汪遠(yuǎn)遠(yuǎn)， 鄒 艷， 劉朝霞， 陽學(xué)風(fēng)

1 南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院 a. 消化內(nèi)科， b. 手足外科， 湖南 衡陽 421002

2 湖南省代謝相關(guān)脂肪性肝病臨床研究中心， 湖南 衡陽 421002

目前，代謝相關(guān)脂肪性肝?。╩etabolism-associated fatty liver disease，MAFLD）已成為我國慢性肝病的第一大原因，患病率高達(dá)30%，且預(yù)計(jì)仍會(huì)進(jìn)一步升高［1］。MAFLD 與代謝性疾病發(fā)病密切相關(guān)，如肥胖、高血壓、2型糖尿病以及心血管疾病等［2］。

脂質(zhì)代謝異常是MAFLD 的關(guān)鍵問題之一［3］，肝臟的脂肪酸大多來自脂肪中甘油三酯分解，通過血液循環(huán)至肝臟吸收［4］。膽汁酸由膽固醇代謝產(chǎn)生，可以通過激活肝臟內(nèi)的法尼醇X 受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR），調(diào)節(jié)脂肪酸合成、氧化和運(yùn)輸?shù)冗^程，從而影響脂肪代謝［5］。筆者預(yù)實(shí)驗(yàn)通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)豬去氧膽酸（hyodeoxycholic acid，HDCA）在MAFLD 患者的血液和糞便樣本中含量明顯高于健康人，但HDCA 在MAFLD 發(fā)病中的作用及機(jī)制尚不清楚。本課題組采用棕櫚酸（palmitic acid， PA）誘導(dǎo)L02 細(xì)胞構(gòu)建脂肪變性肝細(xì)胞模型，分析HDCA 對(duì)脂肪變性肝細(xì)胞活性的影響；并構(gòu)建FXR 低表達(dá)肝細(xì)胞株，研究HDCA 是否通過FXRPI3K/AKT 途徑對(duì)脂肪變性肝細(xì)胞的活性發(fā)揮作用，從而探討HDCA 在MAFLD 發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制，為MAFLD的預(yù)防和治療提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) L02 細(xì)胞（HL7702）購自上海佰曄生物科技公司。DMEM 高糖完全培養(yǎng)基包含10%胎牛血清（FBS）和1%青鏈霉素混合液（×100），L02 細(xì)胞接種于25 cm2底面積的培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。0.2 mmol/L的PA誘導(dǎo)L02細(xì)胞脂肪變性。

1.2 PA 的配置 取25.642 mg PA 加入至1 mL 無水乙醇中水浴加熱，配得濃度為100 mmol/L 的PA 溶液①。另取50 mg 無脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）加入至10 mL 1640 培養(yǎng)基中并混勻，配得BSA 濃度為0.5%。PA 溶液①取0.2 mL 加入至9.7 mL 的BSA 與1640 培養(yǎng)基的混合液中，配得濃度為2 mmol/L 的PA 溶液②。然后將PA溶液②置于55 ℃水浴鍋中水浴30 min。細(xì)菌濾過器過濾除菌兩次。過濾后的PA 溶液②與完全培養(yǎng)基按照體積比1∶9 混合稀釋10 倍配置成0.2 mmol/L 的PA 混合液。剩余的PA 溶液②按照每次實(shí)驗(yàn)預(yù)估用量分裝，-20 ℃冰箱儲(chǔ)存。

1.3 HDCA 的配置 20 mg 的HDCA 溶于100 μL 的二甲基亞砜（DMSO），震蕩混勻直至完全溶解，配置成濃度5×106μmol/L 的HDCA 溶液①。HDCA 溶液①取8 μL，加入992 μL 含10% FBS 的DMEM 高糖完全培養(yǎng)基，配置成濃度為4 000 μmol/L 的HDCA 溶液②。HDCA 溶液②與完全培養(yǎng)基按照體積比1∶9 稀釋10 倍配置成濃度400 μmol/L 的HDCA 溶液③。100、200、300 μmol/L 的HDCA 溶液從HDCA 溶液③逐步稀釋。400 μmol/L 的HDCA 溶液中DMSO 的含量為0.08%，低于DMSO 對(duì)細(xì)胞安全界限0.1%，故本實(shí)驗(yàn)不設(shè)立DMSO 對(duì)照組。剩余的HDCA 溶液③，標(biāo)記時(shí)間和藥品名稱，密封放入-20 ℃冰箱凍存，避免反復(fù)凍融。

1.4 細(xì)胞活性測(cè)定 用CCK8 試劑測(cè)定細(xì)胞活性，每100 μL DMEM 完全培養(yǎng)基加入10 μL CCK8 試劑混勻。吸棄原液，每孔加入100 μL 的混合液，將96 孔板置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育0.5～2 h，酶標(biāo)儀測(cè)量450/620 nm處的光密度（OD）值。細(xì)胞活性計(jì)算公式如下：細(xì)胞活性（%）=［OD（加藥組）-OD（空白組）］/［OD（正常組）-OD空白組）］×100%。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR （qRT-PCR） 將L02 細(xì)胞接種于6 孔板，PA 誘導(dǎo)24 h 后，HDCA 處理24 h。通過qRTPCR 檢測(cè)L02 細(xì)胞中FXR、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、周期蛋白D1（Cyclin D1）、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）和蛋白激酶B（AKT）的mRNA 表達(dá)。引物（表1）大部分源于Primer Bank［6］，部分引物參考的編碼序列設(shè)計(jì)來源于NCBI 基因（存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄本時(shí)，可對(duì)各轉(zhuǎn)錄本的保守區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)），并以GAPDH 作為內(nèi)參基因。所有引物均在Primer-Blast 中驗(yàn)證了其特異性。合成由長沙鼎國生物科技有限公司完成。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

1.6 Western Blot 處理后的L02脂肪變性肝細(xì)胞用含有蛋白酶抑制劑復(fù)合物的冷RIPA 緩沖液裂解。收集上清液，12 000×g離心15 min，使用BCA 檢測(cè)試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。主要使用的抗體包括FXR（1∶1 500）、PCNA（1∶2 000）、Cyclin D1（1∶2 000）、PI3K（1∶2 000）、p-PI3K（1∶1 500）、AKT（1∶2 000）、p-AKT（1∶1 500）和GAPDH（1∶2 000）。條帶采用Image J軟件進(jìn)行密度分析。

1.7 FXR siRNA FXR siRNA 依據(jù)其基因序列（序列來源參考NCBI GeneBank數(shù)據(jù)庫［7］）在廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成3條特異性干擾鏈。細(xì)胞密度達(dá)到50%，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。配置混合轉(zhuǎn)染試劑：5 μL Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑+5 μL FXR siRNA 混勻，室溫靜置30 min。混合的轉(zhuǎn)染試劑加入L02 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)間24～48 h。棄去原有的培養(yǎng)液，PBS 洗滌并更換新的不含雙抗的培養(yǎng)基。提取6 孔板細(xì)胞的總RNA，qRT-PCR 方法檢測(cè)3 條FXR siRNA 干擾鏈作用下，F(xiàn)XR mRNA 的表達(dá)情況并分析表達(dá)差異。選擇FXR mRNA 降低最明顯的一條作為實(shí)驗(yàn)干擾組。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用仙桃學(xué)術(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，服從正態(tài)分布且方差齊時(shí)多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Tukey HSD 檢驗(yàn)；服從正態(tài)分布但方差不齊時(shí)采用Welch 方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Games-Howell 檢驗(yàn)。兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脂肪變性肝細(xì)胞模型的構(gòu)建及PA 對(duì)肝細(xì)胞活性的影響 采用甘油三酯含量測(cè)定和油紅O 染色方法觀察肝細(xì)胞脂肪變性模型是否構(gòu)建成功。結(jié)果顯示油紅O染色后，顯微鏡下觀察到L02 細(xì)胞組細(xì)胞質(zhì)中沒有大的紅色脂滴，在細(xì)胞膜上存在小而均勻的紅色脂滴；PA 誘導(dǎo)的L02 細(xì)胞組中細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在明顯的大而深紅色的脂滴（圖1）；與0 h 比較，L02 細(xì)胞在PA 誘導(dǎo)后不同時(shí)間段甘油三酯水平有不同程度的升高（圖2），表明模型構(gòu)建穩(wěn)定，將構(gòu)建成功的脂肪變性肝細(xì)胞定義為M 組進(jìn)行后續(xù)研究。CCK8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示，PA 誘導(dǎo)L02 細(xì)胞24 h后細(xì)胞活性明顯下降（1.000±0.084 vs 0.668±0.022，t=-18.663，P＜0.001）。

圖1 油紅O染色結(jié)果（×20）Figure 1 Results of the oil red O staining

圖2 PA誘導(dǎo)L02細(xì)胞后甘油三酯水平隨時(shí)間的變化Figure 2 Changes in triglyceride levels over time after PA induction in L02 cells

2.2 HDCA 對(duì)正常肝細(xì)胞及脂肪變性肝細(xì)胞活性的影響 為了研究HDCA 對(duì)脂肪變性肝細(xì)胞的影響，將不同濃度的HDCA 加入L02 細(xì)胞和脂肪變性肝細(xì)胞。CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與L02細(xì)胞組相比，L02+100 μmol/L HDCA 組和L02+200 μmol/L HDCA 組中L02 細(xì)胞活性沒有改變，L02+300 μmol/L HDCA 組和L02+400 μmol/L HDCA 組中L02 細(xì)胞活性明顯下降（P值均＜0.001）（圖3a）。與M 組相比，M+100 μmol/L HDCA 組和M+200 μmol/L HDCA 組細(xì)胞活性無明顯改變，M+300 μmol/L HDCA 組和M+400 μmol/L HDCA 組細(xì)胞活性均顯著降低（P值均＜0.001）（圖3b）。以上實(shí)驗(yàn)證明300 μmol/L的HDCA抑制了L02細(xì)胞和脂肪變性肝細(xì)胞活性。為了觀察隨著300 μmol/L HDCA 處理時(shí)間的延長，脂肪變性肝細(xì)胞的活性是否發(fā)生改變，通過CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示，M+300 μmol/L HDCA 組細(xì)胞活性隨時(shí)間的變化而發(fā)生改變（P值均＜0.001）（圖3c）。后續(xù)實(shí)驗(yàn)HDCA濃度均采用300 μmol/L。

注：a，不同濃度HDCA對(duì)L02細(xì)胞活性的影響；b，不同濃度HDCA對(duì)PA誘導(dǎo)的脂肪變性肝細(xì)胞活性的影響；c，HDCA（300 μmol/L）不同時(shí)間對(duì)PA誘導(dǎo)的脂肪變性肝細(xì)胞活性的影響。

2.3 HDCA 對(duì)脂肪變性肝細(xì)胞FXR-PI3K/AKT 通路關(guān)鍵分子及PCNA 和Cyclin D1 表達(dá)的影響 為了進(jìn)一步研究HDCA（300 μmol/L）抑制脂肪變性肝細(xì)胞活性的機(jī)制，通過Western Blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，M+HDCA 組中FXR 蛋白的表達(dá)高于M 組（t=4.492，P＜0.05）（圖4）。qRT-PCR 檢測(cè)M 組和M+HDCA 組的FXR、PCNA、Cyclin D1 以及PI3K/AKT 通路關(guān)鍵分子mRNA 的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，相比于M 組，M+HDCA 組中FXR mRNA 表達(dá)升高，PCNA、Cyclin D1、PI3K 和AKT mRNA 表達(dá)均明顯下降（P值均＜0.05）（表2）。

圖4 HDCA對(duì)脂肪變性肝細(xì)胞FXR表達(dá)的影響Figure 4 Effect of HDCA on the expression of FXR in steatotic hepatocytes

表2 HDCA對(duì)脂肪變性肝細(xì)胞FXR、PI3K、AKT、PCNA和Cyclin D1 mRNA表達(dá)的影響Table 2 Effect of HDCA on the mRNA expression of FXR，PI3K， AKT， PCNA， and Cyclin D1 in steatotic hepatocytes

2.4 FXR低表達(dá)肝細(xì)胞株的構(gòu)建及HDCA對(duì)脂肪變性肝細(xì)胞FXR mRNA表達(dá)的影響 為了驗(yàn)證HDCA（300 μmol/L）是否通過FXR 抑制脂肪變性肝細(xì)胞活性，選擇干擾FXR受體，在3 條FXR siRNA（FXR siRNA 1、2、3）中篩選出干擾效果最強(qiáng)的干擾鏈。結(jié)果如圖5a 所示，相比于M 組，M+FXR siRNA 3的干擾效果最好（P＜0.01）。qRT-PCR檢測(cè)FXR siRNA 3 干擾鏈對(duì)HDCA 刺激脂肪變性肝細(xì)胞FXR mRNA表達(dá)的干擾效果，結(jié)果顯示，相比于M+HDCA組，M+FXR siRNA 3+HDCA 組的FXR mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）（圖5b）。

圖5 FXR siRNA干擾效果及HDCA對(duì)脂肪變性肝細(xì)胞FXR表達(dá)的影響Figure 5 Effect of FXR siRNA interference and the effect of HDCA on FXR expression in lipid-denatured hepatocytes

2.5 低表達(dá)FXR 脂肪變性肝細(xì)胞中FXR-PI3K/AKT 通路關(guān)鍵分子及PCNA 和Cyclin D1 蛋白表達(dá)的變化 應(yīng)用Western Blot 檢測(cè)FXR、PCNA、Cyclin D1、PI3K、p-PI3K、AKT 和p-AKT 的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，相比于M+HDCA 組，M+FXR siRNA 3+HDCA 組中FXR 蛋白表達(dá)下降，PCNA、PI3K、p-PI3K、AKT 和p-AKT 蛋白表達(dá)增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）（圖6）。

圖6 抑制FXR表達(dá)后脂肪變性肝細(xì)胞FXR-PI3K/AKT通路關(guān)鍵分子及PCNA和Cyclin D1蛋白表達(dá)的變化Figure 6 Changes in the expression of key molecules of FXRPI3K/AKT pathway and PCNA and Cyclin D1 proteins in steatosis hepatocytes after inhibition of FXR expression

3 討論

MAFLD 發(fā)展包括單純脂肪肝（以往稱非酒精性脂肪肝）、脂肪性肝炎（以往稱非酒精性脂肪性肝炎）、脂肪性肝纖維化、肝硬化及肝癌等階段［8］。MAFLD 一旦進(jìn)入脂肪性肝炎階段，肝細(xì)胞脂毒性損傷以及炎癥因子的大量浸潤，會(huì)加快肝纖維化、肝硬化和肝癌的進(jìn)展速度［9-10］，因此脂肪性肝炎階段早期防治尤為重要。

膽汁酸是由肝臟合成的雙性分子。在肝細(xì)胞胞質(zhì)和微粒體中，膽固醇通過經(jīng)典和替代兩種途徑生成初級(jí)膽汁酸［11］。初級(jí)膽汁酸分泌進(jìn)入腸道后，在腸內(nèi)細(xì)菌的作用下，轉(zhuǎn)化為次級(jí)膽汁酸。HDCA是一種次級(jí)膽汁酸，存在于豬、鼠和人的膽汁中，在豬和鼠的膽汁中含量較高［12］，其對(duì)動(dòng)物機(jī)體的脂質(zhì)代謝有著重要的調(diào)控作用［13］。Sehayek 等［14］發(fā)現(xiàn)在野生型C57BL/6 小鼠中，飼喂HDCA可以減少飲食中膽固醇從腸道吸收，對(duì)治療小鼠血漿膽固醇升高和動(dòng)脈粥樣硬化有較好的效果。Shih等［15］研究顯示，飼糧中添加1.25%的HDCA 可通過改善高密度脂蛋白功能來抑制低密度脂蛋白受體基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的形成。目前，HDCA 對(duì)MAFLD 發(fā)生發(fā)展的影響未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)濃度低于200 μmol/L 的HDCA 對(duì)正常肝細(xì)胞及脂肪變性肝細(xì)胞活性無明顯影響，300 μmol/L 及以上濃度的HDCA 處理的L02 肝細(xì)胞和L02 脂肪變性肝細(xì)胞活性明顯下降，同時(shí)PCNA、Cyclin D1 的mRNA 表達(dá)降低，表明較高濃度的HDCA 對(duì)脂肪變性肝細(xì)胞增殖活性具有抑制作用。

FXR 由Forman 等［16］于1995 年在大鼠中發(fā)現(xiàn)。FXR是膽汁酸代謝的重要受體，通過調(diào)節(jié)膽汁酸在肝臟和腸道的合成、結(jié)合、攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)以維持膽汁酸的動(dòng)態(tài)平衡。疏水性膽汁酸鵝去氧膽酸對(duì)FXR的激活作用最強(qiáng)［17］，其次是脫氧膽酸和石膽酸，而親水性膽汁酸熊去氧膽酸是最弱的FXR激動(dòng)劑［18］。GW4064、奧貝膽酸和Fexaramine等人工合成的FXR激動(dòng)劑對(duì)FXR的激活作用更強(qiáng)［19-20］。?；?β-鼠膽酸和甘氨熊脫氧膽酸是FXR的拮抗劑［21-22］。本研究發(fā)現(xiàn)300 μmol/L 的HDCA 處理24 h 后，脂肪變性肝細(xì)胞FXR 蛋白表達(dá)明顯增加，提示HDCA 對(duì)FXR 具有激活作用，能夠上調(diào)肝細(xì)胞FXR的表達(dá)。

FXR 在各種代謝過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，包括脂肪代謝、膽汁酸平衡、葡萄糖平衡和細(xì)胞活性［23］。在肝臟中，F(xiàn)XR 通過激活FXR 信號(hào)通路，促進(jìn)脂肪酸的β 氧化和膽汁酸的合成，減少脂肪酸的合成和蓄積，改善肝脂肪代謝異常［24-25］。FXR 還與肝細(xì)胞的生長、凋亡以及炎癥等生物學(xué)過程密切相關(guān)［26-27］。此外，F(xiàn)XR 通過調(diào)節(jié)腸道菌群的組成和代謝產(chǎn)物的生成，參與肥胖、糖尿病等代謝性疾病的發(fā)生和發(fā)展［28-29］。FXR 發(fā)揮各種代謝調(diào)節(jié)作用與PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。Xu等［30］研究發(fā)現(xiàn)激活FXR活性，能夠抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的活化，降低脂肪分解，增加脂肪生成，進(jìn)而增加魚體內(nèi)的脂質(zhì)積累。本研究結(jié)果顯示，干擾FXR 表達(dá)后，脂肪變性肝細(xì)胞PI3K/AKT 信號(hào)通路關(guān)鍵分子，如PI3K、p-PI3K、AKT 和p-AKT 的蛋白表達(dá)明顯增加，提示FXR對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路關(guān)鍵分子表達(dá)具有抑制作用；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，干擾脂肪變性肝細(xì)胞FXR表達(dá)后，反映細(xì)胞增殖活性的PCNA蛋白表達(dá)增加，提示FXR對(duì)脂肪變性肝細(xì)胞增殖具有抑制作用。以上結(jié)果表明HDCA通過上調(diào)FXR表達(dá)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，從而造成脂肪變性肝細(xì)胞活性下降。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：汪遠(yuǎn)遠(yuǎn)負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)施，撰寫論文；鄒艷負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集與分析；劉朝霞負(fù)責(zé)圖表制作；陽學(xué)風(fēng)指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。