文 藝，蒙露露，王寶藝，韋飛雪，鄧 鵬，柳榮英

（1.八加一藥業(yè)股份有限公司, 廣西 桂林 541000；2.桂林市食品藥品檢驗(yàn)所, 廣西 桂林 541012；3.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院, 廣西 桂林 541000）

純陽(yáng)正氣膠囊是由廣藿香、姜半夏、土木香、陳皮、丁香、肉桂、蒼術(shù)、白術(shù)、茯苓等十七味中藥制成的膠囊劑，主要用于治療暑天感寒受濕、腹痛吐瀉、胸膈脹痛、頭痛惡寒、肢體酸重。純陽(yáng)正氣膠囊是藥典中收錄的純陽(yáng)正氣丸[1]的改良劑型，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多用于改善腸胃功能、止瀉等急性腸胃炎癥狀，其處方來(lái)源于晚清醫(yī)書《飼鶴亭集方》，其中的陳皮理氣健脾，活性成分橙皮苷可調(diào)節(jié)腸道菌群[2]、抑制腸道炎癥[3]；肉桂能改善消化系統(tǒng)，活性成分桂皮醛抗?jié)?、抗菌[4]；丁香溫中、暖腎、降逆，活性成分丁香酚抑菌、鎮(zhèn)痛[5]；各處方藥材藥性相輔相成。純陽(yáng)正氣膠囊參照純陽(yáng)正氣丸在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的含量測(cè)定項(xiàng)下均只有橙皮苷的測(cè)定，不能全面評(píng)價(jià)該制劑的質(zhì)量。多組分的定量分析已成為中成藥質(zhì)量控制的有效手段[6-7]。本研究采用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)對(duì)純陽(yáng)正氣膠囊中的橙皮苷、桂皮醛和丁香酚這3 個(gè)活性成分進(jìn)行測(cè)定，完善其質(zhì)量控制方法，為純陽(yáng)正氣膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供了依據(jù)。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

Agilent1260 Infinity 型高效液相色譜儀、DAD檢測(cè)器（Agilent Technologies 公司）；XS205DU 型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-600E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

圖1 純陽(yáng)正氣膠囊HPLC 圖

1.2 試藥

純陽(yáng)正氣膠囊（ 批號(hào)： 200901、 201201、210201、211001，八加一藥業(yè)股份有限公司）；橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)：110721-202019）、桂皮醛對(duì)照品（批號(hào)：110710-201821）、丁香酚對(duì)照品（批號(hào)：110725-201917）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純，Merck 公司）；其他試劑均為分析純；水為去離子水。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×150 mm,4 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫程序?yàn)? ～5 min，15%乙腈；5 ～10 min，15%～25%乙腈；10 ～12 min，25%～ 50%乙腈；12 ～16 min，50%～15%乙腈；柱溫為35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為284 nm；流速為1.0 ml/min，進(jìn)樣量為10 μl。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取橙皮苷、桂皮醛和丁香酚對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成濃度為1 125、510、991 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密吸取橙皮苷儲(chǔ)備液5 ml、桂皮醛儲(chǔ)備液1.25 ml、丁香酚儲(chǔ)備液4 ml 置于同一25 ml 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取上述混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇稀釋制成含橙皮苷36 μg/ml、桂皮醛4.08 μg/ml和丁香酚25.37 μg/ml 的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品10 粒內(nèi)容物研磨均勻，取粉末約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，稱定重量，超聲20 min，放冷至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備

按純陽(yáng)正氣膠囊處方及制劑工藝，分別制成缺陳皮、缺肉桂和缺丁香的陰性樣品，取陰性樣品按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.5 專屬性及系統(tǒng)適用性考察

分別取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖及相關(guān)參數(shù)。橙皮苷、桂皮醛和丁香酚的保留時(shí)間依次為6.983、10.399、11.729 min，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按橙皮苷、桂皮醛和丁香酚的峰計(jì)算分別為54 733、59 111 和83 997，且陰性樣品在對(duì)照品相應(yīng)位置沒(méi)有吸收峰，表明其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.6 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 ml，置10 ml 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以峰面積Y對(duì)濃度X（μg/ml）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.7 精密度試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液， 按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，橙皮苷、桂皮醛和丁香酚的峰面積RSD 分別為1.21%、1.14%、0.96%(n=6)，表明該方法精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下制備的供試品溶液（批號(hào)：210201），分別于0、2、4、6、8、12、24 h 按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果橙皮苷、桂皮醛和丁香酚峰面積的RSD 分別為1.28%、1.38%、2.77%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次的純陽(yáng)正氣膠囊（批號(hào)：210201）6 份，按“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，記錄色譜峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果橙皮苷、桂皮醛和丁香酚的平均含量分別為4.14、0.45、3.06 mg/g，RSD 分別為1.43%、1.71%、1.63%（n=6），表明該方法的重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的同一批次的純陽(yáng)正氣膠囊9 份（批號(hào)：210 201），每份約0.1 g，分別精密加入混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，配制成低、中、高3 個(gè)不同濃度的回收率溶液，每個(gè)濃度3 份，按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法操作，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，橙皮苷、桂皮醛和丁香酚的平均回收率分別為101.9%、98.0%、101.2%，RSD 值分別為2.3%、1.6%、2.3%(n=9)。

2.11 樣品含量測(cè)定

取4 批樣品，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 4 批次樣品含量測(cè)定結(jié)果(mg/g，n=3)

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

對(duì)于流動(dòng)相的選擇，本實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)研究分別考察了乙腈-0.5%磷酸溶液[8]、甲醇-水[9]、乙腈-水[10]作為流動(dòng)相時(shí)對(duì)橙皮苷、桂皮醛、丁香酚色譜峰的影響。其中，乙腈-0.5%磷酸流動(dòng)相無(wú)法使3 種成分分離；甲醇-水流動(dòng)相峰形矮且不尖銳，基線不平穩(wěn)；乙腈-水流動(dòng)相效果最佳，3 種成分分離度均大于1.5，峰形良好。對(duì)于檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇，DAD 檢測(cè)器全波長(zhǎng)掃描顯示橙皮苷、桂皮醛、丁香酚分別在282、290、284 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，3 種成分最大吸收波長(zhǎng)相近，故選擇284 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)，不影響3 種成分的吸收。

3.2 提取條件的考察

純陽(yáng)正氣丸對(duì)橙皮苷的含量測(cè)定采用了加熱回流的方法，因此本實(shí)驗(yàn)分別考察了回流和超聲兩種提取方式。加熱回流提取時(shí)桂皮醛含量的RSD較大，回收率差，考慮桂皮醛屬于易揮發(fā)性物質(zhì)[11]，受溫度影響大，文獻(xiàn)[12]報(bào)道也多以超聲提取為主，最終選擇以超聲作為提取方式，分別考察了超聲時(shí)間和提取溶劑。分別比較20、30、40 min 超聲的提取效果，20 min 為最佳提取時(shí)間；考慮橙皮苷、桂皮醛和丁香酚在溶劑中的溶解度，分別比較了甲醇、乙醇、稀乙醇和50%乙醇的提取效果，結(jié)果顯示甲醇提取時(shí)指標(biāo)成分含量較高，且無(wú)峰干擾，提取效果好。最后確定以甲醇作為提取溶劑，超聲提取20 min 的提取方法，簡(jiǎn)單便捷、結(jié)果準(zhǔn)確。

3.3 含量測(cè)定結(jié)果分析

對(duì)4 批純陽(yáng)正氣膠囊中橙皮苷、桂皮醛和丁香酚的含量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示不同批次樣品橙皮苷和桂皮醛的含量差異較大，丁香酚的含量波動(dòng)較小，這有可能與不同來(lái)源和不同批次藥材的質(zhì)量有關(guān)，這提示我們?cè)谥朴喓肯薅鹊臅r(shí)候除了要控制工藝，還要充分考慮藥材對(duì)終產(chǎn)品的影響，本次試驗(yàn)只測(cè)定了4 批不同批次的純陽(yáng)正氣膠囊樣品，后續(xù)將增加更多不同批次的樣品進(jìn)行測(cè)定研究，提升純陽(yáng)正氣膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。