許子藝，孫雨菡，樊 莉，盧光照，張鷹楠，張 翮

（海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥劑學(xué)教研室, 上海 200433）

阿霉素（DOX）是一種蒽環(huán)類化療抗生素，盡管其能有效治療多種實體腫瘤和血液惡性腫瘤，但對腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的無差別攻擊導(dǎo)致的毒副作用，使其臨床應(yīng)用受到限制[1-3]。特別是劑量依賴性心臟毒性最為突出，研究認(rèn)為氧化應(yīng)激是誘導(dǎo)心臟毒性的重要機制。其他常見的毒副作用還包括急性惡心嘔吐、口腔炎、胃腸道紊亂、脫發(fā)、神經(jīng)障礙和骨髓發(fā)育不全等[4-6]。同時，多藥耐藥的出現(xiàn)是DOX 使用的附加問題[2]。因此，需要尋求DOX新的劑型結(jié)構(gòu)來降低藥物毒副作用帶來的風(fēng)險。

金納米粒（AuNPs）具有毒副作用小、生物相容性良好的特性，且其具有粒徑大小可調(diào)控、表面易修飾、高效的光熱轉(zhuǎn)化等優(yōu)勢，常被用于腫瘤的診斷和治療[7-8]。AuNPs 表面可修飾連接抗腫瘤藥物、靶向肽、熒光物質(zhì)或功能化基團等，實現(xiàn)精準(zhǔn)治療和實時監(jiān)測[9]。常用的修飾配體為巰基（-SH），以形成Au-S 鍵的方式連接在AuNPs 表面，也可利用氨基與AuNPs 的靜電作用構(gòu)建載體，但有研究表明，巰基比氨基作用更強，不易斷裂[10]。

本研究制備了一種載DOX 的mPEG 修飾金納米粒AuNPs-mPEG@DOX，驗證了該納米載體在保持對乳腺腫瘤細(xì)胞殺傷活性的同時，降低了DOX 對正常乳腺細(xì)胞的毒副作用，為后續(xù)AuNPs連接DOX 用于腫瘤治療提供參考。

1 儀器和材料

1.1 儀器

ZD-85A 型氣浴恒溫震蕩培養(yǎng)箱（上海啟前電子科技有限公司）；十萬分之一電子天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司）；超純水系統(tǒng)、數(shù)顯pH 計（均為德國Sartorius 公司）；HDC-15K 型離心機（上海泰坦科技股份有限公司）；Zetasizer nano ZS 型激光粒度分析儀（英國Malvern 公司）；1260 Infinity II 型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；UV1800 型紫外可見分光光度儀（中國TECHCOMP 公司）。

1.2 藥品和試劑

金納米粒（20 nm，南京東納生物科技公司）；HS-mPEG5K（上海芃碩生物科技有限公司）；HSDOX（西安瑞禧生物科技有限公司）；乙腈、三乙胺、磷酸，均為色譜純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 細(xì)胞

人乳腺細(xì)胞（MCF-10A）、人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7），均由海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥劑學(xué)教研室提供。

2 方法

2.1 AuNPs-mPEG@DOX 的制備和表征

2.1.1 AuNPs-mPEG 的制備

用純水溶解HS-mPEG5K得到濃度為1 mg/ml的HS-mPEG5K溶液，向1 ml AuNPs（50 μg/ml）中加入5 μl HS-mPEG5K溶液，4 ℃孵育8 h，孵育結(jié)束后于4 ℃、以12 000 g 離心10 min，棄去含未反應(yīng)HS-mPEG5K的上清液，純水重懸。

2.1.2 AuNPs-mPEG@DOX 的制備

用純水溶解HS-DOX 得到濃度為44.7 μg/ml的HS-DOX 溶液，取上步1 ml AuNPs-mPEG 重懸液離心，棄去上清液，用0.75 ml 純水重懸后，加入0.25 ml HS-DOX 溶液， 4 ℃孵育8 h，離心棄去含未反應(yīng)HS-DOX 的上清液，純水重懸。

2.1.3 粒徑分布和Zeta 電位

取1 ml AuNPs、AuNPs-mPEG 和AuNPs-mPEG-@DOX 溶液于馬爾文Zeta 電位樣品池，使用激光粒度分析儀測定粒徑和Zeta 電位，每個樣品測量3 次。

2.1.4 UV-Vis

取1 ml AuNPs、AuNPs-mPEG 和AuNPs-mPEG-@DOX 溶液于石英皿中，掃描波長400 nm～700 nm，以純水作為各樣品的純?nèi)軇﹨⒈冗M行光譜分析。

2.2 HS-DOX 投藥濃度對AuNPs-mPEG@DOX 吸附率和載藥量的影響

向1 ml 50 μg/ml AuNPs 中加入5 μl HS-mPEG5K溶液，4 ℃孵育8 h 后離心去上清，分別用0.937 5、0.875、0.75、0.5 ml 純水重懸AuNPs-mPEG，再分別加入0.062 5、0.125、0.25、0.5 ml HS-DOX 溶液，得到投藥濃度分別為2.79、5.59、11.18、22.35 μg/ml的反應(yīng)體系，4 ℃孵育8 h，離心取上清液，通過高效液相色譜法（HPLC）對上清液進行定量檢測，考察HS-DOX 投藥濃度對AuNPs-mPEG@DOX 吸附率和載藥量的影響。具體檢測方法見“2.3”項。

2.3 HS-DOX 色譜分析方法的建立

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Extend-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：水（0.1%三乙胺，磷酸調(diào)節(jié)pH 3.0）∶乙腈=75∶25；流速：1.0 ml/min；進樣量：10 μl；柱溫：室溫；檢測波長：254 nm。

2.3.2 溶液的制備

對照品溶液：精密稱取HS-DOX 4.47 mg，加純水在100 ml 量瓶中定容，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，得到濃度為44.7 μg/ml 的HS-DOX 對照品溶液。

供試品溶液：1 ml AuNPs-mPEG 離心沉淀用0.75 ml 純水重懸，加入0.25 ml HS-DOX（44.7 μg/ml），4 ℃孵育8 h，離心取上清液，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.3 專屬性考察

配制以下溶液：A：5.59 μg/ml HS-DOX 對照品溶液；B：1 ml AuNPs-mPEG 離心沉淀用0.75 ml 純水重懸，加入0.25 ml 純水混合，4 ℃孵育8 h，離心取上清液，0.22 μm 微孔濾膜過濾，為空白基質(zhì)溶液；C：供試品溶液。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用純水稀釋HS-DOX 對照品溶液，制得HSDOX 濃度為1.40、2.79、5.59、11.18、22.35 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)進行線性回歸。

2.3.5 精密度考察

分別選取低、中、高三個質(zhì)量濃度（1.40、5.59、22.35 μg/ml）的HS-DOX 標(biāo)準(zhǔn)工作液，1 d 內(nèi)進樣3 次，每次每個濃度連續(xù)進樣5 次，計算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），考察日內(nèi)精密度；連續(xù)進樣3 d，每次每個濃度連續(xù)進樣5 次，考察日間精密度。

2.3.6 穩(wěn)定性考察

取對照品溶液和供試品溶液于室溫下儲存，分別于0、4、8、12、16、24 h 測定HS-DOX 的含量，計算RSD。

2.3.7 加樣回收率考察

取9 份供試品各1 ml，分別加入1 ml 的含8.12、10.15、12.18 μg 的HS-DOX 對照品溶液混合，每組平行制備3 份，得到80%、100%、120%加樣量的加樣供試品溶液。根據(jù)以下公式計算HSDOX 的加樣回收率。

2.3.8 AuNPs-mPEG@DOX 吸附率和載藥量的測定

測定離心后的上清液，根據(jù)以下公式計算吸附率和載藥量。

2.4 細(xì)胞毒性研究

分別取MCF-10A 和MCF-7 細(xì)胞，用DMEM混合培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×104cells/ml，以每孔0.1 ml 的體積鋪板于96 孔板，37 ℃下孵育24 h。分別用相同摩爾濃度的AuNPs-mPEG@-DOX 和游離DOX（0.02、0.06、0.18、0.53、1.58、4.75、14.25 μmol/L）處理24 h 和48 h，每種藥物濃度重復(fù)3 個孔。用10%的CCK8 溶液染色30 min。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 AuNPs-mPEG@DOX 的表征

3.1.1 AuNPs-mPEG@DOX 的粒徑分布和Zeta 電位

AuNPs、AuNPs-mPEG 和AuNPs-mPEG@DOX的粒徑分布和Zeta 電位如表1 所示，三種納米顆粒的粒徑逐漸增大，Zeta 電位由負(fù)電荷轉(zhuǎn)為正電荷，最終得到水動力直徑為（46.12±0.49） nm，電位為（18.60±1.51） mV 的AuNPs-mPEG@DOX。AuNPs與HS-mPEG5K孵育后，部分檸檬酸根被甲氧基聚乙二醇取代，連接了PEG 長鏈的AuNPs-mPEG 更穩(wěn)定不易聚集，粒徑增大，負(fù)電荷減少；連接HSDOX 后，由于阿霉素含有氨基帶正電，因而制備得到帶正電荷的納米顆粒。

表1 AuNPs、AuNPs-mPEG 和AuNPs-mPEG@DOX 的平均粒徑和Zeta 電位(n=3)

3.1.2 AuNPs-mPEG@DOX 的UV-Vis 表征

如圖1 所示，AuNPs、AuNPs-mPEG 和AuNPsmPEG@DOX 的最大吸收波長分別為524、526、530 nm，隨著HS-mPEG5K和HS-DOX 被修飾到AuNPs 上，最大吸收波長依次出現(xiàn)紅移，表明mPEG5K和DOX 通過HS 鍵成功連接在AuNPs 上。

圖1 AuNPs、AuNPs-mPEG 和AuNPs-mPEG@DOX 的UV-Vis 光譜圖

圖2 HS-DOX 的液相色譜圖

圖3 AuNPs-mPEG@DOX 和游離DOX 分別對MCF-10A 和MCF-7 細(xì)胞的24 h 和48 h 細(xì)胞毒性

3.2 HS-DOX 投藥濃度對AuNPs-mPEG@DOX 吸附率和載藥量的影響

為提高納米載體的吸附率和載藥量，考察了HS-DOX 投藥濃度對AuNPs-mPEG@DOX 吸附率和載藥量的影響。如表2 所示，隨著HS-DOX 的投藥濃度增加，載體的吸附率和載藥量都逐漸升高，當(dāng)投藥濃度為11.18 μg/ml 時，納米載體的吸附率和載藥量達到最大值，繼續(xù)提高HS-DOX 的投藥濃度，載藥量不再上升，吸附率降低。表明HSDOX 投藥濃度在11.18 μg/ml 時，AuNPs 表面吸附可能達到飽和，因而選擇11.18 μg/ml 投藥濃度用于制備AuNPs-mPEG@DOX。

表2 HS-DOX 投藥濃度對AuNPs-mPEG@DOX 吸附率和載藥量的影響(n=3)

3.3 HS-DOX 色譜分析方法的建立

首先考察方法專屬性，實驗表明，制備過程未對HS-DOX 的測定產(chǎn)生影響（圖2）。進一步考察HS-DOX 的線性，得線性回歸方程為y=17.884x-5.365 1，r=0.999 9，證明該液相色譜方法在1.40～22.35 μg/ml 濃度范圍內(nèi)線性良好。分別考察了1.40、5.59、22.35 μg/ml 三個低、中、高濃度的精密度，見表3，日內(nèi)精密度和日間精密度均＜2.0%，符合精密度要求。對照品溶液和供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定，其RSD 分別為0.78%和1.01%。HSDOX 平均加樣回收率為99.06%，RSD 為0.83%，回收率符合要求（表4）。結(jié)果表明，該液相方法準(zhǔn)確可靠，可用于HS-DOX 的定量檢測。

表3 HS-DOX 3 種濃度的日內(nèi)和日間精密度(n=5)

表4 HS-DOX 的加樣回收率(n=3)

3.4 細(xì)胞毒性研究

AuNPs-mPEG@DOX 和DOX 對MCF-10A 和MCF-7 細(xì)胞的24 h 和48 h 毒性作用如圖3 所示，隨著DOX 濃度的增加以及藥物作用時間延長，MCF-10A 和MCF-7 細(xì)胞的存活率皆降低。在相同DOX 濃度下，AuNPs-mPEG@DOX 比游離DOX對正常乳腺細(xì)胞MCF-10A 的毒性作用明顯降低，可起到減小DOX 毒副作用的目的。當(dāng)DOX 濃度＜4.75 μmol/L 作用于乳腺癌細(xì)胞MCF-7 時，游離DOX 表現(xiàn)出比AuNPs-mPEG@DOX 明顯的細(xì)胞毒性作用；在DOX 濃度≥4.75 μmol/L 的情況下，AuNPs-mPEG@DOX 與游離DOX 表現(xiàn)出無差異的細(xì)胞毒性作用。結(jié)果表明將DOX 修飾于AuNPs上，由于Au-S 鍵穩(wěn)定存在，以及PEG 的長鏈保護作用，DOX 與細(xì)胞的直接接觸面積減小，可降低對正常細(xì)胞的毒副作用。由于腫瘤細(xì)胞的高間質(zhì)液壓大，尺寸較大的AuNPs-mPEG@DOX 較游離DOX不易被泵回血液和細(xì)胞胞吐，在高濃度時，與DOX腫瘤細(xì)胞殺傷作用相當(dāng)。

4 討論

DOX 在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時也會損害機體的正常細(xì)胞，其隨劑量增加會對心臟、大腦、肝臟和腎臟等器官產(chǎn)生不良反應(yīng)。同時，它還會損害免疫系統(tǒng)，增加病人對病原體的易感性，削弱他們的愈合能力。本文制備了載DOX 的mPEG 修飾金納米粒AuNPs-mPEG@DOX，粒徑為（46.12±0.49） nm，電位為（18.60±1.51） mV，最大吸收波長為530 nm。成功建立了可用于檢測AuNPs-mPEG@DOX 未吸附HS-DOX 含量的HPLC 方法，在HS-DOX 投藥濃度為11.18 μg/ml 時有最大吸附率和載藥量。該納米載體能明顯降低DOX 對正常乳腺細(xì)胞的毒副作用，且當(dāng)濃度達到一定值時，具有與游離DOX 相同的腫瘤細(xì)胞殺傷作用，為后續(xù)開發(fā)AuNPs 連接DOX 的腫瘤治療方案奠定了良好的基礎(chǔ)。

納米顆粒被認(rèn)為是選擇性增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物積累從而減少毒副作用的重要途徑。AuNPs 作為無機納米顆粒的一種，因其獨特性質(zhì)被廣泛應(yīng)用于藥物遞送、腫瘤診斷和治療領(lǐng)域。除AuNPs 本身結(jié)構(gòu)可降低DOX 毒副作用，也可通過在AuNPs表面修飾核酸適配體[11-12]、腫瘤穿透肽[13]等有效靶向和進入腫瘤細(xì)胞，減少DOX 對正常細(xì)胞的損害；或利用腫瘤部位的特殊環(huán)境，通過響應(yīng)型功能鍵將DOX 連接于AuNPs 上，如低pH[14]、過表達酶[15]和高水平的GSH[16]等來調(diào)控載體尺寸大小和DOX 釋放，提高載藥納米顆粒在腫瘤部位蓄積量，繼而提高抗腫瘤作用。此外，也可以通過將DOX和Varlitinib 與PEGAuNPs 結(jié)合[17]，來增強DOX對腫瘤細(xì)胞的抑制作用，降低對正常細(xì)胞的毒性。雖然利用AuNPs 載DOX 同時降低其毒性的策略目前已被廣泛研究，但其粒徑大小、表面電荷和各類形狀等因素對生物分布和細(xì)胞攝取的影響，AuNPs 表面有限吸附能力帶來的載體量過大，以及進入細(xì)胞后的代謝途徑等問題還需要進行更多的探索。