促進(jìn)小兒癲癇的發(fā)生。既往學(xué)者在毛果蕓香堿誘導(dǎo)癲癇動(dòng)物模型中也證實(shí),海馬齒狀回和近中顳葉組織中α-Syn表達(dá)增加,而α-Syn的大量沉積能夠誘導(dǎo)神經(jīng)元局部炎性反應(yīng)的發(fā)生,損傷神經(jīng)細(xì)胞,誘導(dǎo)反應(yīng)性膠質(zhì)增生,促進(jìn)頑固性癲癇的發(fā)生[20]。本研究中血清α-Syn水平與癲癇嚴(yán)重程度呈正相關(guān),表明血清α-Syn升高參與促進(jìn)癲癇疾病進(jìn)展。分析其原因,α-Syn的表達(dá)升高能夠誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌產(chǎn)生白介素1β及白介素6等促炎細(xì)胞因子,促進(jìn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)、破壞血腦屏障并活化小膠質(zhì)細(xì)胞,加重癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度[21]。本研究中,伴有認(rèn)知功能損害的癲癇患兒血清α-Syn水平明顯升高,表明α-Syn有助于反映癲癇患兒認(rèn)知功能損害情況。分析其原因,α-Syn水平升高能夠誘導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎性反應(yīng)狀態(tài)的形成。有學(xué)者在內(nèi)側(cè)顳葉癲癇動(dòng)物模型中,發(fā)現(xiàn)海馬組織中α-Syn的蓄積能夠誘導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)及膠質(zhì)細(xì)胞的過度增殖,造成海馬硬化及長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)改變損傷動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶功能,導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的發(fā)生[6,22]。本研究通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn),血清GAP-43、α-Syn聯(lián)合對(duì)癲癇診斷的曲線下面積為0.835,診斷的敏感度和特異度分別為0.776、0.804,表明兩項(xiàng)聯(lián)合對(duì)于小兒癲癇具有較高的診斷價(jià)值,有望成為小兒癲癇早期診斷的生物標(biāo)志物。

綜上所述,小兒癲癇血清GAP-43降低,α-Syn表達(dá)升高,兩者與癲癇嚴(yán)重程度、發(fā)作類型及認(rèn)知功能損害有關(guān),均參與小兒癲癇的發(fā)生發(fā)展過程。血清GAP-43、α-Syn聯(lián)合對(duì)小兒癲癇具有較高的診斷效能,有利于輔助臨床醫(yī)生早期診斷小兒癲癇。本研究也存在局限性,如樣本量有限,納入研究對(duì)象可能存在一定的偏倚。另外,本研究未對(duì)腦脊液中GAP-43、α-Syn水平進(jìn)行檢測(cè),有待日后擴(kuò)大樣本量,設(shè)計(jì)嚴(yán)格病例對(duì)照研究,深入探索兩者的臨床價(jià)值。

利益沖突:所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

賈小慧、秦雪蓮:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過程,論文撰寫 資料搜集整理,論文修改;劉青、劉亞楠、廉喆:實(shí)施研究過程,數(shù)據(jù)收集,分析整理,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析