呂曉龍 李密

（1）中國科學(xué)院沈陽自動化研究所，機器人學(xué)國家重點實驗室，沈陽 110016；2）中國科學(xué)院機器人與智能制造創(chuàng)新研究院，沈陽 110169；3）沈陽工業(yè)大學(xué)人工智能學(xué)院，沈陽 110870）

單細胞力學(xué)特性分析為揭示調(diào)控生命活動及疾病發(fā)生發(fā)展過程的內(nèi)在規(guī)律提供了新的可能。細胞是生命活動的基本結(jié)構(gòu)單元和功能單元，目前人類對細胞生理行為及特性的認知主要基于傳統(tǒng)生化實驗群體平均研究方法［1］，即對培養(yǎng)皿/試管中的全體細胞進行測量并假定所得到的全體細胞行為活動的平均結(jié)果可代表該群體中的典型細胞行為［2］。群體平均研究方法的不足之處是其掩蓋了細胞間的差異以及群體中可能存在的少數(shù)亞群細胞所具有的顯著獨特生理行為［3-4］。細胞之間的異質(zhì)性（heterogeneity）是細胞動態(tài)生命活動過程（如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄和細胞命運決定等［5］）的普遍特征［6］，即使是形態(tài)完全一樣的克隆細胞之間在基因表達以及刺激響應(yīng)等方面也存在著差異［7］，導(dǎo)致細胞間異質(zhì)性的原因可能包括基因突變、表觀遺傳修飾、隨機基因表達、局部微環(huán)境差異等［8-9］，但目前對于這些機制的認知還很不足。特別是，越來越多的證據(jù)表明，細胞異質(zhì)性在人類疾病發(fā)生發(fā)展及演變過程中起著關(guān)鍵性的作用，如腫瘤內(nèi)癌細胞之間的異質(zhì)性驅(qū)動腫瘤進化［10］并進而增強腫瘤對藥物的抵抗能力［11］，給癌癥臨床診療帶來了極大挑戰(zhàn)［12］。因此，生命科學(xué)領(lǐng)域研究者日益認識到開展單細胞探測研究有助于揭示生命活動奧秘以及癌癥等重大疾病的精準診療［13］。另一方面，力學(xué)特性在生理病理活動過程中（如干細胞分化［14］、腫瘤發(fā)生發(fā)展［15］等）起著重要調(diào)控作用。細胞通過表面蛋白質(zhì)分子（如整合素、離子通道等）來感知細胞外微環(huán)境中的力學(xué)因素，并通過力學(xué)傳導(dǎo)機制將其轉(zhuǎn)化為生化信號以觸發(fā)下游細胞響應(yīng)進而調(diào)控細胞生理功能［16-17］。與此同時，細胞在其生命活動過程中也會動態(tài)改變微環(huán)境的力學(xué)特性（如黏彈特性［18］）。細胞與微環(huán)境之間的相互作用通常會導(dǎo)致細胞力學(xué)特性的動態(tài)變化，特別是在疾病發(fā)生及演變過程中（如腫瘤形成及轉(zhuǎn)移［19］）通常會伴隨著細胞力學(xué)特性的顯著獨特變化，因而細胞力學(xué)特性也被認為是癌癥的重要物理特征［20］。因此，開展單細胞力學(xué)特性探測研究對于生命健康領(lǐng)域具有廣泛而重要的基礎(chǔ)意義。

原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）的出現(xiàn)為單細胞力學(xué)特性研究提供了強大工具。AFM利用壓電陶瓷管驅(qū)動一根自由端集成有一個極細針尖的微型懸臂梁在水平面內(nèi)對樣本表面進行光柵式掃描，同時利用一束激光照射到懸臂梁背面并反射至四象限位置敏感探測器（position sensitivity detector，PSD）來感知掃描過程中針尖表面原子與樣本表面原子之間的相互作用，并進一步通過信號處理與反饋電路控制壓電陶瓷管在垂直方向運動以維持針尖與樣本之間相互作用力的恒定，在這個過程中記錄壓電陶瓷管在水平面內(nèi)每個采樣點上的垂直方向位置變化即得到樣本表面形貌三維圖像［21］。AFM具有納米級的空間分辨率（0.5~1 nm）和皮牛級的力感知靈敏度（10~104pN）［22］，不僅可以直接在生理環(huán)境下（37℃，5% CO2，培養(yǎng)基溶液）對無任何預(yù)處理的活體狀態(tài)細胞的精細結(jié)構(gòu)進行成像［23］，還可以在力譜模式下通過控制探針在細胞表面進行壓痕（indentation）實驗以對細胞多種力學(xué)特性（如楊氏模量、黏性系數(shù)、細胞間黏附力、細胞表面分子結(jié)合力等［24］）進行定量測量。AFM已成為單細胞力學(xué)特性探測的重要研究方法，促進了力學(xué)生物學(xué)（mechanobiology）領(lǐng)域的研究進展［25-27］。然而，現(xiàn)有AFM單細胞力學(xué)特性探測實驗嚴重依賴人工，如操作員需要在光學(xué)顯微視覺導(dǎo)引下人工控制AFM探針移動至合適位置以使探針準確地對細胞特定區(qū)域進行壓痕實驗并獲取力曲線，待測量完成后需要人工控制探針對下一個細胞進行測量，導(dǎo)致實驗效率極其低下。特別是長時間實驗容易導(dǎo)致操作員疲勞進而影響人工控制精度。此外，在人工控制AFM探針移動至細胞表面后，由于探針懸臂梁對視線的遮擋，往往難以準確判斷探針針尖是否移動至目標區(qū)域。針對該問題，本課題組在之前的研究中曾經(jīng)提出了結(jié)合光學(xué)圖像識別和AFM的單細胞力學(xué)特性快速測量方法［28］，實現(xiàn)了對單個細胞中心區(qū)域力學(xué)特性的快速測量。本文在之前的研究基礎(chǔ)上，進一步實現(xiàn)了單個游離態(tài)細胞表面不同區(qū)域（中心和邊緣）力學(xué)特性以及聚團生長細胞力學(xué)特性的精準快速測量，本研究工作對于AFM在生命科學(xué)領(lǐng)域的實際應(yīng)用具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

本實驗所用的HEK 293（人胚胎腎細胞）和HGC-27（人未分化胃癌細胞）細胞購自中國科學(xué)院細胞庫（上海）。細胞培養(yǎng)基（DMEM高糖培養(yǎng)基和RPMI-1640）和磷酸鹽緩沖液（PBS）購自上海典瑞生物科技有限公司，胎牛血清購自美國Thermo Fisher公司，青霉素-鏈霉素溶液購自美國Hyclone公司。HEK 293細胞在含有10%胎牛血清和1%的青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，HGC-27細胞在含有10%胎牛血清和1%的青霉素-鏈霉素的RPMI-1640中培養(yǎng)。兩種細胞均接種在50 ml細胞培養(yǎng)瓶（廣州潔特生物有限公司）中，并置于細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司）中培養(yǎng)（37℃，5% CO2，95%空氣）。實驗前需要將細胞從細胞培養(yǎng)瓶中傳代至35 mm細胞培養(yǎng)皿（廣州潔特生物有限公司）中，并培養(yǎng)24 h以上。

1.2 AFM實驗及微球探針制作

本文采用的AFM為美國Bruker公司生產(chǎn)的JPK NanoWizard型AFM，該AFM搭建在一臺日本Nikon公司生產(chǎn)的Eclipse Ti-U型光學(xué)倒置顯微鏡上（圖1a）。AFM細胞力學(xué)特性測量實驗在細胞培養(yǎng)基中進行。實驗所采用的AFM探針型號為美國Bruker公司的MLCT-C，探針材料為氮化硅，探針懸臂梁彈性系數(shù)為0.01 N/m。在光學(xué)顯微鏡導(dǎo)引下利用AFM微操作將單個聚苯乙烯微球（購自天津市倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心）黏附至MLCT-C懸臂梁上制成微球探針［28-29］。簡單來說，首先將微球溶液（微球直徑20 μm）滴至干凈載玻片的一端，并在載玻片的另一端表面將AB膠（購自美國3M公司）以1∶1均勻混合。緊接著，在光學(xué)顯微鏡導(dǎo)引下控制AFM探針輕輕接觸膠水后立即控制AFM探針回退，并進而控制沾有膠水的探針接觸載玻片表面的單個微球并保持接觸狀態(tài)3 min（接觸時間過短會導(dǎo)致在探針回退過程中微球容易從懸臂梁脫落）。隨后控制AFM探針回退，并將制作好的微球探針置于探針盒中室溫保存12 h后即可用于實驗。分別利用日本HIROX公司的正置光學(xué)顯微鏡和美國Thermo Fisher公司的掃描電子顯微鏡（SEM）對制備的微球探針進行成像，結(jié)果清晰地顯示了探針懸臂梁上黏附的單個微球（圖1a中I和II）。在進行AFM細胞壓痕實驗前，首先控制AFM微球探針在基底空白區(qū)域獲取力曲線以校正探針懸臂梁的偏轉(zhuǎn)靈敏度，并隨后利用AFM熱噪聲模塊對懸臂梁的彈性系數(shù)進行精確校正。為了使AFM測量實驗結(jié)果具有可比性，在所有細胞上獲取力曲線的參數(shù)均保持一致：探針逼近速度為2 μm/s，力曲線范圍為3 μm，探針最大加載力為2 nN。

Fig.1 Experimental platform of optical image recognition-assisted AFM for the detection of single-cell mechanical properties

1.3 光學(xué)圖像自動目標識別輔助AFM細胞力學(xué)特性探測

本文提出的光學(xué)圖像自動目標識別輔助AFM對單個細胞不同部位（邊緣區(qū)域和中心區(qū)域）力學(xué)特性進行精準快速測量的流程如圖1f所示。通過AFM搭載的光學(xué)倒置顯微鏡（圖1a）采集細胞和AFM探針的光學(xué)明場圖像（圖1b，d）。利用預(yù)先訓(xùn)練好的嵌入視覺轉(zhuǎn)換器（ViT）模塊的雙UNet深度學(xué)習(xí)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型識別出光學(xué)明場圖像中目標細胞的邊緣區(qū)域，利用預(yù)先訓(xùn)練好的YOLO深度學(xué)習(xí)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型識別出光學(xué)明場圖像中目標細胞的中心區(qū)域，獲取細胞邊緣區(qū)域和中心區(qū)域的重心坐標，并同時利用基于旋轉(zhuǎn)不變局部二進制模式（RILBP）特征的模板匹配算法識別出光學(xué)明場圖像中AFM探針微球針尖的坐標位置，進而可得到細胞特定區(qū)域（邊緣區(qū)域和中心區(qū)域）與微球針尖之間的空間位置關(guān)系。隨后將空間位置關(guān)系輸入至AFM操控軟件中，即可控制AFM探針準確移動至目標細胞特定區(qū)域并對該區(qū)域的力學(xué)特性進行測量。在對AFM探針移動范圍內(nèi)所有細胞進行測量后，控制AFM探針移動至其他細胞附近，并重復(fù)上述過程。

深度學(xué)習(xí)算法的發(fā)展為醫(yī)學(xué)圖像分割帶來了巨大突破，特別是UNet已成為醫(yī)學(xué)影像領(lǐng)域最受歡迎的深度學(xué)習(xí)網(wǎng)絡(luò)架構(gòu)［30］。UNet使用卷積層網(wǎng)絡(luò)來執(zhí)行語義分割任務(wù)，其具有對稱的網(wǎng)絡(luò)架構(gòu)，即包含1個可以從圖像中提取空間特征的編碼器（encoder）和1個可以從編碼特征中重構(gòu)分割圖的解碼器（decoder）。然而，由于UNet神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)相對簡單，能夠?qū)W習(xí)提取的特征較為有限，在復(fù)雜場景下的分割精度還有待提高。另一方面，近年來ViT以其強大的表示能力在機器視覺領(lǐng)域得到了廣泛關(guān)注，特別是其在很多視覺基準數(shù)據(jù)集中展現(xiàn)出了類似或優(yōu)于卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遞歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的能力［31］。因此，本文通過將UNet網(wǎng)絡(luò)與ViT結(jié)合，提出了嵌入ViT模塊的雙UNet神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，以實現(xiàn)對細胞邊緣部位的精確分割（圖2）。嵌入ViT模塊的雙UNet神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)由兩部分構(gòu)成，第一部分是嵌入ViT模塊的深層UNet神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，用于提取學(xué)習(xí)圖像中的復(fù)雜特征，第二部分是淺層UNet神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，用于對第一部分網(wǎng)絡(luò)提取學(xué)習(xí)到的特征進行再學(xué)習(xí)，以減少模糊邊界和不確定區(qū)域，提高網(wǎng)絡(luò)分割精確度。嵌入ViT模塊會導(dǎo)致UNet網(wǎng)絡(luò)的深度和參數(shù)量增加，因此在原有卷積層上構(gòu)建了殘差卷積網(wǎng)絡(luò)以防止訓(xùn)練過程中出現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)退化問題。嵌入ViT模塊的深層UNet網(wǎng)絡(luò)在最高分辨率層使用殘差卷積提取圖像的淺層語義信息，在其他分辨率層通過ViT模塊提取特征圖中的長距離像素關(guān)聯(lián)，以獲得圖像深層次的語義信息。嵌入ViT模塊的深層UNet網(wǎng)絡(luò)擁有3個輸出，分別為原始輸出分類，分類較好的部分以及分類較差的部分，其中分類較好的部分為分類正確且置信度高于0.75的區(qū)域，分類較差的部分為分類錯誤或分類正確但置信度低于0.75的區(qū)域。將3個輸出進行融合后輸入至淺層UNet網(wǎng)絡(luò)中，淺層UNet網(wǎng)絡(luò)對嵌入ViT模塊的深層UNet網(wǎng)絡(luò)提取的特征進行更進一步的學(xué)習(xí)，以提高網(wǎng)絡(luò)對細胞邊緣部分的分割精度。對照實驗結(jié)果（圖3）顯示嵌入ViT模塊的雙UNet神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可有效識別細胞邊緣部位，且識別結(jié)果顯著優(yōu)于UNet網(wǎng)絡(luò)以及嵌入ViT模塊的UNet網(wǎng)絡(luò)。

Fig.2 Schematic illustration of the presented dual UNet neural network with an embedded vision transformer (ViT) module

Fig.3 Comparison of cell edge recognition results

采用YOLOv7深度學(xué)習(xí)目標檢測算法來對所采集的光學(xué)明場圖像中的細胞整體進行識別。YOLO系列算法是一種代表性的單階段圖像目標檢測網(wǎng)絡(luò)，在實時機器視覺領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。YOLOv7為YOLO算法家族的更新版本，通過主干特征提取網(wǎng)絡(luò)對輸入圖像進行特征提取得到3個不同大小的特征矩陣，并將這3個特征矩陣進行特征融合后在檢測頭生成不同大小的檢測框以對目標進行識別。YOLOv7算法已在茶樹病害檢測［32］、水下生物檢測［33］、表面裂紋缺陷檢測［34-35］等方面得到了應(yīng)用。本文利用YOLOv7算法對光學(xué)明場圖像中的游離態(tài)及聚團生長的細胞中心區(qū)域進行識別。

訓(xùn)練集圖像由AFM搭載的光學(xué)倒置顯微鏡（圖1a）拍攝得到，圖像大小為1 936×1 216像素。利用Labelme軟件對用于嵌入ViT模塊的雙UNet網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練的圖像進行標注（圖1c，e），數(shù)據(jù)集由157張原始明場圖像及其標注圖像經(jīng)過旋轉(zhuǎn)、明暗變換等一系列圖像增強操作后得到的785張圖像組成，該數(shù)據(jù)集同樣用于UNet網(wǎng)絡(luò)和UNet-ViT網(wǎng)絡(luò)以進行對照研究（圖3）。利用Labelimg軟件對用于YOLOv7網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練的圖像進行標注，數(shù)據(jù)集由340張細胞圖像組成。隨后在Windows 10系統(tǒng)環(huán)境下，采用PyTorch框架，使用矩池云人工智能云計算平臺（浙江）對數(shù)據(jù)進行訓(xùn)練。嵌入ViT模塊的雙UNet網(wǎng)絡(luò)和YOLOv7網(wǎng)絡(luò)的迭代次數(shù)均為200次，經(jīng)過訓(xùn)練得到的網(wǎng)絡(luò)模型分別用于對細胞邊緣部位和中心部位進行檢測識別。

采用基于RILBP特征的模板匹配算法對光學(xué)明場圖像中的微球探針針尖進行定位。RILBP特征是一種反映像素點間灰度值相對大小的特征，對光照強度有較好的魯棒性，通過對光學(xué)明場圖像和微球探針模板圖像（模板通過在光學(xué)明場圖像中以微球為中心截取得到）的RILBP特征圖進行匹配可以削弱實驗過程中細胞生理代謝活動導(dǎo)致的培養(yǎng)基顏色變化給圖像光強帶來的影響，提高模板匹配算法的精確度。此外，RILBP特征還具有旋轉(zhuǎn)不變性［36］，可有效避免AFM探針安裝姿態(tài)角度差對圖像模板匹配的影響。利用C++語言編寫基于RILBP的模板匹配算法程序，并調(diào)用OpenCV開源算法庫中的平方差匹配方法以完成對光學(xué)明場圖像中AFM微球探針針尖的定位。另外，為了對光學(xué)明場圖像中像素點之間的實際空間距離進行標定，在基底空白區(qū)域通過AFM操控軟件控制AFM探針移動一定距離，隨后利用模板匹配算法分別獲取探針移動前后在圖像中的坐標，即可得到像素點之間距離與實際空間距離的對應(yīng)關(guān)系［28］。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本文利用微球針尖探針對細胞力學(xué)特性進行測量，因此采用Hertz模型對獲取的力曲線進行分析以得到細胞楊氏模量［37］：

其中F為探針加載力，E為細胞楊氏模量，δ為壓痕深度，R為微球半徑，υ為細胞泊松比（通常認為活細胞為不可壓縮材料，因此υ=0.5）。探針加載力可以根據(jù)胡克定律直接從AFM記錄的力曲線中得到：

其中k為熱噪聲校正的探針懸臂梁彈性系數(shù)，x為懸臂梁偏轉(zhuǎn)量。需要指出的是，獲取的力曲線分為逼近曲線和回退曲線兩部分，Hertz模型由于不考慮探針與細胞之間的相互作用通常采用逼近曲線計算細胞楊氏模量［38-39］。根據(jù)逼近曲線上的接觸點將逼近曲線轉(zhuǎn)化為壓痕曲線后（壓電陶瓷管垂直方向位置變化量減去懸臂梁偏轉(zhuǎn)量即為壓痕深度），利用Matlab軟件（美國Mathworks公司）編寫的Hertz模型擬合程序?qū)汉矍€進行擬合即得到細胞楊氏模量。

2 結(jié)果與討論

在光學(xué)圖像自動目標識別算法導(dǎo)引下，首先利用AFM對單個游離態(tài)細胞不同部位（邊緣區(qū)域和中心區(qū)域）的力學(xué)特性進行了測量。圖4展示了對單個HGC-27活細胞邊緣部位和中心部位力學(xué)特性進行探測的實驗流程及結(jié)果。控制AFM微球探針到達目標細胞附近后，獲取細胞和AFM探針的光學(xué)明場圖像（圖4a）。隨后，利用模板匹配算法識別出光學(xué)明場圖像中的AFM微球針尖位置（圖4b），并利用深度學(xué)習(xí)算法分別識別出細胞中心區(qū)域（圖4c）和邊緣區(qū)域（圖4d），在此基礎(chǔ)上即可自動得到微球針尖與細胞中心區(qū)域（圖4e）及細胞邊緣區(qū)域（圖4f）之間的空間位置關(guān)系。隨后即可根據(jù)空間位置關(guān)系分別將AFM探針準確移動至細胞邊緣區(qū)域（圖4g，h）和中心區(qū)域（圖4i），并分別在細胞邊緣區(qū)域（圖4j，k）和中心區(qū)域（圖4l）獲取力曲線。利用Hertz模型對獲取的力曲線進行分析即得到目標細胞邊緣區(qū)域和中心區(qū)域的楊氏模量（圖4j-l）。為了測試方法的普適性，利用所建立的方法對HEK 293活細胞進行了探測，結(jié)果清晰地顯示基于光學(xué)圖像自動目標識別技術(shù)可將AFM微球探針準確移動至HEK 293細胞的邊緣區(qū)域和中心區(qū)域并進行力學(xué)特性測量（圖5）。分別對10個HGC-27細胞和10個HEK 293細胞進行了測試，統(tǒng)計結(jié)果（圖6）顯示細胞中心區(qū)域的楊氏模量顯著小于邊緣區(qū)域的楊氏模量。與細胞邊緣區(qū)域相比，細胞中央?yún)^(qū)域較厚，受堅硬基底的影響（基底效應(yīng)）更小，導(dǎo)致AFM壓痕實驗測量得到的細胞中央?yún)^(qū)域的楊氏模量較?。?0］。另外，細胞骨架與細胞力學(xué)特性密切相關(guān)，而由于在細胞生理病理過程中細胞不同部位骨架蛋白構(gòu)成及排列的差異［41］，細胞不同部位通常會顯示出不同的力學(xué)特性。本文基于光學(xué)圖像自動目標識別實現(xiàn)了將AFM探針針尖快速準確導(dǎo)引至單個細胞的邊緣區(qū)域和中心區(qū)域進行力學(xué)特性測量，有助于從亞細胞尺度揭示生命活動的力學(xué)調(diào)控機制。

Fig.4 Utilizing AFM to measure the mechanical properties of different regions of a single living isolated HGC-27 cell under the guidance of optical image automatic recognition

Fig.5 Utilizing AFM to measure the mechanical properties of different regions of a single living isolated HEK 293 cell under the guidance of optical image automatic recognition

Fig.6 Statistical results and Gaussian distribution fitting results of the mechanical properties of different parts of cells measured by AFM under the guidance of optical image automatic recognition

隨后利用所建立的方法對聚團生長的細胞進行了實驗。圖7展示了對聚團生長的單個HEK 293活細胞進行探測的結(jié)果。由于細胞聚集生長后，細胞之間通過黏附分子（如鈣黏蛋白）相互連接［42］，使細胞邊緣部分受相鄰細胞的影響，因此只對聚集生長細胞的中心區(qū)域的力學(xué)特性進行了測量。可以看到無論是低密度聚團生長細胞（圖7a），還是高密度聚團生長細胞（圖7b），深度學(xué)習(xí)圖像識別算法均可有效地從光學(xué)明場圖像中分割出單個聚團細胞（圖7a中III，圖7b中III），在此基礎(chǔ)上將AFM微球針尖準確導(dǎo)引至目標聚團細胞（圖7a中V，圖7b中V）并對細胞力學(xué)特性進行測量。圖8為對聚團生長的單個HGC-27活細胞進行探測的結(jié)果，同樣顯示了在深度學(xué)習(xí)圖像識別導(dǎo)引下可將AFM微球針尖準確移動至聚團生長的單個HGC-27細胞并對細胞力學(xué)特性進行測量。分別對40個聚團生長的HEK 293細胞（20個低密度聚團細胞和20個高密度聚團細胞）和35個聚團生長的HGC-27細胞（15個低密度聚團細胞和20個高密度聚團細胞）進行了測量，統(tǒng)計結(jié)果（圖9）顯示，隨著細胞聚集程度的增加，細胞楊氏模量呈現(xiàn)增加的趨勢。前人的研究結(jié)果顯示細胞間連接會影響細胞的力學(xué)特性，且這種影響與細胞類型（如細胞為癌細胞還是正常細胞，細胞為侵襲性癌細胞還是惰性癌細胞）有關(guān)［43-44］。本文結(jié)果顯示了細胞聚集程度對HGC-27細胞和HEK 293細胞力學(xué)特性的影響，然而對于造成這種影響的內(nèi)在機制還需要借助生化實驗（如利用熒光顯微術(shù)對細胞骨架蛋白變化進行觀測）手段進行分析。此外，本文將光學(xué)圖像自動識別和AFM結(jié)合實現(xiàn)了對聚團生長細胞中單個細胞力學(xué)特性的快速測量，對于單細胞尺度探究群體細胞力學(xué)行為（如癌細胞群體遷移［45］）具有積極意義。需要指出的是，本文僅實現(xiàn)了對聚團生長細胞的細胞中心區(qū)域的定位，下一步利用深度學(xué)習(xí)網(wǎng)絡(luò)模型精準分割出聚團細胞之間的邊界［46］對于研究聚團細胞力學(xué)特性具有重要意義。

Fig.7 Measuring the mechanical properties of living clustered HEK 293 cells by AFM under the guidance of optical image automatic recognition

本文研究結(jié)果為發(fā)展高通量AFM單細胞力學(xué)特性探測方法提供了新的思路。AFM已成為生物樣本力學(xué)特性測量的標準方法［47-49］，但是其依賴人工經(jīng)驗、效率低下的不足使得當(dāng)前的AFM細胞探測實驗十分耗時費力［50-51］，制約了其在生命科學(xué)領(lǐng)域的進一步應(yīng)用。本文通過將光學(xué)圖像自動目標識別算法與AFM壓痕技術(shù)結(jié)合，實現(xiàn)了光學(xué)明場圖像中細胞不同部位和AFM探針位置的自動定位，在此基礎(chǔ)上將AFM探針針尖精準導(dǎo)引至細胞不同部位進行力學(xué)特性測量，避免了人工經(jīng)驗誤差及操作員疲勞對實驗的影響，顯著提升了AFM細胞力學(xué)特性探測實驗的效率。本方法實現(xiàn)了對細胞中心區(qū)域和邊緣區(qū)域的自動識別及AFM力學(xué)特性測量，揭示了細胞中心區(qū)域和邊緣區(qū)域之間力學(xué)特性的差異。然而需要指出的是，所識別的細胞中心區(qū)域和邊緣區(qū)域分別對應(yīng)于細胞哪種結(jié)構(gòu)仍然不清楚，下一步開展活細胞內(nèi)部細胞器結(jié)構(gòu)自動識別（如利用深度學(xué)習(xí)算法從光學(xué)明場圖像中自動識別出細胞核區(qū)域［52］）及在此基礎(chǔ)上的AFM力學(xué)特性探測對于活體狀態(tài)下亞細胞結(jié)構(gòu)力學(xué)特性原位探測具有重要意義。此外，本文的方法目前還僅針對培養(yǎng)皿中生長的單一類型游離態(tài)細胞或聚團生長細胞，下一步發(fā)展針對不同類型細胞共培養(yǎng)條件下的細胞力學(xué)特性精準高效探測方法，將有助于探索力學(xué)特性在細胞與細胞之間相互作用（如癌細胞與其微環(huán)境中其他類型細胞之間的相互作用［53］）過程中的調(diào)控規(guī)律。

Fig.9 Statistical results and Gaussian distribution fitting results of the mechanical properties of clustered cells with different densities measured by AFM under the guidance of optical image automatic recognition

3 結(jié)論

本文提出了結(jié)合光學(xué)圖像自動目標識別和AFM的單個活細胞不同部位力學(xué)特性精準高效測量方法，實現(xiàn)了對單個游離態(tài)細胞和單個聚團生長細胞力學(xué)特性的可靠探測，顯著提升了AFM細胞力學(xué)特性探測實驗效率，對于推動AFM在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的實際應(yīng)用、探究單細胞生理病理活動過程中的力學(xué)調(diào)控機制具有廣泛的積極意義。