岳秀杰 楊崔航 單妍 趙月 樊靜

(秦皇島市第四醫(yī)院北區(qū)病理科,河北 秦皇島 066000)

甲狀腺癌是一種常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤,好發(fā)于中老年女性,其發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過程。盡管甲狀腺癌患者的治療方法不斷發(fā)展,但5年癌癥特異性生存率仍欠滿意[1-2]。研究[3]表明,轉(zhuǎn)移和腫瘤復(fù)發(fā)的高比例是甲狀腺癌高發(fā)的主要原因。因此,抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移等特性在甲狀腺癌治療過程中至關(guān)重要。TGIF2(TGF-β-induced factor homeobox 2)是同源結(jié)構(gòu)域蛋白的三個(gè)氨基酸環(huán)延伸(Three-amino acid loop extension,TALE)超家族的成員,在細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移等過程中起著重要的調(diào)控作用[4-5]。miRNA可通過與mRNA的3′非翻譯區(qū)結(jié)合誘導(dǎo)mRNA切割或抑制基因翻譯,調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[6]。miRNA已被證明參與多種癌癥調(diào)控,包括甲狀腺癌[4, 7]。研究[8-9]發(fā)現(xiàn)miR-449a具有優(yōu)異的抗腫瘤特性,但其對(duì)甲狀腺癌的作用效果還未被闡明。本研究探討miR-449對(duì)CAL-62細(xì)胞中TGIF2的調(diào)控作用以及對(duì)CAL-62惡性增殖、氧化應(yīng)激和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)的抑制作用,以期為甲狀腺癌的預(yù)防和治療提供新的依據(jù)和策略。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 甲狀腺癌細(xì)胞CAL-62(https://web.expasy.org/cellosaurus/CVCL_1112)來自美國ATCC。主要試劑:miR-NC,miR-449a mimic,pcDNA,pcDNA-TGIF2,pMIR報(bào)告質(zhì)粒載體及試驗(yàn)所用序列購自RiboBio公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購自Sigma公司;Lipofectamine 2000試劑購自Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司;BCA試劑盒、SOD、MDA檢測(cè)試劑盒購自合肥萊爾生物科技有限公司;細(xì)胞蛋白提取試劑盒購自Foregene公司;逆轉(zhuǎn)錄酶、TRIzol試劑盒、熒光素酶檢測(cè)試劑盒購自美國普洛麥格公司。試驗(yàn)所用抗體均購自上海艾博抗生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將CAL-62細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和1×105U/L鏈霉素的培養(yǎng)基中,置于5%二氧化碳、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基每2 d更換一次,每3 d傳代一次,實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染 細(xì)胞分組:①為探索miR-449a能否在CAL-62細(xì)胞種過表達(dá),將CAL-62細(xì)胞分為mimic-NC組(陰性對(duì)照組)和miR-449a mimic(過表達(dá)miR-449a)組、對(duì)照組,按照分組分別通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染 mimic-NC、miR-449a mimic,對(duì)照組不進(jìn)行轉(zhuǎn)染,RT-PCR用以檢測(cè)miR-449a的過表達(dá)效率。②探索過表達(dá)TGIF2能否在CAL-62細(xì)胞實(shí)現(xiàn),將細(xì)胞分為pcDNA(陰性對(duì)照)組、pcDNA-TGIF2(過表達(dá)TGIF2)組、對(duì)照組,按照分組分別轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-TGIF2,對(duì)照組不進(jìn)行轉(zhuǎn)染,RT-PCR用以檢測(cè)TGIF2的過表達(dá)效率。③分別過表達(dá)miR-449a、TGIF2以及同時(shí)二者過表達(dá)對(duì)于腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,將細(xì)胞分為miR-449a mimic組、pcDNA-TGIF2組和mimic+TGIF2組、對(duì)照組,按照分組分別轉(zhuǎn)染 miR-449a mimic、pcDNA-TGIF2以及共轉(zhuǎn)染pcDNA-TGIF2和miR-449a mimic,后續(xù)進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染:以5×105/mL的密度將CAL-62細(xì)胞接種于12孔板中,約80%匯合度時(shí),按照上述分組使用Lipofectamine 2000分別將上述載體轉(zhuǎn)染至CAL-62細(xì)胞。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)方法 用TRIzol試劑提取CAL-62細(xì)胞的總RNA,使用SMA 400 UV檢測(cè)分離RNA的濃度和純度。使用逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒從RNA樣品中合成cDNA。TGIF2和miR-449a的實(shí)時(shí)PCR分別使用標(biāo)準(zhǔn)的SYBR Green PCR試劑盒和TaqMan miRNA檢測(cè)在實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行。將以GAPDH或U6為內(nèi)參,并通過2-ΔΔCt方法計(jì)算。定量PCR的反應(yīng)條件為:95 ℃10 min,95 ℃20 s,60 ℃30 s,72 ℃20 s循環(huán)45次。

1.2.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力 四組細(xì)胞分別以5×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板,在37 ℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后,加入CCK-8,在相同條件下孵育4 h。每組由5口平行組成。然后,添加10 μL/孔的CCK-8染料(5 mg/ml),然后在37 ℃下在5%的CO2氣氛中再培養(yǎng)4 h。然后用酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)量吸光度。

1.2.5 BrdU檢測(cè)細(xì)胞活力 用5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)試劑盒測(cè)定細(xì)胞的增殖。簡(jiǎn)單地說,將四組CAL-62細(xì)胞接種到96孔板(5×103個(gè)細(xì)胞/孔)中,在37 ℃孵育過夜。然后用1 mg/mL BrdU溶液標(biāo)記細(xì)胞3 h。此外,使用fixtenta溶液使細(xì)胞變性30 min,然后用過氧化物酶結(jié)合的抗BrdU抗體培養(yǎng)90 min[10]。細(xì)胞核用DAPI復(fù)染。在熒光顯微鏡下觀察BrdU陽性細(xì)胞的數(shù)量。

1.2.6 雙重?zé)晒馑孛笇?shí)驗(yàn) 收集生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的CAL-62細(xì)胞,接種于24孔板中,并在37 ℃、5%CO2條件的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。然后,將1 g PGL3-TGIF2-WT(SP1野生型)或PGL3-TGIF2-MUT(SP1突變型)以及miR-NC或miR-449a mimic和PRL-CMV質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入CAL-62細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h后,CAL-62細(xì)胞裂解15 min,雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量熒光素酶的相對(duì)活性,熒光素酶的相對(duì)活性(R/F)=螢火蟲熒光素酶活性/腎熒光素酶活性。

1.2.7 試劑盒檢測(cè)氧化應(yīng)激 通過試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中SOD、MDA含量,實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.8 DCF染色 參照相關(guān)文獻(xiàn)[12]方法測(cè)量ROS含量。CAL-62細(xì)胞在含5 mM H2DCFDA的Hank平衡鹽溶液中培養(yǎng)1 h。氧化后,非熒光H2DCFDA轉(zhuǎn)化為高熒光2′,7′-二氯熒光素(DCF)。用Olympus共焦顯微鏡在488 nm的激發(fā)波長(zhǎng)和515-540 nm的發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)量了DCF的熒光。用數(shù)字干涉對(duì)比法(DIC)獲得細(xì)胞圖像。用Image J軟件分析每個(gè)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度和每個(gè)視野中ROS陽性細(xì)胞的數(shù)量。

1.2.9 蛋白免疫印跡(Western blot) 將各組CAL-62細(xì)胞加裂解液后提取總蛋白,用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白含量。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,加入一抗(TGIF2,E-cadherin, N-cadherin,Fibronectin),4 ℃孵育過夜,TBST洗膜,加入二抗HRP-IgG,室溫孵育1 h,TBST洗膜。通過Image LabTM軟件行灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 CAL-62細(xì)胞轉(zhuǎn)染 與Control組相比,mimic-NC組CAL-62細(xì)胞中miR-449a和TGIF2相對(duì)水平變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),miR-449a mimic組miR-449a相對(duì)水平顯著提升,TGIF2相對(duì)水平顯著降低(均P<0.05)。與Control組比較,pcDNA組CAL-62細(xì)胞中TGIF2蛋白相對(duì)表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),pcDNA-TGIF2組TGIF2蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與pcDNA-TGIF2組比較,mimic+TGIF2組CAL-62細(xì)胞中TGIF2 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 CAL-62細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果Figure 1 Transfection results of CAL-62 cells注:A.miR-449a mimic成功轉(zhuǎn)染CAL-62細(xì)胞;B.miR-449a mimic轉(zhuǎn)染CAL-62細(xì)胞中TGIF2的表達(dá);C.pcDNA-TGIF2成功轉(zhuǎn)染CAL-62細(xì)胞;D、E.miR-449a mimic與pcDNA-TGIF2共轉(zhuǎn)染CAL-62細(xì)胞中TGIF2的表達(dá)。與Control相比,①P<0.05;與pcDNA-TGIF2組相比,②P<0.05。

2.2 miR-449a與TGIF2靶向關(guān)系 運(yùn)用TargetScan軟件對(duì)二者的關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)。提示miR-449a可與TGIF2基因的3′-UTR區(qū)直接結(jié)合(見圖2A)。為了進(jìn)一步確定CAL-62細(xì)胞中miR-449a與TGIF2的表達(dá)關(guān)系,用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)法進(jìn)一步確認(rèn)。結(jié)果顯示miR-449a可以顯著抑制TGIF2 3′-UTR-wt載體的熒光強(qiáng)度(P<0.05),但對(duì)TGIF2 3′-UTR-mut載體的熒光強(qiáng)度幾乎無影響(見圖2B)。結(jié)果表明,miR-449a和TGIF2具有良好的靶向關(guān)系。

圖2 miR-449a與TGIF2靶向關(guān)系Figure 2 The targeting relationship between miR-449a and TGIF2注:A.TargetScan軟件預(yù)測(cè)結(jié)果;B.雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因檢測(cè)結(jié)果。與Luc-TGIF2 3’UTR wt相比,①P<0.05。

2.3 miR-449a過表達(dá)對(duì)CAL-62細(xì)胞活力的影響 與Control相比,pcDNA-TGIF2組CAL-62細(xì)胞活力顯著增強(qiáng),miR-449a mimic組細(xì)胞活力顯著下降(P<0.05)。而與pcDNA-TGIF2組相比,mimic+TGIF2組的細(xì)胞活力顯著下降(P<0.05)。表明miR-449a過表達(dá)可抑制TGIF2過表達(dá)引起的CAL-62細(xì)胞活力提升。見圖3。

圖3 miR-449a過表達(dá)對(duì)CAL-62細(xì)胞活力的影響Figure 3 The effect of miR-449a overexpression on CAL-62 cell viability注:與Control相比,①P<0.05;與pcDNA-TGIF2組相比,②P<0.05。

2.4 miR-449a過表達(dá)可抑制CAL-62細(xì)胞增殖 與Control組相比,pcDNA-TGIF2組BrdU陽性細(xì)胞百分率顯著提升,miR-449a mimic組BrdU陽性細(xì)胞百分率顯著下降(均P<0.05)。與pcDNA-TGIF2組相比,mimic+TGIF2組的BrdU陽性細(xì)胞百分率顯著下降(P<0.05)。這些結(jié)果表明miR-449a過表達(dá)可抑制TGIF2過表達(dá)引起的CAL-62細(xì)胞增殖。見圖4。

圖4 BrdU染色檢測(cè)細(xì)胞增殖Figure 4 BrdU staining was used to detect cell proliferation注:A.BrdU染色典型圖像(×100);B.BrdU陽性細(xì)胞百分率。與Control組相比,①P<0.05;與pcDNA-TGIF2組相比,②P<0.05。

2.5 miR-449a過表達(dá)對(duì)CAL-62細(xì)9胞氧化應(yīng)激的影響 與Control組相比,pcDNA-TGIF2組CAL-62細(xì)胞中SOD的含量顯著增加,MDA的含量顯著降低(P<0.05),miR-449a mimic轉(zhuǎn)染起到了相反的作用。與pcDNA-TGIF2組相比,mimic+TGIF2組細(xì)胞中SOD的含量顯著降低,MDA積累顯著增加(P<0.05)。運(yùn)用DCF染色檢測(cè)了ROS的產(chǎn)生。pcDNA-TGIF2組ROS的產(chǎn)生量顯著減少,miR-449a mimic組ROS含量顯著提升(P<0.05)。與pcDNA-TGIF2組相比,mimic+TGIF2組細(xì)胞中ROS的含量顯著增加(P<0.05)。這些結(jié)果表明miR-449a過表達(dá)可加劇CAL-62細(xì)胞氧化應(yīng)激。見圖5。

圖5 各組細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)水平Figure 5 Levels of oxidative stress indexes in each group 注:A.各組細(xì)胞中SOD水平;B.各組細(xì)胞中MDA水平;C.DCF染色典型圖像;D.各組細(xì)胞中ROS陽性細(xì)胞數(shù)量。與Control組相比,①P<0.05;與pcDNA-TGIF2組相比,②P<0.05。

2.6 miR-449a過表達(dá)對(duì)CAL-62細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換的影響 觀察各組細(xì)胞形態(tài)可以看出,pcDNA-TGIF2組CAL-62細(xì)胞EMT程度明顯增強(qiáng),miR-449a mimic組CAL-62細(xì)胞EMT情況有所緩解。與pcDNA-TGIF2組相比,mimic+TGIF2組細(xì)胞中EMT情況顯著緩解(P<0.05)。為了進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果,用Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin和Fibronectin在各組細(xì)胞中的表達(dá)。與Control組相比,pcDNA-TGIF2組CAL-62細(xì)胞中N-cadherin和Fibronectin的表達(dá)水平顯著提升,E-cadherin表達(dá)水平顯著降低,miR-449a mimic組CAL-62細(xì)胞中N-cadherin和Fibronectin的表達(dá)水平顯著降低,E-cadherin表達(dá)水平顯著提升(均P<0.05)。與pcDNA-TGIF2組相比,mimic+TGIF2組CAL-62細(xì)胞中N-cadherin和Fibronectin的表達(dá)水平顯著降低,E-cadherin表達(dá)水平顯著提升(均P<0.05)。這些結(jié)果表明miR-449a過表達(dá)可抑制CAL-62細(xì)胞EMT情況。見圖6。

圖6 各組細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換情況Figure 6 EMT in each group 注:A.EMT典型圖像;B.Western Blot檢測(cè)相對(duì)蛋白水平。與Control相比,①P<0.05;與pcDNA-TGIF2組相比,②P<0.05。

3 討論

隨著醫(yī)學(xué)研究和科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,甲狀腺癌治療方法不斷創(chuàng)新,有所突破,超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查是良惡性疾病診斷的主要手段,但5年癌癥特異性生存率仍不令人滿意[13-14]。因此,繼續(xù)尋找新型甲狀腺治療方法和藥物勢(shì)在必行。

近年來,生物醫(yī)學(xué)研究成為熱點(diǎn),在甲狀腺癌治療研究領(lǐng)域也得到了應(yīng)用。其中最常見的是以miRNAs為靶點(diǎn)或調(diào)控因子的研究[15]。Lei 等[16]發(fā)現(xiàn)lncRNA TUG1通過靶向miR-145可抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖、遷移和EMT的形成。Nixon 報(bào)道[17]稱一系列miRNAs可以作為甲狀腺球蛋白(Thyroglobulin,Tg)的替代性標(biāo)志物用于診斷和術(shù)后監(jiān)測(cè)。當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生的活性物質(zhì)超出機(jī)體的清除能力時(shí),則導(dǎo)致氧化與抗氧化系統(tǒng)之間的平衡失調(diào),會(huì)對(duì)正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能造成不可逆的損傷,進(jìn)一步導(dǎo)致體細(xì)胞突變和轉(zhuǎn)化,激活致癌通路促進(jìn)細(xì)胞癌變[18]。EMT關(guān)鍵蛋白E-cadherin介導(dǎo)了細(xì)胞間黏附,在多種惡性腫瘤中被檢測(cè)到表達(dá)降低[19]。N-cadherin和Fibronectin在腫瘤轉(zhuǎn)移中扮演了關(guān)鍵角色,其表達(dá)高低可判定EMT的進(jìn)展[20]。本研究將miR-449a運(yùn)用于甲狀腺癌細(xì)胞CAL-62惡性增殖,氧化應(yīng)激和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換抑制的研究,結(jié)果令人鼓舞。結(jié)果顯示miR-449a轉(zhuǎn)染可降低CAL-62細(xì)胞中BrdU陽性細(xì)胞百分率,降低SOD含量,增加MDA和ROS含量,并且抑制N-cadherin和Fibronectin表達(dá)水平,提升了E-cadherin表達(dá)水平。上述結(jié)果預(yù)示miR-449a可抑制甲狀腺癌細(xì)胞CAL-62的增殖和EMT,促進(jìn)其氧化應(yīng)激損傷。為了進(jìn)一步探討這些成果背后的潛在機(jī)制,本研究分析了實(shí)驗(yàn)過程中TGIF2的調(diào)控水平。

TGIF2是一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,其異常表達(dá)已在多種癌癥中得到顯現(xiàn)[21-22]。Du等[5]研究發(fā)現(xiàn)TGIF2可通過介導(dǎo)EGFR/RAS/ERK信號(hào)通路加速肺腺癌的發(fā)展進(jìn)程。Lu 等[23]報(bào)道稱miR-541-3p可通過直接靶向TGIF2逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌的惡化。在本研究中,TGIF2在CAL-62細(xì)胞中的異常之高,pcDNA-TGIF2轉(zhuǎn)染可誘發(fā)細(xì)胞惡性增殖,降低其氧化應(yīng)激水平,促進(jìn)細(xì)胞EMT發(fā)生。先前的研究人員所得結(jié)論與我們的相似。楊亞麗等[24]發(fā)現(xiàn)TGIF2可以通過促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞遷移而參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生。尹希燕等[25]報(bào)道稱沙利度胺通過調(diào)控miR-29c-3p/TGIF2途徑抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)miR-449a和TGIF2具有良好的靶向關(guān)系。miR-449a mimic和pcDNA-TGIF2共轉(zhuǎn)染顯著降低了TGIF2水平并抑制細(xì)胞惡性增殖和EMT水平,加劇氧化應(yīng)激。這些結(jié)論表明TGIF2是調(diào)控甲狀腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的靶點(diǎn),而miR-449a過表達(dá)對(duì)其具有很好的調(diào)控作用。

鑒于近年來甲狀腺癌的全球發(fā)病率有增無減,深入了解和揭示甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制,并尋求有效的預(yù)防、診斷和治療方法與策略是必不可少的,也是刻不容緩的。在本研究中miR-449a過表達(dá)可以通過下調(diào)TGIF2水平抑制CAL-62細(xì)胞增殖和EMT,促進(jìn)其氧化應(yīng)激損傷。這預(yù)示miR-449a靶向TGIF2水平的調(diào)控可能是有前途的甲狀腺癌的治療策略。由于本研究在有限的樣本和局限的實(shí)驗(yàn)環(huán)境下進(jìn)行,切實(shí)的實(shí)驗(yàn)效果還需在更進(jìn)一步的驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果提示,miR-449a過表達(dá)可通過靶向TGIF2抑制甲狀腺癌細(xì)胞CAL-62惡性增殖,加劇其氧化應(yīng)激和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換。