丁雯鈺 高楊麗 楊一飛

(河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院,河北 邯鄲 056000)

甲狀腺癌是世界上最常見的內(nèi)分泌腫瘤,其發(fā)病率逐年上升[1]。其中80%～85%的甲狀腺癌為甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid cancer,PTC),其5年生存率達(dá)94%,而間變性甲狀腺癌(Anaplastic thyroid cancer,ATC)占2%左右,其侵襲性較強(qiáng),1年生存率約為20%[2-3]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步,甲狀腺癌發(fā)病機(jī)制的研究也取得較大發(fā)展,但其發(fā)病率仍在增長(zhǎng)。因此,探索ATC的發(fā)病機(jī)制,提高ATC的存活率具有重要意義。微小核糖核苷酸(MicroRNAs,miRNAs)是一類長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的非編碼RNA片段,在PTC的預(yù)后和治療中起著至關(guān)重要的作用[4-5]。miR-126在很多癌癥中扮演抑癌基因的角色,抵抗癌癥的惡化[6]。近兩年,有研究[7]報(bào)道,miR-126在甲狀腺癌中表達(dá)失調(diào),與癌癥的進(jìn)展存在聯(lián)系,但是其在ATC糖酵解中的作用及機(jī)制尚少有人研究。溶質(zhì)運(yùn)載家族7成員5(Solute carrier family 7 member 5,SLC7A5)是必需氨基酸(如亮氨酸和苯丙氨酸)的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,其在細(xì)胞增殖所需蛋白的合成中起關(guān)鍵作用[8]。SLC7A5在人類的多種實(shí)體腫瘤中過度表達(dá),其中包括甲狀腺癌[9]。但是,SLC7A5是否參與miR-126-3p.1在甲狀腺癌進(jìn)展中的作用尚未可知。本研究旨在探討miR-126-3p.1調(diào)控甲狀腺癌細(xì)胞糖酵解的作用機(jī)制及其與SLC7A5之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人正常甲狀腺細(xì)胞Htori-3、人間變性甲狀腺癌細(xì)胞SW1736、人乳頭瘤狀甲狀腺癌細(xì)胞TPC-1(中國(guó)科學(xué)研究院上海細(xì)胞庫(kù));TRIzol液、逆轉(zhuǎn)錄酶、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Invitrogen);ReadyPrep 蛋白質(zhì)萃取試劑盒(總蛋白)(美國(guó)Bio-Rad);SLC7A5一抗、GAPDH一抗、HRP標(biāo)記的IgG二抗體(Abcam);BeyoECL Plus試劑盒、增強(qiáng)型CCK-8試劑盒、EdU試劑盒(中國(guó)上海碧云天生物科技公司);葡萄糖含量檢測(cè)試劑盒(微量法)、乳酸含量(LA)檢測(cè)試劑盒(可見分光光度法)(北京索萊寶生物科技有限公司);CKX31型奧林巴斯倒置顯微鏡(上海普赫光電科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 Htori-3、SW1736、TPC-1均使用DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清+100 μg/mL青霉素+0.1 mg/mL鏈霉素)培養(yǎng)。在37 ℃、5%CO2飽和濕度空氣的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。TPC-1細(xì)胞分為agomiRNA(轉(zhuǎn)染agomiRNA)組、agomiR-126-3p.1(轉(zhuǎn)染agomiR-126-3p.1)組、si-NC(轉(zhuǎn)染si-NC)組、si-SLC7A5(轉(zhuǎn)染si-SLC7A5)組、agomiR-126-3p.1+pcDNA(共轉(zhuǎn)染agomiR-126-3p.1和pcDNA)組、agomiR-126-3p.1+ pcDNA-SLC7A5(共轉(zhuǎn)染agomiR-126-3p.1和pcDNA-SLC7A5)組,各組細(xì)胞用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至SW1736。RT-qPCR確定轉(zhuǎn)染是否成功。

1.2.2 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-126-3p.1、SLC7A5的表達(dá) TRIzol液提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。分別使用TaqMan miRNA檢測(cè)試劑盒、SYBR?預(yù)混料Ex TaqTMII進(jìn)行miR-126-3p.1、SLC7A5的qPCR分析。條件為(95 ℃,10 min與95 ℃,15 s和60 ℃,1 min,40循環(huán))。U6、GAPDH分別用作miR-126-3p.1、SLC7A5的內(nèi)部參照,2-△△Ct法計(jì)算結(jié)果。

1.2.3 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 使用增強(qiáng)型CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖。將細(xì)胞以每孔100 μL(1×104個(gè)細(xì)胞)接種96孔板,每孔加入10 μLCCK-8溶液,孵育30 min。450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)細(xì)胞的吸光度(OD450)。增殖率(%)=OD450實(shí)驗(yàn)/OD450對(duì)照×100%。

1.2.4 EdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將待測(cè)細(xì)胞以每孔500 μL(5×104個(gè)細(xì)胞)接種24孔板,培養(yǎng)過夜。再用250 μL含有20 μM EdU的新鮮培養(yǎng)液替換一半的培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)8 h。4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min,并用0.5%Triton X-100滲透細(xì)胞20 min。用3%牛血清白蛋白沖洗后,添加500 μL 1×Click反應(yīng)液,室溫避光孵育30 min。加入5 μg/mL Hoechst 33342對(duì)細(xì)胞核染色30 min。熒光顯微鏡觀察,拍照。Hoechst 33342核染為藍(lán)色,EdU染色為紅色。用紅色細(xì)胞數(shù)/藍(lán)色細(xì)胞數(shù)×100%表示EdU陽(yáng)性率。

1.2.5 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞葡萄糖、乳酸 通過葡萄糖攝取和乳酸生成評(píng)估細(xì)胞的糖酵解水平。使用葡萄糖含量檢測(cè)試劑盒(微量法)、乳酸含量(LA)檢測(cè)試劑盒(可見分光光度法)檢測(cè)細(xì)胞葡萄糖含量、乳酸含量。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求操作、計(jì)算。以對(duì)照組細(xì)胞葡萄糖含量、乳酸含量最為單位,實(shí)驗(yàn)組葡萄糖含量、乳酸含量占對(duì)照組葡萄糖含量、乳酸含量的百分比表示相對(duì)葡萄糖消耗率、相對(duì)乳酸生成率。

1.2.6 WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞SLC7A5蛋白 使用ReadyPrep 蛋白質(zhì)萃取試劑盒(總蛋白)從各組細(xì)胞中提取總蛋白,BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。通過SDS-PAGE分離蛋白,再轉(zhuǎn)移到PVDF膜。PVDF膜封閉處理后,使用SLC7A5(1∶2000)、GAPDH(1∶3000)一抗孵育(4 ℃,12 h)。然后用HRP標(biāo)記的IgG二抗(1∶1000)孵育(37 ℃,2 h)。ECL顯色,Image J軟件分析每個(gè)蛋白條帶的灰度。使用目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值之間的比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)細(xì)胞熒光活性 生物信息學(xué)靶標(biāo)預(yù)測(cè)網(wǎng)站Targetscan(https://www.targetscan.org)、starbase(https://starbase.sysu.edu.cn)預(yù)測(cè)miR-126-3p.1的靶標(biāo),發(fā)現(xiàn)SLC7A5為其下游靶基因之一。根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)合成野生型SLC7A5(含SLC7A5 3′ UTR-WT結(jié)合序列)、突變型SLC7A5(不含SLC7A5 3′ UTR-MUT結(jié)合序列),克隆至熒光載體psiCHECK2,形成熒光報(bào)告基因(SLC7A5 3′ UTR-WT、SLC7A5 3′ UTR-MUT)。Lipofectamine 2000將熒光報(bào)告基因與agomiRNA、agomiR-126-3p.1、antagomiRNA、antagomiR-126-3p.1共轉(zhuǎn)染SW1736細(xì)胞。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的熒光活性。

2 結(jié)果

2.1 miR-126-3p.1在甲狀腺癌中的表達(dá) TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)顯示,miR-126-3p.1在甲狀腺癌組織中表達(dá)水平顯著降低(見圖1A),作為癌癥診斷指標(biāo)的AUC值為0.68(見圖1B),高表達(dá)患者的存活率明顯升高(見圖1C)。Htori-3、SW1736、TPC-1細(xì)胞miR-126-3p.1表達(dá)分別為0.98±0.07、0.31±0.03、0.46±0.04,與Htori-3相比,SW1736、TPC-1細(xì)胞miR-126-3p.1表達(dá)顯著降低(F=451.095,P<0.001)。

圖1 miR-126-3p.1與甲狀腺癌之間的關(guān)系分析Figure 1 Analysis of the relationship between miR-126-3p.1 and thyroid cancer注:A.miR-126-3p.1在癌組織中的表達(dá);B.miR-126-3p.1在甲狀腺癌中的ROC分析;C.miR-126-3p.1與甲狀腺癌患者的生存分析。

2.2 過表達(dá)miR-126-3p.1對(duì)TPC-1細(xì)胞糖酵解的調(diào)控 與agomiRNA組相比,agomiR-126-3p.1組細(xì)胞miR-126-3p.1表達(dá)顯著升高,細(xì)胞增殖率、EdU陽(yáng)性率、相對(duì)葡萄糖消耗率、相對(duì)乳酸生成率均顯著降低(均P<0.05), 見表1。

表1 過表達(dá)miR-126-3p.1的SW1736細(xì)胞增殖、糖酵解Table 1 Proliferation and glycolysis of SW1736 cells overexpressing miR-126-3p.1

2.3 miR-126-3p.1靶向SLC7A5 Targetscan(https://www.targetscan.org)發(fā)現(xiàn),SLC7A5 3′UTR與miR-126-3p.1之間存在連續(xù)的6個(gè)互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。轉(zhuǎn)染agomiR-126-3p.1和SLC7A5 3′UTR-WT的TPC-1細(xì)胞熒光活性顯著降低,轉(zhuǎn)染antagomiR-126-3p.1和SLC7A5 3′UTR-WT的TPC-1細(xì)胞熒光活性顯著升高(均P<0.05)。在甲狀腺癌組織中miR-126-3p.1與SLC7A5之間呈顯著的負(fù)相關(guān)(R=-0.266,P<0.05)。與agomiRNA組相比,agomiR-126-3p.1組TPC-1細(xì)胞SLC7A5蛋白表達(dá)量顯著降低,與antagomiRNA組相比,antagomiR-126-3p.1組TPC-1細(xì)胞SLC7A5蛋白表達(dá)量顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見圖2。

圖2 miR-126-3p.1靶向SLC7A5Figure 2 miR-126-3p.1 targets SLC7A5注:A.互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn);B.雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果;C.miR-126-3p.1與SLC7A5在甲狀腺癌中的相關(guān)性;D.miR-126-3p.1負(fù)向調(diào)控SLC7A5蛋白。與agomiRNA組比較,①P<0.05;與agomiR-126-3p.1組比較,②P<0.05。

2.4 SLC7A5在甲狀腺癌中的表達(dá) SLC7A5在甲狀腺癌組織中的表達(dá)顯著高于正常組織(見圖3A),在SW1736、TPC-1細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于Htori-3細(xì)胞(見圖3B)。與Htori-3相比,SW1736、TPC-1細(xì)胞SLC7A5表達(dá)顯著升高(P<0.05),見表2。

表2 SLC7A5在Htori-3、SW1736、TPC-1細(xì)胞中的表達(dá)Table 2 SLC7A5 expression in Htori-3, SW1736 and TPC-1 cells

圖3 SLC7A5在甲狀腺癌中的表達(dá)Figure 3 SLC7A5 expression in thyroid carcinoma注:A.SLC7A5在甲狀腺癌組織中的表達(dá);B.SLC7A5在甲狀腺癌細(xì)胞中的表達(dá)。

2.5 敲減SLC7A5對(duì)SW1736細(xì)胞糖酵解的調(diào)控 與si-NC組相比,si-SLC7A5組SW1736細(xì)胞SLC7A5表達(dá)、細(xì)胞增殖率、EdU陽(yáng)性率、相對(duì)葡萄糖消耗率、相對(duì)乳酸生成率均顯著降低(P<0.05),見圖4、表3。

表3 敲減SLC7A5的SW1736細(xì)胞的增殖、糖酵解Table 3 Proliferation and glycolysis of SW1736 cells knockdown SLC7A5

圖4 SLC7A5蛋白表達(dá)Figure 4 SLC7A5 protein expression

2.6 過表達(dá)SLC7A5逆轉(zhuǎn)miR-126-3p.1對(duì)SW1736細(xì)胞糖酵解的作用 與agomiR-126-3p.1+pcDNA組相比,agomiR-126-3p.1+pcDNA-SLC7A5組SW1736細(xì)胞SLC7A5表達(dá)顯著升高,miR-126-3p.1表達(dá)顯著降低,細(xì)胞增殖率、EdU陽(yáng)性率、相對(duì)葡萄糖消耗率、相對(duì)乳酸生成率顯著升高(均P<0.05)。見圖5、表4。

表4 過表達(dá)SLC7A5和miR-126-3p.1的SW1736細(xì)胞增殖、糖酵解Table 4 Proliferation and glycolysis of SW1736 cells overexpressing SLC7A5 and miR-126-3p.1

圖5 SLC7A5蛋白表達(dá)Figure 5 SLC7A5 protein expression

3 討論

miR-126表達(dá)廣泛,在人類癌癥中具有診斷價(jià)值,其在某些癌癥中作為腫瘤抑制因子發(fā)貨作用,包括肺癌、胃癌、胰腺癌及惡性甲狀腺癌[10-11]。Tao等[12]報(bào)道,miR-126作為circPVT1的靶點(diǎn),在甲狀腺癌組織、細(xì)胞中低表達(dá),并且下調(diào)miR-126可逆轉(zhuǎn)沉默circPVT1對(duì)癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲的抑制和凋亡的促進(jìn)作用。Zeng等[13]在甲狀腺癌的研究中報(bào)道,miR-126在PTC-1、ATC細(xì)胞SW1736中低表達(dá),與NEAT1、VEGFA存在靶向關(guān)系,調(diào)控甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移侵襲及凋亡,暗示miR-126在甲狀腺癌中的潛在作用。本課題組的此研究發(fā)現(xiàn),miR-126-3p.1在甲狀腺癌組織、細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),這也與上述研究結(jié)果相一致。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)miR-126-3p.1抑制了癌細(xì)胞的增殖、葡萄糖消耗率、乳酸生成,表現(xiàn)出抑制癌細(xì)胞糖酵解的抑癌功能。深入研究發(fā)現(xiàn),miR-126-3p.1可靶向SLC7A5,并且他們?cè)诎┙M織中的表達(dá)水平呈明顯的負(fù)相關(guān)性,這也許可能與miR-126-3p.1在甲狀腺癌中發(fā)揮調(diào)控作用存在一定聯(lián)系。

據(jù)報(bào)道[14-15],在PTC中,SLC7A3、SLC7A5和SLC7A11表達(dá)水平的升高預(yù)示著患者的生存率較低或預(yù)后不良。在ATC的研究[16-17]中報(bào)道,SLC7A5在ATC小鼠腫瘤模型、ATC患者組織樣本中的表達(dá)均上調(diào),SLC7A5阻斷劑JPH203給藥后,模型小鼠腫瘤生長(zhǎng)停滯,這些臨床前的研究結(jié)果表明,SLC7A5抑制劑在甲狀腺癌中的治療前景。體外研究[18-20]顯示,JPH203通過抑制mTOR信號(hào),阻斷細(xì)胞從G0/G1期到S期的進(jìn)展,抑制ATC細(xì)胞的增殖,腫瘤生長(zhǎng),再次表明SLC7A5抑制劑是控制ATC的候選藥物。但是,SLC7A5對(duì)甲狀腺癌糖酵解過程是否有影響尚未可知。本研究結(jié)果顯示:SLC7A5在甲狀腺癌組織、細(xì)胞中表達(dá)升高,敲減SLC7A5不但抑制癌細(xì)胞的增殖,更抑制了癌細(xì)胞的糖酵解,這再次證實(shí)了SLC7A5在甲狀腺癌惡化過程中的關(guān)鍵作用,也說明其作為miR-126-3p.1靶標(biāo)在miR-126-3p.1調(diào)控甲狀腺癌過程中的重要性。過表達(dá)SLC7A5逆轉(zhuǎn)了miR-126-3p.1對(duì)癌細(xì)胞增殖、糖酵解的抑制作用。

4 結(jié)論

miR-126-3p.1抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖、糖酵解,這種抗癌作用的潛在機(jī)制與靶向SLC7A5有聯(lián)系,可為甲狀腺癌的治療提供新靶點(diǎn)。