強(qiáng)龍征 毛海光 王夢(mèng)婷 齊莉莉 王進(jìn)波

（浙大寧波理工學(xué)院，生物與化學(xué)工程學(xué)院，寧波 315100）

腸道作為消化系統(tǒng)的重要組成部分，承擔(dān)著食物消化、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收和代謝的重要作用。特別是腸上皮，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和藥物的口服生物利用度起關(guān)鍵作用，是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和藥物吸收的重要部位［1］。由于腸道各部分獨(dú)特的生理構(gòu)造，導(dǎo)致在體外模擬腸道內(nèi)環(huán)境從而探究腸道疾病的發(fā)病機(jī)制十分困難。雖然，永生化細(xì)胞、動(dòng)物活體模型等技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于腸道疾病機(jī)制的相關(guān)研究［2］，但是由于無(wú)法有效模擬腸道結(jié)構(gòu)與功能，導(dǎo)致研究結(jié)果有局限。類器官的出現(xiàn)，極大地改變了這一局面。腸道類器官是一種來(lái)源于腸道干細(xì)胞且具備三維（3D）結(jié)構(gòu)的微器官，因其獲得相對(duì)容易，培養(yǎng)周期較短，而且可以進(jìn)行傳代、凍存，遺傳相對(duì)穩(wěn)定，經(jīng)誘導(dǎo)后可以有效地模擬人腸道上皮的多細(xì)胞組成和復(fù)雜功能。同時(shí)，類器官技術(shù)與生物材料學(xué)等多領(lǐng)域的互相結(jié)合，極大推動(dòng)了腸道類器官作為研究腸道疾病的重要體外工具的進(jìn)展。然而將腸道類器官應(yīng)用于腸道疾病的研究尚在起步階段，尤其是在許多疾病的發(fā)病機(jī)制上，仍有大量問(wèn)題亟待解決。本文從腸道類器官的定義入手，介紹了腸道類器官在不同疾病機(jī)制探究及藥物研發(fā)、篩選方面的最新進(jìn)展。

1 腸道類器官的來(lái)源與分類

腸道類器官可以定義為使用來(lái)源于腸道原代組織、胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）構(gòu)建的，具有自我更新和自我組織能力的，并且表現(xiàn)出與原始組織類似的器官功能的微器官［3］。該類器官包含功能性的組織單元，但缺乏間基質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞［4］。目前，成功構(gòu)建的腸道類器官主要是小腸類器官和結(jié)腸類器官（圖1）。2007年，Clevers團(tuán)隊(duì)［5］發(fā)現(xiàn)，亮氨酸重復(fù)序列G蛋白偶聯(lián)受體5陽(yáng)性（leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5，Lgr5+）在隱窩基底柱狀細(xì)胞的特殊表達(dá)，標(biāo)志著多種成人組織和腫瘤中的干細(xì)胞。而且位于隱窩底部的Lgr5+干細(xì)胞可以分裂增殖產(chǎn)生轉(zhuǎn)運(yùn)擴(kuò)增（transit amplifying，TA）細(xì)胞，并由TA細(xì)胞分化生成包括腸細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞、潘氏細(xì)胞、杯狀細(xì)胞等細(xì)胞。2009年，Sato等［6］即通過(guò)單個(gè)Lgr5+干細(xì)胞，首次培養(yǎng)并構(gòu)建出小鼠隱窩-絨毛樣類器官。2011年，Spence團(tuán)隊(duì)［7］通過(guò)新的方式將多能干細(xì)胞（pluripotent stem cells，PSC）誘導(dǎo)培養(yǎng)為腸道類器官。根據(jù)不同研究中干細(xì)胞來(lái)源的不同，可以將類器官分為原代腸組織干細(xì)胞來(lái)源類器官和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源類器官。其中，原代腸組織干細(xì)胞來(lái)源的類器官又可分為成體干細(xì)胞類器官和胚胎干細(xì)胞類器官。

Fig.1 Appearance of intestinal organoids from different intestines sources in mice圖1 不同腸源的小鼠腸道類器官樣貌圖

2 腸道類器官的培養(yǎng)

2.1 傳統(tǒng)培養(yǎng)方式

Lgr5+干細(xì)胞的鑒定及干細(xì)胞生態(tài)位的表征證明了可以在體外擴(kuò)增腸上皮以培育3D腸道類器官。這種類器官的培養(yǎng)模式不僅可以長(zhǎng)時(shí)間維持，而且不會(huì)造成遺傳完整性的破壞，或者使組織生理學(xué)發(fā)生任何本質(zhì)的變化［8］。Clevers團(tuán)隊(duì)［6］首次構(gòu)建腸道類器官時(shí)，將分離的單個(gè)Lgr5+干細(xì)胞或隱窩放入富含層黏連蛋白并起3D骨架支撐作用的基質(zhì)凝膠（matrigel）中培養(yǎng)（圖2），加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加必要的細(xì)胞生長(zhǎng)因子：表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、頭蛋白（Noggin）和R-Spondin1。其中，R-spondin1是Wnt激動(dòng)劑和Lgr5的配體，Noggin是BMP通路抑制劑，二者都具有促進(jìn)隱窩數(shù)量增加的作用［9-10］；EGF主要促進(jìn)小腸細(xì)胞的增殖。由于結(jié)腸類器官缺乏分泌Wnt3A的潘氏（paneth）細(xì)胞，必須加入Wnts用以維持干細(xì)胞自我更新、分化的能力［11］。相較于鼠源類器官，人源類器官更為復(fù)雜。用于培養(yǎng)小鼠來(lái)源類器官的培養(yǎng)基無(wú)法支撐人源類器官的形成，因此，需要在原來(lái)的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上增加胃分泌素（Gastrin）和煙酰胺（Nicotinamide）。其中，煙酰胺對(duì)延長(zhǎng)類器官的存活時(shí)間至關(guān)重要。另外，還需要加入A-83-01和SB202190，促進(jìn)提升類器官的形成。上述生長(zhǎng)因子可以維持腸道類器官的生長(zhǎng)，但是不能促進(jìn)分化。除去Wnt3A、煙酰胺和SB202190可以促使結(jié)腸類器官分化成各類成熟細(xì)胞（圖3）［11］。由于結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）腫瘤的Wnt信號(hào)通路被異常激活，所以構(gòu)建CRC類器官的培養(yǎng)基只需在正常結(jié)腸類器官培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行修改即可。表1總結(jié)了用于構(gòu)建不同類型的人源、鼠源腸道類器官的培養(yǎng)基成分。

Table 1 Components of intestinal organoids culture medium表1 腸道類器官培養(yǎng)基成分

Fig.2 Growth process diagram of mouse small intestinal organoids圖2 小鼠小腸類器官生長(zhǎng)過(guò)程圖

Fig.3 Human intestinal organoid cell type composition［11］圖3 人類腸道類器官細(xì)胞類型組成［11］

2.2 新興培養(yǎng)材料及方法

腸道類器官的成功構(gòu)建并運(yùn)用于疾病機(jī)制探究，依賴于培養(yǎng)基能夠有效重現(xiàn)天然腸道的特征，而培養(yǎng)基則需借助外在支架的支撐。由于傳統(tǒng)基質(zhì)凝膠來(lái)源于Engelbreth-Holm-Sarm小鼠肉瘤，其構(gòu)建的類器官在臨床應(yīng)用中存在安全隱患，而且該基質(zhì)凝膠不能有效地重現(xiàn)天然腸道微環(huán)境［16］，也無(wú)法提供類器官生長(zhǎng)及成熟必需的組織特異性信號(hào)［17］。為解決基質(zhì)凝膠在腸道類器官培養(yǎng)中存在的局限性，近年來(lái)，許多新興生物材料（表2）被應(yīng)用于腸道類器官的體外培養(yǎng)。水凝膠作為一種生物材料，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)和孔隙大小均可人為調(diào)控，經(jīng)過(guò)不同方法的修飾可以實(shí)現(xiàn)類器官的個(gè)性化培養(yǎng)。Gjorevski等［18］和Luo等［19］精密設(shè)計(jì)的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）水凝膠和透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）水凝膠，相對(duì)于傳統(tǒng)基質(zhì)凝膠，二者在生物化學(xué)和生物物理特征上得到了更好的控制。PEG水凝膠有效地再現(xiàn)腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的機(jī)械及化學(xué)性質(zhì)，更加適合患者衍生腫瘤類器官（patientderived organoid，PDO）的培養(yǎng)。HA-明膠水凝膠可以促進(jìn)腸道干細(xì)胞的增殖，更適用于腸道干細(xì)胞（intestinal stem cell，ISC）衍生類器官的形成與發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)［20］，由纖維蛋白和層黏連蛋白為主要成分的水凝膠上天然存在精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）黏附結(jié)構(gòu)域和層黏連蛋白111。纖維蛋白上RGD的濃度足以促進(jìn)類器官生長(zhǎng)。其中，RGD基序是腸干細(xì)胞增殖的必要因子，是促進(jìn)類器官形成和擴(kuò)張的關(guān)鍵因素。此外，該水凝膠還可以廣泛作為基底膜提取物（basement membrane extract，BME）的等效替代物。另有學(xué)者設(shè)計(jì)出一種脫細(xì)胞腸組織衍生的3D水凝膠，額外增加的3種蛋白質(zhì)增強(qiáng)了腸道ECM微環(huán)境，并實(shí)現(xiàn)了類器官的長(zhǎng)期傳代和移植［21］。水凝膠（2 g/L）中層黏連蛋白111、511、腎連蛋白濃度在0.1 g/L、0.01 g/L、0.01 g/L條件下，類器官的培養(yǎng)具有最高形成率。其中，層黏連蛋白有助于隱窩絨毛單元的形成，腎連蛋白通過(guò)特異結(jié)合α8β1整合素促進(jìn)腸隱窩穩(wěn)態(tài)［16］。Gjorevski等［18］指出，只有使用含有基質(zhì)金屬蛋白酶敏感可降解序列和額外ECM成分的較軟PEG水凝膠構(gòu)建腸道類器官時(shí)，才能使干細(xì)胞向類器官方向發(fā)展。平滑肌細(xì)胞特異性表達(dá)的小生境因子——基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）17，通過(guò)直接修飾ECM成分和切割生長(zhǎng)因子來(lái)調(diào)節(jié)其與ECM和細(xì)胞結(jié)合的能力［22］，進(jìn)而介導(dǎo)類器官的生長(zhǎng)。微孔陣列［23］和懸滴技術(shù)［24］運(yùn)用了新的懸浮培養(yǎng)方法，提供了更受控的培養(yǎng)體系，實(shí)現(xiàn)了更加均勻地培養(yǎng)腸道類器官。相比于將類器官浸入凝膠層的培養(yǎng)模式，微孔及懸滴技術(shù)僅將基質(zhì)膠作為培養(yǎng)基的補(bǔ)充，避免了凝膠包埋帶來(lái)的并發(fā)癥。同時(shí)，因基質(zhì)膠的用量極其有限，也大大降低了類器官的構(gòu)建成本。

Table 2 Application of new biomaterials and technical means in intestinal organoid culture表2 新生物材料和技術(shù)手段在腸道類器官培養(yǎng)中的運(yùn)用

3 腸道類器官在常見腸道疾病機(jī)制研究中的應(yīng)用

3.1 炎癥性腸道疾病

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩病（Crohn’s disease，CD），統(tǒng)稱為炎癥性腸道疾?。╥nflammatory bowel disease，IBD），屬于腸道慢性炎癥性疾?。?8］。近年來(lái)的研究表明，炎性腸道疾病的起始和延續(xù)與腸上皮屏障（intestinal epithelial barrier，IEB）功能的損壞、異常免疫應(yīng)答、內(nèi)穩(wěn)態(tài)紊亂和腸道微生物群失調(diào)都有緊密聯(lián)系，進(jìn)一步支持了腸道類器官的研究對(duì)IBD發(fā)病機(jī)制探索的重要性［29-30］。

促炎細(xì)胞因子，如IL-6、IL-1β、IL-17A、IL-17f等的上調(diào)以及緊密連接（tight junction，TJ）錯(cuò)位會(huì)導(dǎo)致上皮屏障完整性的破壞［29，31］。在分子水平上［32］，這些細(xì)胞因子會(huì)增加CLDN-2、MLCK和STAT1磷酸化，降低E鈣黏蛋白和ILDR-1。Cook等［33］用樣本中提取的Tr1細(xì)胞和FOXP3陽(yáng)性的Treg細(xì)胞上清液培養(yǎng)人結(jié)腸類器官，發(fā)現(xiàn)Tr1細(xì)胞和FOXP3陽(yáng)性的Treg細(xì)胞抑制了效應(yīng)T細(xì)胞的增殖和髓系細(xì)胞對(duì)IL-1β和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）的產(chǎn)生。而且Tr1細(xì)胞可以分泌IL-22促進(jìn)人腸上皮細(xì)胞的屏障功能，其細(xì)胞培養(yǎng)上清液促進(jìn)了腸道類器官培養(yǎng)物中產(chǎn)生黏蛋白的杯狀細(xì)胞分化。Patnaude等［34］通過(guò)培養(yǎng)人腸道類器官（圖4），對(duì)極化的T-84細(xì)胞單層細(xì)胞，進(jìn)行丁酸鹽共處理和與免疫細(xì)胞的類器官共培養(yǎng)，監(jiān)測(cè)微生物衍生的代謝物和炎癥環(huán)境對(duì)IL-22反應(yīng)的影響，研究發(fā)現(xiàn)，IL-22促進(jìn)上皮干細(xì)胞的擴(kuò)增與增殖、屏障功能障礙和抗菌肽的產(chǎn)生。Cheng等［35］使用右旋糖酐硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型研究uPAR缺乏的小鼠，發(fā)現(xiàn)通過(guò)藥物抑制uPA-uPAR的相互作用可以保護(hù)上皮屏障免受炎癥的誘導(dǎo)損傷，從而確定uPA-uPAR是腸上皮屏障完整性的關(guān)鍵因子，表明該配體受體對(duì)是預(yù)防腸道屏障破壞、促進(jìn)黏膜愈合的潛在IBD靶點(diǎn)。

Fig.4 Brightfield microscopic images of human colon organoids after 6 d coculture with T-cell supernatants［33］圖4 與T細(xì)胞上清液共培養(yǎng)6 d后人結(jié)腸類器官的亮場(chǎng)顯微鏡圖像［33］

免疫反應(yīng)失調(diào)、腸道黏膜內(nèi)穩(wěn)態(tài)的破壞也是IBD發(fā)病的重要原因。最新研究發(fā)現(xiàn)［36-38］，NF-κB激活、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增加、未折疊蛋白反應(yīng)和TLR5激活都會(huì)導(dǎo)致免疫反應(yīng)的異常。Onozato等［39］用人類iPSC成功培養(yǎng)出具有成熟小腸特征的芽狀類器官，發(fā)現(xiàn)當(dāng)用TNF-α治療時(shí)，該類器官可以復(fù)制黏膜損傷的發(fā)病機(jī)制。Li等［40］從脫乙酰酶（sirtuin 2，SIRT2）基因敲除小鼠和IBD患者中分離腸隱窩培養(yǎng)類器官，通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SIRT2缺失導(dǎo)致Wnt/β連環(huán)蛋白信號(hào)通路的過(guò)度激活，引起腸道上皮細(xì)胞分化失調(diào)，加劇炎癥。由此表明SIRT2對(duì)維持腸道黏膜內(nèi)穩(wěn)態(tài)有獨(dú)特作用。另有中國(guó)學(xué)者的研究［41］發(fā)現(xiàn)，流蘇石斛多糖通過(guò)維護(hù)腸黏膜完整性來(lái)改善DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎。甄爽［42］將海藻酸鈉-類器官微球移植入U(xiǎn)C小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)小鼠的腸炎癥狀得到有效改善，證實(shí)類器官移植對(duì)于治療腸炎有著可觀的效果，并且能顯著降低促炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平。

新的證據(jù)表明，微生物群-宿主的交換作用（cross-talk）調(diào)節(jié)［37，43］腸道免疫活動(dòng)和IBD的易感性，腸道菌群和上皮細(xì)胞相互作用是影響上皮通透性的關(guān)鍵因子，對(duì)于維持腸道屏障完整、防止小分子和細(xì)菌進(jìn)入到宿主體至關(guān)重要。同時(shí)，腸道微生物群還可以作為外部調(diào)節(jié)影響免疫內(nèi)穩(wěn)態(tài)。因此，可以利用腸道類器官模擬體內(nèi)腸道微生態(tài)，促進(jìn)有關(guān)腸道菌群和腸道上皮細(xì)胞互作的研究。Giri等［37］在IBD的背景下通過(guò)體外篩選能夠抑制NF-κB的細(xì)菌。使用基于類器官的體外方法，鑒定了5株梭狀芽孢桿菌，它們?cè)谀c道上皮類器官中可以抑制免疫介導(dǎo)的NF-κB激活。

3.2 結(jié)腸直腸癌

作為世界第三致命的惡性腫瘤疾病和第四大最常見的診斷癌癥［44-45］，結(jié)腸直腸癌的致死率在中國(guó)癌癥死亡率中也高居第三位，而且該癌癥的發(fā)病率及死亡率逐年提高，并趨于年輕化。目前認(rèn)為，大多數(shù)結(jié)直腸癌來(lái)源于癌變的干細(xì)胞［46］?；蚝捅碛^遺傳學(xué)的改變，通過(guò)不斷積累使抑癌基因失活，并激活癌基因，最終產(chǎn)生癌癥干細(xì)胞，癌癥干細(xì)胞是腫瘤形成和維持的關(guān)鍵因素。

Wang等［47］通過(guò)建立患者衍生的腫瘤類器官，并進(jìn)行單細(xì)胞RNA序列分析，發(fā)現(xiàn)PDO在轉(zhuǎn)錄組水平上與體內(nèi)上皮細(xì)胞相似，并且忠實(shí)地保留了疾病特異性基因的表達(dá)，可以對(duì)不同階段的癌癥的發(fā)展因素進(jìn)行針對(duì)性分析，是研究癌癥分子機(jī)制的有力平臺(tái)［47-49］。但是，傳統(tǒng)培養(yǎng)基難以滿足腫瘤類器官對(duì)特定微環(huán)境的需求［25］。有研究發(fā)現(xiàn)，癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）有助于腫瘤的進(jìn)展，將CAFs和CRC-PDO在HA-明膠水凝膠中共同培養(yǎng)的方法（圖5），相較于單獨(dú)構(gòu)建PDO的傳統(tǒng)培養(yǎng)方式，使得CRC-PDO保留了原始患者腫瘤的關(guān)鍵分子特征，并在CAFs的介導(dǎo)下，與基質(zhì)間的交互作用得到重現(xiàn)［19］。Shin等［50］構(gòu)建了PDO和小鼠結(jié)腸炎誘導(dǎo)的腫瘤類器官，與對(duì)照組相比，腫瘤組織中的DKK2表達(dá)增加100倍，證明DKK2是Lgr5+在結(jié)腸癌干細(xì)胞中表達(dá)的必要因子，且從分子機(jī)制上證明了SMAD4、TP53、APC和KRAS基因序列突變顯示APC的敲除使DKK2激活C-Src，降解HNF4α1蛋白，進(jìn)而促進(jìn)Lgr5+的表達(dá)。Naruse等［51］利用小室系統(tǒng)的新培養(yǎng)模式，構(gòu)建CAF-CRC PDO類器官，通過(guò)DNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)包括REG家族和DUOXs等多種基因表達(dá)上調(diào)2倍以上，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞大量增殖，引發(fā)癌癥。另有研究組通過(guò)整合基因組、轉(zhuǎn)錄組和磷酸化蛋白質(zhì)組多組學(xué)的方法，在不同階段、不同生長(zhǎng)狀況條件下對(duì)患者衍生結(jié)腸類器官進(jìn)行特征化。經(jīng)過(guò)RNA序列實(shí)驗(yàn)確定有5 125個(gè)在腫瘤中與正常類器官表達(dá)不同的轉(zhuǎn)錄物，尤其是PTEN途徑［52］。最新研究發(fā)現(xiàn)，有近20%的新確診CRC患者出現(xiàn)結(jié)腸直腸癌肝轉(zhuǎn)移（colorectal cancer liver metastasis，CRLM）的情況，Mo等［53］對(duì)來(lái)自多組學(xué)水平的CRLM-PDO進(jìn)行全面分析，發(fā)現(xiàn)該類器官平臺(tái)可以捕捉患者內(nèi)和患者間的異質(zhì)性并預(yù)測(cè)患者的化療反應(yīng)，顯示了在個(gè)性化醫(yī)療中的潛在應(yīng)用價(jià)值。

Fig.5 Brightfield microscopic images of CRC-PDO in hydrogel derived from different patients［19］圖5 水凝膠中不同患者來(lái)源的CRC-PDO亮場(chǎng)顯微圖像［19］

3.3 乳糜瀉

乳糜瀉（celiac disease，CeD）是一種遺傳因素決定的，由麩質(zhì)等環(huán)境因素誘發(fā)的小腸炎癥性疾?。?4］，患者癥狀通常表現(xiàn)為因絨毛萎縮引起小腸黏膜損失而導(dǎo)致的營(yíng)養(yǎng)吸收不良。研究表明，乳糜瀉的發(fā)病與易感性基因［55］、麩質(zhì)觸發(fā)免疫反應(yīng)［56］都有緊密聯(lián)系。

乳糜瀉作為一種多基因易感性炎癥腸病，位于主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility composites，MHC）上的人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-DQ2和HLA-DQ8基因型的個(gè)體具有CeD遺傳易感傾向［55，57］，其中HLADQ2.5發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)最高［58］。Dieterich等［59］從健康組和CeD患者體內(nèi)分離十二指腸隱窩干細(xì)胞培養(yǎng)類器官，發(fā)現(xiàn)兩組類器官表型及基因表達(dá)的巨大差異，并證明其原因是表觀遺傳修飾，從而解釋了CeD中錯(cuò)亂的隱窩/絨毛軸發(fā)育。雖然有約30%的人群具有HLA-DQ2或-DQ8的遺傳傾向，但實(shí)際上只有極小一部分人會(huì)真正發(fā)生CeD［60］。因此，對(duì)該疾病發(fā)生的其他因素的探究就顯得尤為重要。Freire等［61］成功地構(gòu)建CeD患者的腸道類器官（圖6），與健康對(duì)照組的類器官相比，發(fā)現(xiàn)乳糜瀉發(fā)病與先天免疫反應(yīng)顯著相關(guān)。從機(jī)理上講，麩質(zhì)部分分解產(chǎn)生的降解產(chǎn)物與tTGA形成復(fù)合物，被HLA-DQ2或HLA-DQ8傳遞給免疫細(xì)胞，從而產(chǎn)生抗tTGA及抗AGA抗體，引發(fā)炎癥［62］。另外，γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）及TG2也會(huì)對(duì)腸組織造成破壞，TG2在HLA-DQ2或HLA-DQ8存在時(shí)，會(huì)增強(qiáng)抗麥膠T細(xì)胞的反應(yīng)，而且HLA-DQ8可以促進(jìn)并放大IFN-γ下游通路［55］。Serena等［63］構(gòu)建患者來(lái)源的腸隱窩類器官，并用經(jīng)消化的醇溶蛋白刺激類器官，發(fā)現(xiàn)醇溶蛋白會(huì)引發(fā)腸上皮細(xì)胞釋放大量促炎因子，如INF-γ，加劇CeD發(fā)生。同時(shí)，Serena等還強(qiáng)調(diào)了CeD患者先天免疫機(jī)制的改變，從根本上導(dǎo)致其對(duì)麩質(zhì)耐受性的喪失。

Fig.6 Patient derived duodenal organoids［61］圖6 患者來(lái)源的十二指腸類器官［61］

4 腸道類器官用于藥物研發(fā)與篩選

藥物開發(fā)成本高且耗時(shí)長(zhǎng)，很多情況下新藥的開發(fā)往往難以成功。動(dòng)物模型的缺陷使大部分藥物不能應(yīng)用于人體，這使得選擇適合的藥物開發(fā)模型顯得尤為重要［64］。而藥物能否應(yīng)用于臨床階段，由本身的安全性質(zhì)決定。因而，必須對(duì)研發(fā)的不同藥物進(jìn)行篩選［65］。類器官的出現(xiàn)，為藥物的研發(fā)與篩選提供了一個(gè)全新且可靠的平臺(tái)。腸道上皮存在大量藥物代謝酶和外源加工蛋白，是藥物吸收和代謝的重要部位，對(duì)藥物的口服生物利用度起著至關(guān)重要的作用［2，66］。Xu等［32］利用CD患者衍生的腸類器官（圖7）研究發(fā)現(xiàn)，CS-潑尼松龍可以降低CLDN-2、MLCK和STAT1的表達(dá)，提高E鈣黏蛋白和ILDR-1的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞因子引起的屏障功能破壞具有直接預(yù)防作用?；颊哐苌念惼鞴倏梢灾噩F(xiàn)原始腫瘤的遺傳學(xué)和組織學(xué)特征，并有效體現(xiàn)患者對(duì)藥物的反應(yīng)。Du等［67］利用高密度平板形式進(jìn)行類器官培養(yǎng)，加速了基于類器官研究的藥物研發(fā)，同時(shí)大幅降低了大規(guī)模篩選的成本。由此說(shuō)明，腸道類器官作為藥物研發(fā)與篩選的平臺(tái)具有極高的靈敏性，其在藥物研發(fā)及篩選中的優(yōu)勢(shì)盡顯無(wú)疑。

Fig.7 Representative FITC-D4 penetration or brightfield microscopic images of intestinal organoids after treatment［32］圖7 經(jīng)處理后腸類器官的代表性FITC-D4滲透或亮場(chǎng)顯微圖像［32］

5 結(jié)論與展望

目前，國(guó)內(nèi)外研究主要采用Lgr5+干細(xì)胞和多能干細(xì)胞進(jìn)行腸道類器官的構(gòu)建［68］，結(jié)合生物材料創(chuàng)造新的外基質(zhì)以維持類器官的生長(zhǎng)，并不斷探索基質(zhì)中不同生長(zhǎng)因子的比例及培養(yǎng)時(shí)間，以求最大程度地重現(xiàn)腸道內(nèi)環(huán)境，旨在提供一個(gè)更精確的模型模擬腸道生理結(jié)構(gòu)，檢測(cè)疾病進(jìn)展?fàn)顩r，探究其發(fā)病機(jī)制。雖然腸道類器官本身仍舊存在一些局限，但是相比于傳統(tǒng)體外模型，類器官具有極大的模型優(yōu)勢(shì)與應(yīng)用價(jià)值。在疾病機(jī)制探索方面不斷提供新的見解，逐漸取代動(dòng)物模型作為藥物研發(fā)與篩選的工具。同時(shí)，腸道類器官在宿主-病原體相互作用、組織再生、腫瘤個(gè)性化治療等方面也有廣泛的應(yīng)用。