黃惠威 李麗華 羅林 沈玉棟 雷紅濤 徐振林**

（1）華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642；2）華南師范大學(xué)未來(lái)科技研究院，廣州 510631）

免疫分析方法是指基于抗原抗體特異性結(jié)合建立的方法，主要檢測(cè)與食品安全、人類健康和環(huán)境污染有關(guān)的小分子、大分子和病原體等目標(biāo)物。與常規(guī)理化分析方法相比，免疫分析方法具有靈敏度好、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)單快捷、成本低、安全可靠和便于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)［1-2］，在醫(yī)學(xué)、食品和環(huán)境等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。免疫分析方法與量子點(diǎn)、貴金屬納米顆粒和上轉(zhuǎn)換納米顆粒（upconversion nanoparticles，UCNPs）等信號(hào)增強(qiáng)材料結(jié)合可以顯著降低檢測(cè)限，提高靈敏度。UCNPs是由Bloembergen首次提出的一系列能將低能量的近紅外光轉(zhuǎn)化為高能量的紫外/可見(jiàn)光的發(fā)光納米材料。與有機(jī)染料、量子點(diǎn)、熒光蛋白、金屬?gòu)?fù)合物、半導(dǎo)體和貴金屬納米顆粒等傳統(tǒng)納米材料相比，UCNPs具有反斯托克斯位移寬、無(wú)自體熒光背景、組織穿透能力較強(qiáng)、生物低毒性和對(duì)樣品損傷小等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)而引起廣泛關(guān)注［3-5］。

UCNPs表面易修飾識(shí)別分子，具有高效的傳感性能，常被設(shè)計(jì)為免疫檢測(cè)傳感器。構(gòu)建UCNPs免疫檢測(cè)傳感器需要抗體、適配體、酶和有機(jī)分子等識(shí)別配體［6］?？贵w對(duì)蛋白質(zhì)、細(xì)胞或其他大分子物質(zhì)具有高特異性，通常被修飾在UCNPs表面，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、食品、環(huán)境等免疫檢測(cè)領(lǐng)域。常見(jiàn)的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體，抗原結(jié)合片段、納米抗體和單鏈抗體等基因工程抗體近幾年也被修飾在UCNPs表面，但應(yīng)用相對(duì)較少［7］。基因工程抗體具有高親和力、高表達(dá)量、高穩(wěn)定性以及較低生產(chǎn)成本等優(yōu)點(diǎn)［8］，有望成為下一代抗體識(shí)別配體?；赨CNPs的免疫檢測(cè)傳感器由于成本較低、靈敏度高、特異性強(qiáng)和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)具備巨大潛力［9］，主要的應(yīng)用研究有熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）、內(nèi)濾效應(yīng)（inner filter effect，IFE）、磁分離技術(shù)、上轉(zhuǎn)化連接免疫吸附技術(shù)（upconversion-linked immunosorbent assay，ULISA）和上轉(zhuǎn)換免疫層析技術(shù)。

本文簡(jiǎn)要介紹UCNPs的發(fā)光機(jī)制，闡述UCNPs的合成和表面修飾方法，重點(diǎn)綜述基于UCNPs的免疫檢測(cè)技術(shù)并對(duì)該技術(shù)所面臨的挑戰(zhàn)和前景進(jìn)行總結(jié)和展望。

1 稀土元素?fù)诫s的UCNPs發(fā)光機(jī)制

上轉(zhuǎn)換發(fā)光一般是發(fā)生在有機(jī)或無(wú)機(jī)材料中，通過(guò)不同機(jī)制吸收兩個(gè)或多個(gè)光子并發(fā)射比激發(fā)波長(zhǎng)短的光的反斯托克斯發(fā)光過(guò)程［10］。上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料采用低頻率（如近紅外光）光子激發(fā)，而低頻率光具有組織穿透性強(qiáng)、對(duì)生物組織低損傷和降低背景熒光干擾等優(yōu)勢(shì)，因此上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、食品和環(huán)境檢測(cè)等領(lǐng)域。稀土元素?fù)诫s的UCNPs通常由敏化劑（Yb3+）、激活劑（Er3+、Ho3+、Nd3+和Tm3+等）和無(wú)機(jī)晶體基質(zhì)構(gòu)成［11］，可能存在激發(fā)態(tài)吸收、能量轉(zhuǎn)移上轉(zhuǎn)換、光子雪崩、合作敏化上轉(zhuǎn)換、合作上轉(zhuǎn)換、交叉弛豫、能量遷移上轉(zhuǎn)換和能量級(jí)聯(lián)上轉(zhuǎn)換8種上轉(zhuǎn)換發(fā)光機(jī)制［12］（圖1）。本文將簡(jiǎn)述3種常見(jiàn)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光機(jī)制：激發(fā)態(tài)吸收、能量轉(zhuǎn)移上轉(zhuǎn)換和光子雪崩。激發(fā)態(tài)吸收是UCNPs最主要的發(fā)光機(jī)制，由單個(gè)Ln3+活性離子連續(xù)吸收兩個(gè)低能光子，使激發(fā)態(tài)E2發(fā)生上轉(zhuǎn)換發(fā)光，激發(fā)態(tài)E1的穩(wěn)定性則決定了上轉(zhuǎn)換發(fā)射效率，激發(fā)態(tài)E1越穩(wěn)定上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率越高。除了連續(xù)吸收雙光子模型的激發(fā)態(tài)吸收，連續(xù)離子間的能量轉(zhuǎn)移也會(huì)產(chǎn)生高效的上轉(zhuǎn)換發(fā)光。能量轉(zhuǎn)移上轉(zhuǎn)換發(fā)生在激發(fā)態(tài)E1的敏化劑離子和激活劑離子中。激活劑離子吸收敏化劑離子轉(zhuǎn)移的能量后使敏化劑離子回到基態(tài)，而激活劑離子提升到激發(fā)態(tài)E2，實(shí)現(xiàn)高效的上轉(zhuǎn)換發(fā)光。光子雪崩是由激發(fā)態(tài)吸收與交叉弛豫結(jié)合產(chǎn)生的一個(gè)環(huán)形過(guò)程。低激光功率下，離子2的激發(fā)態(tài)E1顯示低效激發(fā)態(tài)吸收；高激光功率下，高效激發(fā)態(tài)吸收增加了離子2的激發(fā)態(tài)E2群體，因此離子2和離子1之間會(huì)發(fā)生高效的交叉弛豫。之后離子1將能量轉(zhuǎn)移到離子2的E1態(tài)，形成完整循環(huán)。循環(huán)過(guò)程中基態(tài)的單個(gè)離子最終會(huì)生成兩個(gè)離子，兩個(gè)離子躍遷至E1態(tài)，像雪崩一樣以指數(shù)方式產(chǎn)生離子，持續(xù)上轉(zhuǎn)換發(fā)光。稀土元素?fù)诫s的UCNPs可以提高上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率或強(qiáng)度，具有較長(zhǎng)的能級(jí)壽命，因此具有較優(yōu)越的發(fā)光性能。

Fig.1 Simplified energy level diagram of the upconversion luminescence mechanism圖1 上轉(zhuǎn)換發(fā)光機(jī)制簡(jiǎn)化能級(jí)圖

2 UCNPs合成方法

UCNPs的尺寸、形狀、晶體結(jié)構(gòu)和單分散性等因素受合成方法的影響［13］，因此選擇合適的合成方法對(duì)提高上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率，探索其化學(xué)和光學(xué)性能以及在不同領(lǐng)域的潛在應(yīng)用至關(guān)重要［14］。UCNPs的合成方法主要包括共沉淀法［15-17］、熱分解法［18-20］、水熱（溶劑熱）法［21-24］、溶膠-凝膠法［25-27］、微乳法［28］和燃燒法［29-32］等，下面簡(jiǎn)述3種最常見(jiàn)的UCNPs合成方法：共沉淀法、熱分解法和水熱法。3種合成方法的優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比如表1所示，期待研究人員未來(lái)能夠取長(zhǎng)補(bǔ)短，改善技術(shù)短板，促進(jìn)UCNPs合成方法的發(fā)展。

Table 1 Advantages and disadvantages of commonly methods for the preparation of UCNPs表1 合成UCNPs的常用方法的優(yōu)缺點(diǎn)

共沉淀法一般包括混合物形成、成核生長(zhǎng)、沉淀、過(guò)濾和煅燒5個(gè)步驟，是將沉淀劑加入可溶性鹽溶液，溶液中的全部不溶物被析出，再把不溶物進(jìn)行洗滌、干燥和退火等處理得到所需材料［33］。由于共沉淀法具有簡(jiǎn)單、環(huán)保、低成本和高回收率等優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)應(yīng)用中是最有前景的合成方法之一［34-35］。但該方法常因?yàn)槌恋韯┗蚱渌x子局部濃度過(guò)高造成尺寸不均和形貌差異等問(wèn)題，而且高溫煅燒過(guò)程增加了實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)，限制了該方法的廣泛應(yīng)用。因此常添加聚乙烯吡咯、聚乙烯亞胺或乙二胺四乙酸等穩(wěn)定劑使沉淀物發(fā)生配位化合反應(yīng)［36-37］控制UCNPs高效生長(zhǎng)。

熱分解法又稱熱解法，在無(wú)水厭氧環(huán)境添加油酸和十八烯等常用的高沸點(diǎn)有機(jī)溶劑制備稀土有機(jī)化合前體物，進(jìn)而在短時(shí)間內(nèi)合成尺寸和形狀可控，單分散性好且發(fā)光效率高的油溶性UCNPs。但該方法存在反應(yīng)溫度高、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、需無(wú)水厭氧環(huán)境、成本高、風(fēng)險(xiǎn)高、會(huì)產(chǎn)生毒物和污染環(huán)境等缺點(diǎn)，因此期待研究人員未來(lái)改善這些技術(shù)短板，促進(jìn)該方法的更廣泛應(yīng)用［6］。

與可以僅使用高沸點(diǎn)有機(jī)溶劑的熱分解法相比，水熱法是以水溶液為基礎(chǔ)的一種著名合成方法，反應(yīng)溫度較低和對(duì)環(huán)境較友好。水熱法是在水溶液中混合HF、NH4F、NaF、KF和NH4HF2等氟化物、氯化物、硝酸鹽和氧化物等廉價(jià)的前體，密封后轉(zhuǎn)移到高壓滅菌器中加熱到熔點(diǎn)或高于熔點(diǎn)合成UCNPs。水熱法可通過(guò)調(diào)控反應(yīng)時(shí)間、溫度、介質(zhì)pH值和反應(yīng)物濃度等反應(yīng)參數(shù)，控制UCNPs的形狀、大小和晶體結(jié)構(gòu)［38］。但該方法合成的UCNPs尺寸一般較大會(huì)影響靈敏度，且處于密閉環(huán)境，不便觀測(cè)UCNPs晶體的生長(zhǎng)。

3 UCNPs表面修飾方法

UCNPs合成方法不同會(huì)產(chǎn)生不同的表面特性造成表面修飾基團(tuán)和修飾方法不同，修飾基團(tuán)的差異則會(huì)影響修飾功能和表面識(shí)別配體的修飾效率。表面親水性修飾和表面靶向性修飾是UCNPs的兩大基本表面修飾方法［50］。表面親水性修飾對(duì)提高疏水性配體覆蓋的UCNPs偶聯(lián)識(shí)別配體能力，進(jìn)而高特異性結(jié)合目標(biāo)物具有十分重要的意義。本文將詳細(xì)闡述6種常用的表面親水性修飾方法（圖2），分別是配體交換法、配體去除法、配體氧化法、表面硅烷化法、兩親聚合物涂層法、逐層組裝法。

Fig.2 Simplified surface hydrophilic modification method圖2 簡(jiǎn)化的表面親水性修飾方法圖

3.1 配體交換法

UCNPs最常用的合成溶劑油酸［51］和油胺［52］會(huì)使其表面覆蓋一層疏水基團(tuán)，難以分散于水中。配體交換法屬于最常用的修飾方法之一，是將UCNPs表面疏水基團(tuán)替換成親水基團(tuán)，幫助改善親水性。常用的親水性配體有聚丙烯酸［53］、聚乙二醇［54］、聚乙烯吡咯烷酮［55］、聚乙二醇磷酸酯［56］、檸檬酸［57］、巰基癸酸［58］、巰基丙酸［59］、己二酸［60］、3-二巰基丁二酸［61］、聚酰胺胺［62］、葡聚糖［63］、殼聚糖［64］等。配體附帶的功能團(tuán)不僅會(huì)增強(qiáng)UCNPs親水性，改善生物相容性，而且會(huì)極大提高識(shí)別配體的偶聯(lián)率。但是小分子層的覆蓋會(huì)增加顆粒厚度，降低UCNPs的發(fā)光性能，造成免疫檢測(cè)靈敏度的降低。

3.2 配體去除法

與配體交換法相比，配體去除法會(huì)減少粒徑或粒徑增加較少，是一種簡(jiǎn)單、高效、低成本的UCNPs表面修飾方法［65］。為了去除表面疏水性配體，一般使用酸或乙醇進(jìn)行攪拌或超聲。但處理結(jié)束后的UCNPs易聚集，需要通過(guò)含有羥基、羧基、氨基和巰基等基團(tuán)的水溶性新配體進(jìn)行表面修飾。新配體能夠直接附著在表面，能夠很好偶聯(lián)識(shí)別配體，獲得特異性強(qiáng)、高質(zhì)量和水溶性好的UCNPs傳感器［66］，對(duì)UCNPs免疫檢測(cè)技術(shù)具有十分重要的意義。

3.3 配體氧化法

與其他表面修飾方法相比，配體氧化法對(duì)UCNPs的形態(tài)、相位、組成和發(fā)光性能不會(huì)產(chǎn)生明顯影響，能夠直接修飾生物分子。配體氧化法是利用強(qiáng)氧化劑選擇性地將表面疏水性配體的碳碳雙鍵氧化成親水性羧基，成功解決UCNPs疏水性問(wèn)題。Chen等［67］首次使用Lemieux-von Rudloff試劑將表面油酸配體氧化為壬二酸，表面存在的羧基，使UCNPs易于在水中分散且有助于生物分子的修飾，大幅度提高檢測(cè)技術(shù)靈敏度和特異性。但該方法氧化反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、產(chǎn)量低、易于聚集，僅適用未被氧化和表面含有碳碳雙鍵的UCNPs，因此限制了該方法的廣泛使用。

3.4 表面硅烷化法

表面硅烷化法是一種在UCNPs上覆蓋硅殼隔絕水，防止發(fā)射猝滅的表面修飾方法，使UCNPs具有高親水性、高透光性、低毒性、易功能化、良好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn)［68］。St?ber法［69］和反向微乳法［70］是兩種常見(jiàn)的硅烷化方法，兩種方法使用的試劑不同。St?ber法使用硅酸四乙酯、氨和乙醇發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，硅酸四乙酯在水解作用下會(huì)均勻的覆蓋在UCNPs的表面形成二氧化硅層。反向微乳法則是利用硅酸四乙酯、氨、環(huán)己烷和表面活性劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，使二氧化硅均勻生長(zhǎng)在疏水性UCNPs表面。但是二氧化硅包裹的顆粒容易聚集，影響顆粒溶解度和分散性，因此需要修改表面親水基團(tuán)，提高顆粒穩(wěn)定性，進(jìn)一步提高UCNPs-生物分子復(fù)合物偶聯(lián)率。而且二氧化硅在水溶液的穩(wěn)定性較差和增加UCNPs粒徑，從而降低免疫檢測(cè)技術(shù)的靈敏度，因此控制二氧化硅層的厚度從而控制復(fù)合物顆粒的粒徑尺寸。

3.5 兩親聚合物涂層法

與表面硅烷化法相比，兩親聚合物涂層法不僅極大提高了UCNPs的親水性，而且提高了UCNPs在水溶液中的單分散性和穩(wěn)定性［71］。該方法是通過(guò)疏水相互作用使兩親聚合物的疏水端與UCNPs表面的疏水性配體結(jié)合，從而暴露親水端。常見(jiàn)的兩親聚合物有聚己內(nèi)酯-聚乙烯聚乙二醇、聚丙交酯-聚（乙二醇）、6-氨基己酸、聚（甲基丙烯酸-共十八烯）、聚（苯乙烯-順丁烯二酸酐）等［72-74］。但是兩親聚合物一般難以制造和提純，會(huì)增加成本和粒徑，不利于建立免疫檢測(cè)技術(shù)，因此需要科研人員未來(lái)改善該方法劣勢(shì)，促進(jìn)基于UCNPs的免疫檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步。

3.6 逐層組裝法

逐層組裝法是指不同電荷的聚合物分子間會(huì)相互吸引，然后自組裝到UCNPs表面，具有操作簡(jiǎn)單、尺寸和形狀可控等優(yōu)點(diǎn)。但一些聚合電解質(zhì)濃度會(huì)影響多層聚合物的形成和增加UCNPs厚度，例如依靠靜電吸附作用力形成的逐層自組裝顆粒在復(fù)雜樣本中可能出現(xiàn)分子脫附造成修飾結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，因此與其他方法相比，逐層組裝法應(yīng)用較少。

4 基于UCNPs的免疫檢測(cè)技術(shù)

通過(guò)摻雜不同的稀土元素可以調(diào)整UCNPs的發(fā)光性能。但是UCNPs需要實(shí)現(xiàn)高效的傳感性能，表面需要進(jìn)行生物功能性修飾，連接識(shí)別配體。常用的UCNPs識(shí)別配體有抗體、適配體、有機(jī)分子、分子印跡聚合物、酶、共價(jià)有機(jī)框架和金屬離子等。抗體一般是指受到抗原刺激后由免疫細(xì)胞產(chǎn)生的保護(hù)性蛋白，可對(duì)某一特定對(duì)象表現(xiàn)出高特異性，主要有多克隆抗體、單克隆抗體和基因工程抗體。單克隆抗體具有高純度、高特異性、高效力等優(yōu)點(diǎn)，是最常用的UCNPs傳感器識(shí)別分子［75］。近幾年基因工程抗體修飾在UCNPs表面的方法也在發(fā)展，有望成為下一代廣泛應(yīng)用的抗體識(shí)別配體。本文基于UCNPs的5種典型免疫檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了總結(jié)（圖3），分別是FRET、磁分離技術(shù)、ULISA、IFE和上轉(zhuǎn)換免疫層析技術(shù)。

Fig.3 Strategies for the construction of upconversion based sensors圖3 基于上轉(zhuǎn)換傳感器的構(gòu)造策略

4.1 基于UCNPs的FRET

上轉(zhuǎn)換免疫檢測(cè)傳感器的研究大部分是基于FRET原理。FRET是一種均相分析檢測(cè)技術(shù)［76］，指通過(guò)靜電偶極-偶極相互作用將供體熒光體的能量轉(zhuǎn)移到受體熒光體的非輻射性能量轉(zhuǎn)移過(guò)程［77］。一般UCNPs作為能量供體，熒光染料、碳納米材料、貴金屬納米材料和半導(dǎo)體納米材料等作為能量受體。只有供體與受體距離足夠近且供體發(fā)射光譜與受體吸收光譜重疊時(shí)才可以發(fā)生FRET［78］。Li等［79］首次基于特制的UCNPs和金納米顆粒之間的FRET效應(yīng)，開(kāi)發(fā)了一種超快速、靈敏、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）刺突蛋白的定性定量方法，檢測(cè)限（LOD）低至1.06 pg/L，線性檢測(cè)范圍為2~32 pg/L。所建立方法優(yōu)于以往報(bào)道的即時(shí)生物傳感器，為未來(lái)的現(xiàn)場(chǎng)快速病毒篩查和即時(shí)診斷鋪平了新的道路。更關(guān)鍵是這種設(shè)計(jì)可以擴(kuò)展到其他抗原、抗體和蛋白質(zhì)的檢測(cè)（表2）。目前也有一些研究基于抗原結(jié)合片段、納米抗體和單鏈抗體等基因工程抗體建立FRET，該技術(shù)的進(jìn)步將為各種生物分析應(yīng)用開(kāi)辟新途徑，包括檢測(cè)蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物、激素、濫用藥物、食物和環(huán)境毒素等［80］?；贔RET的一步免疫分析適用于非專業(yè)終端用戶，為開(kāi)發(fā)用戶友好、可靠的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)奠定良好基礎(chǔ)。但傳統(tǒng)的FRET方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，因此Shan等［81］設(shè)計(jì)了一種基于均質(zhì)FRET的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，它不僅具有相當(dāng)簡(jiǎn)單的樣品預(yù)處理操作和簡(jiǎn)單的一步孵化操作，而且具有靈敏度十分高和高通量的樣品檢測(cè)能力，檢測(cè)速度快，可在35 min內(nèi)檢測(cè)出96孔板中的豬流行性腹瀉病毒，檢測(cè)限低至TCID50（組織培養(yǎng)感染劑量中位數(shù)）104/L，比膠體金試紙免疫檢測(cè)技術(shù)的靈敏度高10倍。通過(guò)驗(yàn)證臨床樣品，也證明該方法準(zhǔn)確性高、重復(fù)性高和特異性良好。該方法可很好用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，為豬流行性腹瀉病毒的多樣本現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供了一種有前途的方法，在豬業(yè)領(lǐng)域具有巨大潛力。雖然基于FRET的酶聯(lián)免疫吸附方法可以很好用于快速篩選和高通量檢測(cè)，但由于該方法背景信號(hào)相對(duì)較高導(dǎo)致靈敏度有限，為了獲得更高的靈敏度，未來(lái)可將單分子技術(shù)與FRET免疫分析法相結(jié)合，特別是可現(xiàn)場(chǎng)實(shí)施的技術(shù)，從而大幅度減少背景值，顯著提高靈敏度。

Table 2 Summary of the application of the FRET immunoassay sensor based on UCNPs表2 基于UCNPs的FRET免疫檢測(cè)傳感器的應(yīng)用總結(jié)

4.2 基于UCNPs的IFE

IFE與FRET原理類似，供體激發(fā)和/或發(fā)射帶和受體吸收帶重疊時(shí)，可以猝滅熒光，但要求較低，供體受體間距離大于10 nm也會(huì)發(fā)生IFE，因此將熒光傳感器探針功能化的復(fù)雜性降至最低。此外，因?yàn)闆](méi)有新的化合物形成，在IFE過(guò)程中UCNPs的壽命不會(huì)改變［90］。Si等［91］基于抗體修飾的UCNPs和抗原修飾的金納米顆粒間的IFE，建立了一種快速檢測(cè)環(huán)境和食品樣品中吡蟲(chóng)啉殘留的靈敏均質(zhì)免疫檢測(cè)方法。LOD低至0.79 μg/L，恢復(fù)50%飽和信號(hào)的濃度（SC50）為18.7 μg/L，SC10~SC90的線性檢測(cè)范圍為1.39~335.81 μg/L。Chen等［92］采用同樣的方法快速檢測(cè)吡蟲(chóng)啉，SC50為4.3 μg/L，SC10~SC90的線性檢測(cè)范圍為0.47~21.37 μg/L，提高了靈敏度和改善了線性范圍。上述高靈敏度的IFE方法是由傳感器吸光度的變化轉(zhuǎn)換為熒光強(qiáng)度的變化實(shí)現(xiàn)的，因此通過(guò)IFE對(duì)熒光變化的巧妙響應(yīng)可應(yīng)用于檢測(cè)食品污染物，具有廣闊的應(yīng)用前景。IFE的出現(xiàn)大大拓寬了基于配體免疫檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用范圍，而且要求相對(duì)較低。然而，IFE一般需要發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，有機(jī)分子作為主要的識(shí)別配體，但這些分子大部分有毒性，所以迫切需要尋找更安全無(wú)毒或低毒的識(shí)別配體例如模擬表位肽檢測(cè)食品和環(huán)境中的污染物。

4.3 基于UCNPs的磁分離技術(shù)

與FRET和IFE相比，磁分離沒(méi)有改變光學(xué)特性，而是在外部磁場(chǎng)下實(shí)現(xiàn)UCNPs的富集或分散。磁分離免疫檢測(cè)技術(shù)一般是以UCNPs和磁性納米顆粒作為探針，當(dāng)無(wú)目標(biāo)分子時(shí)，UCNPs和磁性納米顆粒通過(guò)識(shí)別配體偶聯(lián)在一起，形成磁性納米顆粒-識(shí)別配體-UCNPs夾心復(fù)合物，UCNPs被磁性納米顆粒富集，導(dǎo)致溶液中的熒光減少；目標(biāo)分子存在時(shí)會(huì)導(dǎo)致兩種納米顆粒分離，因此UCNPs沒(méi)有被磁性納米顆粒富集而被回收。磁性納米顆粒作為新一代的吸附劑，具有磁性、低毒和生物相容性良好等優(yōu)點(diǎn)［93］，成為理想的生物分離和純化材料［94］，被廣泛應(yīng)用于食品檢測(cè)［95-96］。磁分離技術(shù)與其他技術(shù)相比具有簡(jiǎn)單、高效、快速和靈敏等優(yōu)點(diǎn)，成為快速檢測(cè)食品和環(huán)境污染物的絕佳策略?；诖判约{米顆粒的良好磁性，它在提高上轉(zhuǎn)換傳感器的特異性方面具有很大的潛力。Zhao等［97］在UCNPs上修飾擬除蟲(chóng)菊酯抗體，建立了一種檢測(cè)擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥殘留的上轉(zhuǎn)換磁分離免疫分析方法，LOD均小于0.01 μg/L，回收率為83.4%~97.8%，表明該方法靈敏度高。上轉(zhuǎn)換磁分離免疫熒光檢測(cè)方法的建立，豐富了快速檢測(cè)市場(chǎng)的技術(shù)手段，為擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥殘留或其他農(nóng)藥殘留的檢測(cè)提供了理論支持。與酶聯(lián)免疫吸附法相比，該方法準(zhǔn)確度更高，靈敏度更好。與大型儀器檢測(cè)法相比，該方法具有快速、方便、成本低的優(yōu)點(diǎn)。但是磁分離技術(shù)需要高特異性的識(shí)別配體抗體，目前食品和環(huán)境污染物相應(yīng)抗體較少，因此在未來(lái)研究中可開(kāi)發(fā)更多目標(biāo)物的抗體，也可通過(guò)研究目標(biāo)物的特性開(kāi)發(fā)出其他特異性好的識(shí)別配體。

4.4 基于UCNPs的ULISA

ULISA與酶聯(lián)免疫吸附方法測(cè)定步驟相似，一抗固定在96孔板，二抗修飾UCNPs，目標(biāo)物與一抗和二抗結(jié)合，在980 nm激光激發(fā)下產(chǎn)生的熒光信號(hào)反應(yīng)了目標(biāo)物濃度。但與傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附方法相比，ULISA靈敏度更好和檢測(cè)范圍更寬。這種利用UCNPs作為信號(hào)傳感器的方法未來(lái)可能為探索酶聯(lián)免疫吸附方法的臨床應(yīng)用開(kāi)辟新道路。Hlaacek等［98］克服目前染色劑和熒光標(biāo)記方法的缺點(diǎn)，使用鏈親和素提高靈敏度，利用UCNPs建立模擬檢測(cè)和數(shù)字檢測(cè)兩種綜合ULISA法對(duì)前列腺特異性抗原進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)字檢測(cè)的LOD低至0.8 fmol/L，比傳統(tǒng)熒光標(biāo)簽的信噪比高50倍。Makhneva等［99］采用鏈親和素修飾的UCNPs建立ULISA法檢測(cè)前列腺特異性抗原，LOD低至0.46 ng/L，結(jié)果表明UCNPs的使用可顯著提高異質(zhì)免疫分析靈敏度。Mickert等［100］采用鏈親和素修飾的UCNPs建立模擬檢測(cè)和數(shù)字檢測(cè)兩種綜合ULISA法檢測(cè)前列腺特異性抗原，數(shù)字檢測(cè)比相應(yīng)的模擬檢測(cè)靈敏16倍，LOD低至23 pg/L。低濃度目標(biāo)物采用數(shù)字檢測(cè)會(huì)顯著提高靈敏度，但該方法會(huì)受到泊松噪聲影響，對(duì)高濃度目標(biāo)物則需要進(jìn)行模擬檢測(cè)。與酶聯(lián)免疫吸附方法相比，ULISA方法無(wú)需酶催化，縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了靈敏度。此外，可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)模擬表位肽或基因工程抗體修飾UCNPs，減少毒性和提高方法靈敏度，促進(jìn)ULISA方法的發(fā)展。

4.5 上轉(zhuǎn)換免疫層析技術(shù)

上轉(zhuǎn)換免疫層析技術(shù)廣泛應(yīng)用于檢測(cè)感染性細(xì)菌、病原體、病毒和食品中殘留物以及腫瘤標(biāo)志物等（表3）。上轉(zhuǎn)換免疫層析技術(shù)一般是利用抗體修飾的UCNPs作為探針用于免疫層析的即時(shí)檢測(cè)技術(shù)，具有簡(jiǎn)單、快速、低成本和易操作等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)［101］。相比傳統(tǒng)的膠體金免疫層析技術(shù)，UCNPs具有光穩(wěn)定性好和信噪比高的優(yōu)勢(shì)，使上轉(zhuǎn)換免疫層析技術(shù)的靈敏度大幅度提高。但該方法無(wú)法通過(guò)顏色判讀結(jié)果，需要外圍設(shè)備分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這些設(shè)備一般昂貴且笨重。Gong等［101］開(kāi)發(fā)了一個(gè)小型化、便攜式的定制設(shè)計(jì)的智能手機(jī)軟件分析儀（UCNP-LFA分析儀）成功用于檢測(cè)5種目標(biāo)物（核酸、蛋白質(zhì)、小分子、重金屬離子和細(xì)菌），UCNP-LFAs平臺(tái)的精度和準(zhǔn)確度與膠體金標(biāo)準(zhǔn)方法相當(dāng)，相關(guān)系數(shù)大于0.992，與臨床臨界值相比LOD降低至原來(lái)的1/5~1/10。UCNPs發(fā)光效率低、親水性差和抗體連接效率低是應(yīng)用于側(cè)流免疫層析技術(shù)需要克服的挑戰(zhàn)。Huang等［102］通過(guò)結(jié)合配體交換法和超分子自組裝策略檢測(cè)大腸桿菌和達(dá)諾沙星，成功解決上述問(wèn)題，靈敏度提高40倍，檢測(cè)范圍擴(kuò)大一個(gè)數(shù)量級(jí)，并將成本降低20%~40%。上轉(zhuǎn)換免疫層析技術(shù)還廣泛應(yīng)用于同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)或多個(gè)目標(biāo)物，形成了多指標(biāo)上轉(zhuǎn)免疫層析技術(shù)，用于檢測(cè)樣品的各種分析物，具有很大的應(yīng)用前景。

Table 3 Summary of the application of UCNPs-based upconversion immunochromatography表3 基于UCNPs的上轉(zhuǎn)換免疫層析技術(shù)的應(yīng)用總結(jié)

5 總結(jié)與展望

本文簡(jiǎn)要介紹了UCNPs的發(fā)光機(jī)制，并按照傳感器的構(gòu)造順序材料合成和改性進(jìn)行闡述，對(duì)基于UCNPs的免疫檢測(cè)技術(shù)及其原理進(jìn)行詳細(xì)回顧。雖然基于識(shí)別配體抗體的UCNPs檢測(cè)技術(shù)提供了生物毒性低、靈敏度高和特異性強(qiáng)的免疫檢測(cè)方法，但是在實(shí)際應(yīng)用中還應(yīng)解決以下問(wèn)題。a. 與傳統(tǒng)熒光納米材料相比，UCNPs在靈敏度和特異性方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，但還需進(jìn)一步開(kāi)展對(duì)它們的研究，尤其需要解決水溶性和分散度問(wèn)題。可以合成粒徑較小的UCNPs與親水性配體結(jié)合或者去除疏水性表面配體，提高UCNPs的水溶性和分散度，促進(jìn)UCNPs的生物功能化。b. 基于UCNPs的免疫檢測(cè)模式普遍單一或者不能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品?？梢蚤_(kāi)發(fā)多元檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)和多模式同時(shí)檢測(cè)平臺(tái)，盡可能開(kāi)發(fā)新型便攜化、微型化、自動(dòng)化的定性定量檢測(cè)儀器，應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)快速高通量檢測(cè)。c. 與成熟的免疫檢測(cè)技術(shù)工業(yè)應(yīng)用相比，UCNPs免疫檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用還處在雛形或?qū)嶒?yàn)室階段，與實(shí)際的社會(huì)應(yīng)用存在一定差距，尚未取得顯著的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益，許多技術(shù)瓶頸亟待研究人員解決，例如UCNPs的上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率難維持、合成方式復(fù)雜、表面修飾程度和功能化的難控制等問(wèn)題?？梢酝ㄟ^(guò)優(yōu)化稀土摻雜物濃度和核殼結(jié)構(gòu)提高上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率并延長(zhǎng)高效的上轉(zhuǎn)換發(fā)光時(shí)間，采用一步法簡(jiǎn)化合成程序，添加合適的穩(wěn)定劑控制表面修飾程度。但本文所述成果已初步證明，UCNPs獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)及其表面修飾機(jī)制的靈活性，均為UCNPs作為納米探針在免疫檢測(cè)方面的應(yīng)用開(kāi)辟了廣闊前景，值得廣大研究者們?nèi)ヅν诰蛱剿鳌?/p>