林建紅 陳海軍 朱思頤

(邵陽(yáng)學(xué)院附屬第一醫(yī)院1.皮膚科;2.兒科;3.檢驗(yàn)科,湖南 邵陽(yáng) 422001)

特應(yīng)性皮炎(Atopic dermatitis,AD)是一種慢性復(fù)發(fā)性皮膚病,伴有過(guò)敏性炎癥[1]。據(jù)報(bào)道[2],AD中存在以Th2為主的急性期和以Th1為主的慢性期的雙相T細(xì)胞應(yīng)答。Th1和Th2細(xì)胞是兩個(gè)功能不同的細(xì)胞亞群,它們分泌不同的效應(yīng)細(xì)胞因子。然而,這些因素在AD發(fā)病機(jī)制中的相對(duì)作用仍有待闡明。

雖然類(lèi)固醇是常用的治療AD的主要藥物,但由于潛在的副作用,如皮膚萎縮、快速反應(yīng)和停止治療后的癥狀性反彈,不鼓勵(lì)長(zhǎng)期使用[3-4]。在臨床研究[5]中,中醫(yī)藥已被證明是預(yù)防和治療炎癥性皮膚病的潛在治療劑來(lái)源。一項(xiàng)針對(duì)皮膚病的系統(tǒng)研究[6]結(jié)果表明,中草藥可以緩解AD,并且不會(huì)引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)是茶葉中含量最多的兒茶素。EGCG具有抗炎、抗氧化等諸多活性,并已被應(yīng)用于治療炎癥性疾病、皮膚病和感染性疾病[7-8]。Chiu等[9]已證實(shí)EGCG是治療AD的潛在治療劑。然而關(guān)于EGCG對(duì)AD的作用機(jī)制的報(bào)道相對(duì)較少。本研究評(píng)估了EGCG對(duì)2,4二硝基氯苯(Dinitrochlorobenzene,DNCB)誘導(dǎo)的AD動(dòng)物模型的影響,EGCG的抗炎和抗過(guò)敏特性是在DNCB誘導(dǎo)的AD模型中確定的,該模型旨在彌補(bǔ)AD治療中使用類(lèi)固醇的缺點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 90只6～7周齡的SPF級(jí)SD大鼠(體重160～200 g)獲自北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)證書(shū)編號(hào)SCXK(京)2020-0007。將動(dòng)物養(yǎng)在本研究動(dòng)物房[溫度為(23±2) ℃,濕度為50%±10%,12 h明暗循環(huán)],提供標(biāo)準(zhǔn)食物和水。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器 EGCG(E4143,純度≥95%)、DNCB(237329,純度≥99%)、地塞米松(Dexamethasone,DXM)(D1756,HPLC≥98%)、Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)激動(dòng)劑LPS(來(lái)自大腸桿菌O55:B5,L2880)、PMA(P1585,HPLC≥99%)、ionomycin (I0634,HPLC≥98%)、Brefeldin A(來(lái)自布雷正青霉菌,B5936)均獲自美國(guó)Sigma;HE染色試劑盒(G1120)、大鼠白介素-2(IL-2)ELISA KIT(SEKR-0003)、白介素-4(IL-4)ELISA KIT(SEKR-0004)、白介素-13(IL-13)ELISA KIT(SEKR-0046)和干擾素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)ELISA KIT(SEKR-0008)、ECL發(fā)光液(PE0020)獲自北京Solarbio;Fixation/permeabilization(555028)獲自美國(guó)Biosciences;鼠單克隆FITC-anti-CD4(ab59474)、兔單克隆APC-anti-IFN-γ(ab275700)和鼠單克隆PE-Anti-IL-4(ab95717)、兔多克隆TLR4(ab13556)、兔多克隆髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88,ab2064)、兔多克隆核因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB,ab16502)、兔多克隆GAPDH(ab9485)均獲自英國(guó)Abcam。DMi8-熒光顯微鏡(德國(guó)徠卡)、SpectraMax Mini酶標(biāo)儀(上海美谷分子)、ImagerQuant 300凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)GE)。

1.3 方法

1.3.1 AD模型構(gòu)建及分組處理 將DNCB溶解在丙酮/橄欖油(3∶1)中,以應(yīng)用于大鼠。按照研究進(jìn)行AD大鼠模型構(gòu)建[10]。造模前先去除部分(約8 cm2)大鼠背部毛發(fā)。使用100 μL的7% DNCB涂抹大鼠背側(cè)剃毛的皮膚上使動(dòng)物致敏3 d。一周后將200 μL的0.7% DNCB涂在同一位置進(jìn)行攻擊,每周一次,持續(xù)6周。大鼠背部出現(xiàn)糜爛、紅斑和水腫等現(xiàn)象即為造模成功。同時(shí)選擇18只作為對(duì)照(Control)組,按照AD模型方法涂抹等量的橄欖油/丙酮溶劑。將AD造模成功的大鼠分為AD模型(AD)組(給予等量的生理鹽水)、AD+EGCG治療(EGCG)組(50 mg/kg)[11]、AD+DXM陽(yáng)性對(duì)照(DXM)組(2.5 mg/kg)[12]、AD+EGCG+TLR4激動(dòng)劑(TLR4)組(0.5 mg/kg)[13],每組18只,而Control組以相同的方式給予等量的生理鹽水。各組大鼠通過(guò)灌胃給予處理,每天一次,連續(xù)2周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),根據(jù)大鼠背部皮膚的損傷嚴(yán)重程度計(jì)算臨床評(píng)分,評(píng)分后進(jìn)行取血,最后處死大鼠并將18只分別進(jìn)行組織學(xué)分析、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)、Western blot檢測(cè)(各6只)。

1.3.2 大鼠背部皮膚損傷的嚴(yán)重程度評(píng)分[12]處死前給大鼠拍照,根據(jù)大鼠背部皮膚的損傷嚴(yán)重程度計(jì)算臨床評(píng)分。臨床評(píng)分基于紅斑、水腫、結(jié)痂、脫屑和苔蘚化癥狀的嚴(yán)重程度(0,無(wú)癥狀;1,輕度;2,中度;3,重度)。根據(jù)照片評(píng)估每個(gè)大鼠的皮膚損傷嚴(yán)重程度。

1.3.3 ELISA檢測(cè)各組大鼠血清中炎癥因子表達(dá)情況 在對(duì)每只大鼠損傷評(píng)分后將大鼠麻醉,從眼靜脈叢中抽取血液,并以2000 rpm的速度離心血液10 min,以收集用于ELISA測(cè)定的血清。分別通過(guò)對(duì)應(yīng)的試劑盒檢測(cè)血清中IL-2、IL-4、IL-13和IFN-水平。

1.3.4 組織學(xué)分析 采血后處死大鼠,然后收集大鼠皮膚(n=6),并將其儲(chǔ)存在-80 ℃用于進(jìn)一步分析。將收集的大鼠背部組織(n=6)固定在福爾馬林中,通過(guò)梯度乙醇脫水后制備成6 μm的切片。干燥后將切片脫蠟、復(fù)水后分別經(jīng)蘇木精和伊紅染色10 min,封片后通過(guò)光學(xué)顯微鏡(日本尼康)在200倍的放大率來(lái)觀察病理學(xué)特征。并對(duì)病理學(xué)的損傷程度進(jìn)行評(píng)分。通過(guò)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度進(jìn)行評(píng)分[12]:無(wú)浸潤(rùn)(0分);0%～25%浸潤(rùn)(1分);25%～50%浸潤(rùn)(2分);50%～75%浸潤(rùn)(3分);75%～100%浸潤(rùn)(4分)。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)[2]從大鼠背部組織(n=6)分離單個(gè)核細(xì)胞,計(jì)數(shù)后將細(xì)胞在5% CO2培養(yǎng)箱中于37 ℃中培養(yǎng)24 h。使用PMA(100 mg/L)、ionomycin(1 mg/L)和Brefeldin A(10 mg/L)處理細(xì)胞4 h,隨后將細(xì)胞置于EP管中,與FITC-anti-CD4室溫避光30 min,用細(xì)胞染色緩沖液洗滌后與500 μL fixation/permeabilization溶液混合,避光45 min。用1× BD perm/wash buffer洗滌后,將細(xì)胞與PE-anti-IL-4和APC-anti-IFN-γ在室溫中避光45 min,再次使用1× BD perm/wash buffer洗滌,通過(guò)300 μL flow buffer重懸。最后使用流式細(xì)胞儀和FlowJo軟件進(jìn)行分析。根據(jù)FITC-CD4熒光測(cè)定Th1(IFN-γ+CD4+)和Th2(IL-4+CD4+)細(xì)胞百分比。

1.3.6 Western blot檢測(cè) 從大鼠背部組織中提取總蛋白。經(jīng)電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,封閉液將膜封閉2 h后與一抗TLR4、MyD88、NF-κB、GAPDH在4℃下孵育過(guò)夜。然而與二抗孵育2 h。將膜洗滌后,通過(guò)ECL對(duì)膜進(jìn)行可視化。使用凝膠成像系統(tǒng)和Quantity One軟件獲得蛋白相對(duì)表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 EGCG減輕AD大鼠的特應(yīng)性病變的嚴(yán)重程度 為了在動(dòng)物模型中研究EGCG對(duì)AD的影響,用DNCB過(guò)敏源使SD大鼠的背部皮膚敏感,成功誘導(dǎo)AD的臨床特征,如干燥、糜爛、紅斑和水腫等。EGCG和DXM治療明顯改善了AD大鼠皮膚損傷中的這些表型。通過(guò)對(duì)各組皮膚損傷程度進(jìn)行評(píng)分顯示,與Control組(0分)比較,AD組(5.67±0.54)大鼠皮膚損傷評(píng)分明顯升高(P<0.05);與AD組比較,DXM組(2.64±0.20)和EGCG組(2.80±0.18)大鼠皮膚損傷評(píng)分明顯降低(P<0.05);與EGCG組比較,DXM組大鼠皮膚損傷評(píng)分變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),TLR4組(4.02±0.45)大鼠皮膚損傷評(píng)分升高(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠背部皮膚損傷代表性圖片F(xiàn)igure 1 Representative images of back skin damage in each group of rats注:A.Control組; B.AD組; C.EGCG組; D.DXM組; E.TLR4組。

2.2 EGCG抑制AD大鼠的炎癥反應(yīng) 與Control組比較,AD組大鼠血清中IL-2和IFN-γ水平下調(diào),IL-4和IL-13水平上調(diào)(均P<0.05);與AD組比較,EGCG組和DXM組大鼠血清中IL-2和IFN-γ水平上調(diào),IL-4和IL-13水平下調(diào)(均P<0.05);與EGCG組比較,DXM組大鼠血清中IL-2、IL-4和IL-13、IFN-γ水平變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),TLR4組大鼠血清中IL-2和IFN-γ水平下調(diào),IL-4和IL-13水平上調(diào)(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清中IL-2、IL-4、IL-13和IFN-γ水平檢測(cè)Table 1 Detection of serum levels of IL-2, IL-4, IL-13 and IFN-γ in each group of rats

2.3 EGCG減少AD大鼠皮損組織病理學(xué)特征 HE染色結(jié)果顯示,AD組大鼠較Control組大鼠表皮、真皮明顯增厚,同時(shí)炎癥細(xì)胞向皮膚組織的浸潤(rùn)增多,EGCG和DXM治療顯著較少了AD大鼠的這些病理學(xué)特征(見(jiàn)圖2)。與Control組(0分)比較,AD組(2.65±0.19)大鼠皮膚損傷的病理學(xué)評(píng)分明顯升高(P<0.05);與AD組比較,DXM組(1.18±0.13)和EGCG組(1.27±0.12)大鼠皮膚損傷的病理學(xué)評(píng)分明顯降低(P<0.05);與EGCG組比較,DXM組大鼠皮膚損傷的病理學(xué)評(píng)分變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),TLR4組(1.98±0.14)大鼠皮膚損傷的病理學(xué)評(píng)分升高(P<0.05)。

圖2 HE染色評(píng)估各組大鼠背部皮膚的病理學(xué)變化(200×)Figure 2 HE staining evaluation of pathological changes in the back skin of rats in each group 注:箭頭所示為炎性浸潤(rùn)部分。A. Control組; B. AD組; C. EGCG組; D. DXM組; E. TLR4組。

2.4 EGCG改善AD大鼠的Th1/Th2平衡 為了確定EGCG可以改善Th1/Th2平衡,流式細(xì)胞術(shù)用于分析大鼠皮損組織中的Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞(見(jiàn)圖3)。與Control組比較,AD組大鼠皮損組織中Th1細(xì)胞百分比降低,Th2陽(yáng)性細(xì)胞百分比升高(均P<0.05)。與AD組比較,EGCG組和DXM組大鼠皮損組織中Th1細(xì)胞百分比升高,Th2陽(yáng)性細(xì)胞百分比降低(均P<0.05)。與EGCG組比較,DXM組大鼠皮損組織中Th1、Th2細(xì)胞百分比變化差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),TLR4組大鼠皮損組織中Th1細(xì)胞百分比降低,Th2陽(yáng)性細(xì)胞百分比升高(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠皮損組織中Th1和Th2陽(yáng)性細(xì)胞百分比Table 2 Percentage of Th1 and Th2 positive cells in skin lesions of rats in each group

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組大鼠皮損組織中Th1和Th2細(xì)胞表達(dá)Figure 3 Flow cytometry detection of Th1 and Th2 cell expression in skin lesions of rats in each group

2.5 EGCG降低AD大鼠皮損組織中的TLR4/MyD88/NF-κB通路相關(guān)蛋白 與Control組比較,AD組大鼠皮損組織中TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白水平上調(diào)(P<0.05)。與AD組比較,EGCG組和DXM組大鼠皮損組織中TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白水平下調(diào)(P<0.05)。與EGCG組比較,DXM組大鼠皮損組織中TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白水平變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);TLR4組大鼠皮損組織中TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白水平上調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖4、表3。

表3 各組大鼠皮損組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)Table 3 Expression of TLR4, MyD88 and NF-κB protein in skin lesions of rats in each group

圖4 Western blot檢測(cè)各組大鼠皮損組織中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)Figure 4 Western blot analysis of TLR4, MyD88, NF-κB protein expression in rat skin lesions

3 討論

AD是最常見(jiàn)的復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病之一,其特點(diǎn)是Th1/Th2失衡[2]。隨著社會(huì)工業(yè)化進(jìn)展,AD的發(fā)病率在不斷上升,但其發(fā)病機(jī)制仍不清楚[14]。其中,皮膚屏障的缺陷和免疫功能的障礙可能是AD發(fā)生的兩個(gè)主要因素[15]。本研究通過(guò)在大鼠背部使用DNCB,在一個(gè)半月內(nèi)誘發(fā)了AD樣皮膚損傷,結(jié)果顯示,AD模型大鼠皮損組織中表皮、真皮明顯增厚,炎癥細(xì)胞向皮膚組織的浸潤(rùn)增多,表明皮膚損傷增加。此外,Th1/Th2失衡與腫瘤免疫逃逸、微生物感染(細(xì)菌和病毒等)有關(guān),也與過(guò)敏性疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反應(yīng)有關(guān),并在介導(dǎo)AD發(fā)展中發(fā)揮重要作用[16]。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)皮損組織中Th1細(xì)胞百分比降低,Th2陽(yáng)性細(xì)胞百分比升高。以上數(shù)據(jù)提示AD模型構(gòu)建成功且Th1/Th2平衡被破壞,表現(xiàn)為T(mén)h2細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)。

EGCG是綠茶中的一種活性兒茶素,具有抗炎、抗癌、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能,能夠?qū)Πl(fā)炎的皮膚提供抗氧化、抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用,以改善AD癥狀[9]。Yang等[17]研究發(fā)現(xiàn),EGCG治療通過(guò)減輕組織損傷、炎癥、粘液產(chǎn)生、膠原沉積以及M2巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn),從而對(duì)室內(nèi)塵螨誘導(dǎo)的過(guò)敏性哮喘具有保護(hù)作用。Bing等[18]研究表明,EGCG在葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎中通過(guò)抑制Th1細(xì)胞因子表達(dá)和誘導(dǎo)Th2細(xì)胞因子表達(dá),從而具有抗炎和調(diào)節(jié)免疫功能的作用。與本研究結(jié)果不一致,推測(cè)其可能的原因是葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎和DNCB誘導(dǎo)的AD的發(fā)展過(guò)程并非由相同的細(xì)胞因子發(fā)揮功能所致。因此,EGCG對(duì)Th1和Th2細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用在不同疾病中并不相同。據(jù)報(bào)道,AD是急性特應(yīng)性濕疹中以Th2為主的炎癥性疾病,隨后在慢性階段表現(xiàn)為T(mén)h1積累[2]。其中,在IFN-γ和IL-2誘導(dǎo)下,CD4+T細(xì)胞分化為T(mén)h1細(xì)胞并介導(dǎo)細(xì)胞免疫;在IL-4誘導(dǎo)下,CD4+T細(xì)胞分化為T(mén)h2細(xì)胞,分泌IL-4等細(xì)胞因子以激活B細(xì)胞,并介導(dǎo)體液免疫和超敏反應(yīng)[19]。Aierken等[10]證明,背側(cè)AD樣皮損急性期Th2細(xì)胞因子IL-4和IL-13水平顯著高于正常皮膚組織。本研究也觀察到同樣趨勢(shì),且EGCG可以明顯抑制AD大鼠的臨床表現(xiàn)和病理學(xué)特征;增加Th1細(xì)胞百分比和IL-2、IFN-(水平,降低Th2細(xì)胞百分比和IL-4、IL-13水平。以上數(shù)據(jù)證實(shí),EGCG可通過(guò)維持Th1/Th2平衡減緩AD大鼠皮膚炎癥性損傷,但其具體機(jī)制還需探討。

TLR是先天免疫識(shí)別受體的重要組成部分,在微生物鑒定中發(fā)揮著重要作用。TLR通過(guò)識(shí)別微生物(脂多糖、脂蛋白和遺傳物質(zhì)核酸等)激活先天免疫反應(yīng)進(jìn)而釋放細(xì)胞因子、上調(diào)共刺激分子的表達(dá),最終為獲得性免疫反應(yīng)提供激活信號(hào)[20]。TLR4是TLR的重要成分,可通過(guò)靶向MyD88激活NF-κB促炎信號(hào)通路,促使效應(yīng)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子,在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[21]。據(jù)報(bào)道[22],川芎嗪納米粒可通過(guò)抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路,調(diào)節(jié)下游細(xì)胞因子的表達(dá),維持Th1/Th2平衡有效防止術(shù)后炎癥反應(yīng)觸發(fā)的宮腔粘連形成。此外,EGCG通過(guò)抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路維持Th1/Th2平衡并抑制結(jié)腸組織中的免疫炎癥反應(yīng)[17]。本研究結(jié)果表明,EGCG能顯著下調(diào)TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白水平,提示EGCG可能通過(guò)抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路減輕AD大鼠的炎癥反應(yīng),進(jìn)而維持Th1/Th2平衡減輕皮膚損傷。此外,Aierken等[10]通過(guò)抑制NF-κB/TLR4信號(hào)通路,部分改善Th1/Th2免疫反應(yīng),進(jìn)而對(duì)AD具有抑制作用,與本研究結(jié)果一致。為了進(jìn)一步驗(yàn)證EGCG與TLR4/MyD88/NF-κB通路之間的關(guān)系,引入了TLR4激動(dòng)劑進(jìn)行處理,結(jié)果表明TLR4激動(dòng)劑處理后可部分逆轉(zhuǎn)EGCG對(duì)AD大鼠的影響,表明EGCG通過(guò)維持Th1/Th2平衡對(duì)AD大鼠的保護(hù)作用,與抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路激活有關(guān)。

4 結(jié)論與展望

EGCG可通過(guò)抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路維持Th1/Th2平衡,進(jìn)而抑制AD大鼠皮損組織的免疫反應(yīng),減輕皮損的嚴(yán)重程度。這為臨床開(kāi)發(fā)AD的靶向治療提供了理論基礎(chǔ)。然而,EGCG雖然有很多好處,但由于生物利用度低、不穩(wěn)定,目前主要用于細(xì)胞和動(dòng)物研究,臨床研究較少。因此,提高EGCG的生物利用度,轉(zhuǎn)向臨床研究也將是未來(lái)研究的重點(diǎn)。