王云鋒 莊婉茹 馬憲彬 聶偉東 謝海燕

（北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081）

細(xì)菌外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMVs）是一種由細(xì)菌分泌的脂質(zhì)納米囊泡。不同于最初認(rèn)為的細(xì)菌裂解產(chǎn)物，OMVs現(xiàn)今更多被看作一種獨(dú)特的細(xì)菌分泌物，細(xì)菌可通過分泌OMVs的方式維持其外膜穩(wěn)定性或排出有害物質(zhì)。不同細(xì)菌間能對OMVs進(jìn)行識(shí)別與招募以獲取遺傳信息和營養(yǎng)物質(zhì)［1-2］，此外，細(xì)菌通過分泌OMVs甚至能調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)以逃逸免疫監(jiān)測［3-6］。作為細(xì)菌分泌產(chǎn)物，OMVs表面富含細(xì)菌抗原，這使其可作為疫苗用于防治細(xì)菌感染［7-8］。除了激起針對細(xì)菌的適應(yīng)性免疫反應(yīng)外，OMVs還可激活廣泛的先天性免疫或作為佐劑增強(qiáng)機(jī)體對其他抗原的免疫反應(yīng)，特別是促進(jìn)抗腫瘤免疫反應(yīng)的發(fā)生。

癌癥是現(xiàn)今死亡率最高的疾病之一，攻克癌癥將極大促進(jìn)人類平均壽命的延長。由于腫瘤異質(zhì)性高且易于復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，其治療問題一直是醫(yī)療領(lǐng)域的難點(diǎn)。目前臨床上已應(yīng)用多種手段治療腫瘤，如手術(shù)切除、放射治療、化學(xué)治療、光動(dòng)力治療（photodynamic therapy，PDT）與免疫治療等，它們各有優(yōu)劣，適用患者類型也各不相同。盡管每年全球都會(huì)進(jìn)行大量的基礎(chǔ)研究、藥物開發(fā)與臨床試驗(yàn)以期攻克腫瘤治療，然而抗腫瘤藥物對非腫瘤組織的毒性始終是一個(gè)難以回避的問題。為此，開發(fā)具有腫瘤靶向性質(zhì)的納米體系用于遞送抗腫瘤藥物具有很高的研究價(jià)值。通過納米體系對腫瘤組織的主動(dòng)或被動(dòng)靶向蓄積使藥物富集于腫瘤組織，提高了藥物的利用率并降低了藥物副作用。而細(xì)菌衍生的OMVs不僅具有一定腫瘤靶向性，可用于抗腫瘤藥物的遞送，其豐富的病原體相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）還可增強(qiáng)免疫反應(yīng)以協(xié)同治療腫瘤。

1 OMVs的生物發(fā)生機(jī)理

與革蘭氏陽性菌不同，革蘭氏陰性菌有兩層結(jié)構(gòu)高度異質(zhì)的膜：細(xì)菌質(zhì)膜與細(xì)菌外膜。兩層膜間為細(xì)菌周質(zhì)空間，細(xì)菌細(xì)胞壁位于其中。位于細(xì)胞壁外層的外膜是革蘭氏陰性菌的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)。與典型的生物膜不同，雖然同樣是脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，但細(xì)菌外膜具有極大不對稱性：其內(nèi)葉主要由磷脂組成，而外葉則含有大量的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）。此外，外膜中含有兩大類蛋白質(zhì)：跨膜的桶狀外膜蛋白（outer membrane proteins，OMP）與氨基端嵌入膜內(nèi)的脂蛋白。細(xì)菌外膜的存在不僅為革蘭氏陰性菌提供了一個(gè)化學(xué)屏障，還為細(xì)菌提供了一部分機(jī)械支撐。革蘭氏陰性菌對洗滌劑和其他疏水毒素的抵抗力主要得益于外膜上LPS分子間的強(qiáng)橫向作用力及其飽和?；?，它們在維持細(xì)菌外膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的同時(shí)極大阻礙了疏水分子的通過［9］。同時(shí)，外膜中部分脂蛋白通過與肽聚糖層的共價(jià)結(jié)合將細(xì)菌外膜與細(xì)胞壁連接，例如大腸桿菌外膜中最豐富的脂蛋白布勞恩脂蛋白（Braun’s lipoprotein，Lpp）的羧基端可與肽聚糖共價(jià)結(jié)合，這使得細(xì)菌外膜能承擔(dān)一部分機(jī)械力以彌補(bǔ)革蘭氏陰性菌肽聚糖層較薄的缺點(diǎn)［10-11］。

作為直徑在20~250 nm之間的天然脂質(zhì)納米囊泡，OMVs始于細(xì)菌外膜凸起，因此其膜成分和細(xì)菌外膜類似，主要由磷脂、LPS和OMP組成，而其囊腔則富含細(xì)菌周質(zhì)與胞質(zhì)成分，如肽聚糖、蛋白質(zhì)、核酸等。OMVs最早發(fā)現(xiàn)于1966年，研究人員觀察到在沒有發(fā)生細(xì)胞裂解的情況下，賴氨酸依賴的突變大腸桿菌（E. coli）12408產(chǎn)生了膜包被的“小球”［12］。次年，Chatterjee等［13］通過電鏡觀察到霍亂弧菌（Vibrio cholerae）的外膜出現(xiàn)不同程度的膨大現(xiàn)象，隨著膨大明顯隆起，其頸部被掐斷形成小泡釋放。1976年，Hoekstra等［14］發(fā)現(xiàn)E. coliJC411產(chǎn)生的囊泡含有脂質(zhì)與蛋白質(zhì)；1982年，Katsui等［15］發(fā)現(xiàn)E. coliW3110在55℃加熱下細(xì)胞表面釋放含有脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和LPS的膜囊泡，成分類似于細(xì)菌外膜。近年來，隨著對OMVs的研究日益增多，雖尚不明確OMVs產(chǎn)生的分子機(jī)制，但一些已發(fā)現(xiàn)的遺傳和生化證據(jù)可以幫助人們探索這一過程。

1.1 蛋白質(zhì)與OMVs的產(chǎn)生

作為OMVs的重要組成成分，蛋白質(zhì)的缺乏或功能異?？赡艽龠M(jìn)OMVs的分泌。在一種OMVs產(chǎn)生模型中，脂蛋白連接的缺失導(dǎo)致細(xì)菌外膜與肽聚糖層局部分離，分離區(qū)域的外膜持續(xù)生長致使外膜向外凸起并最終以O(shè)MVs的形式釋放［16］。這種模型的提出基于早期的觀察結(jié)果：外膜囊泡中脂蛋白較少且大部分不與肽聚糖共價(jià)結(jié)合［14，17］。1976年，Weigand等［18］揭示了OMVs生物發(fā)生的第一個(gè)分子證據(jù)：缺乏Lpp的LkyD缺陷型鼠傷寒沙門氏菌外膜鼓起大囊泡，這表明連接肽聚糖層與外膜的脂蛋白缺乏直接導(dǎo)致細(xì)菌外膜凸起（圖1a）。其后在1978年Suzuki等［19］在大腸桿菌lpo突變體上也觀察到了類似現(xiàn)象。與Lpp類似，細(xì)菌外膜蛋白OmpA也能連接肽聚糖層與外膜，因此多種OmpA突變型細(xì)菌表現(xiàn)出OMVs產(chǎn)量提升［20-24］。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌外膜結(jié)構(gòu)重要的基因突變均會(huì)導(dǎo)致OMVs產(chǎn)量的提升，這些基因有的與外膜組成有關(guān)，有的與肽聚糖的生長交聯(lián)有關(guān)，有的則負(fù)責(zé)在外膜與肽聚糖間形成橋梁［25］。這些證據(jù)都證明了細(xì)菌外膜與肽聚糖層的分離有利于細(xì)菌OMVs的釋放。

Fig.1 OMVs biogenesis model圖1 OMVs生物發(fā)生模型

1.2 LPS與OMVs的產(chǎn)生

細(xì)菌LPS通常由疏水的類脂A、核心寡糖與O抗原組成［26］。作為細(xì)菌外膜主要成分之一，LPS不僅在細(xì)菌外膜屏障功能中發(fā)揮核心作用［27-28］，還是細(xì)菌表面最豐富的抗原。但由于帶負(fù)電的LPS間具有靜電排斥力，因此外膜中負(fù)電LPS的含量上升也會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌外膜的凸起最終致使OMVs的釋放（圖1b）［29-31］，類似的，基因突變導(dǎo)致的LPS電負(fù)性增強(qiáng)也會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌外膜膜曲率失衡，隨后致使外膜凸出并產(chǎn)生OMVs［32］。同時(shí)，由于OMVs中LPS組成的不同會(huì)導(dǎo)致與LPS相互作用的特定蛋白質(zhì)發(fā)生含量變化，因此LPS電負(fù)性的改變不僅會(huì)影響OMVs的產(chǎn)生還會(huì)影響OMVs中蛋白質(zhì)的包裝，已有研究表明，O抗原和核心寡糖的變化均會(huì)對OMVs產(chǎn)生影響［25，31］。

1.3 磷脂與OMVs的產(chǎn)生

同為細(xì)菌OMVs主要成分磷脂也會(huì)影響OMVs分泌。大腸桿菌外膜中磷脂含量從高到低依次為磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油和心磷脂［33］，而大腸桿菌OMVs具有與外膜相似的磷脂組成［34］。革蘭氏陰性菌的磷脂在質(zhì)膜與外膜內(nèi)葉間進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，其中磷脂從外膜內(nèi)葉到質(zhì)膜的易位被稱為逆行轉(zhuǎn)運(yùn)［35］。在逆行運(yùn)輸中，脂質(zhì)不對稱維持系統(tǒng)（maintenance of lipid asymmetry，Mla）將外膜外葉中的錯(cuò)位磷脂運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)膜以維持外膜不對稱性。其中，MlaA脂蛋白與外膜OmpC蛋白的相互作用將錯(cuò)位磷脂轉(zhuǎn)給MlaC蛋白，然后遞送到位于質(zhì)膜中的MlaFEDB復(fù)合物，并最終整合到質(zhì)膜上［36-37］。因此，Mla途徑蛋白質(zhì)表達(dá)減少或缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌外膜外葉產(chǎn)生磷脂積累，由此帶來的外葉不對稱擴(kuò)張會(huì)引發(fā)細(xì)菌外膜向外凸起，進(jìn)一步的磷脂富集導(dǎo)致細(xì)菌外膜萌芽，最終夾斷形成OMVs（圖2）。在這種OMV產(chǎn)生模型中，細(xì)菌通過釋放OMVs維持其外膜不對稱性，進(jìn)而維持外膜屏障功能［38-40］。

Fig.2 The wrong accumulation of phospholipids in bacterial outer membrane leads to the production of OMVs［39］圖2 細(xì)菌外膜中磷脂錯(cuò)誤累積導(dǎo)致OMVs產(chǎn)生［39］

因此，OMVs的生物發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過程，對這一過程的機(jī)制解析有利于對細(xì)菌分泌OMVs這一行為進(jìn)行調(diào)控，包括提高產(chǎn)量、調(diào)整組分構(gòu)成甚至控制OMVs粒徑大小，這將極大推動(dòng)OMVs的實(shí)際應(yīng)用。

2 OMVs對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用

作為一種獨(dú)特的細(xì)菌分泌物，OMVs在體液中的出現(xiàn)往往意味著細(xì)菌感染的發(fā)生，因此宿主模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR）識(shí)別OMVs上PAMPs后會(huì)激發(fā)一系列下游免疫應(yīng)答，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子白介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-8和抗菌肽的產(chǎn)生，最終清除入侵機(jī)體的病原微生物［41-44］。本節(jié)通過OMVs對不同免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)來綜述OMVs對機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。

2.1 中性粒細(xì)胞

作為先天免疫系統(tǒng)的重要組成成分，中性粒細(xì)胞是抵御細(xì)菌感染的第一道防線，其能夠迅速識(shí)別、攻擊并消除大多數(shù)病原微生物［45-47］。其中，已有研究表明中性粒細(xì)胞在OMVs引發(fā)的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。在OMVs的刺激下，血管內(nèi)皮細(xì)胞能以Toll樣受體4（Toll-like receptors，TLR4）和NF-κB依賴的方式釋放IL-8/CXCL1招募中性粒細(xì)胞［48］，中性粒細(xì)胞受OMVs刺激釋放促炎細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-1β）與趨化因子導(dǎo)致炎癥的發(fā)生（圖3a）［49］。但值得注意的是，有研究表明低濃度LPS會(huì)誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞在上調(diào)其趨化因子受體CXCR4表達(dá)的同時(shí)釋放中性粒細(xì)胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，NET），這可能與過敏性哮喘的發(fā)生有關(guān)［50］；而由細(xì)菌外膜衍生的OMVs富含LPS，因此極大可能和LPS有著類似的效果。此外，部分OMVs可以抑制中性粒細(xì)胞的功能以幫助其親本細(xì)菌逃避中性粒細(xì)胞的攻擊［5］。例如，泌尿致病型大腸桿菌產(chǎn)生的OMVs可以將具有生物活性的1型細(xì)胞毒性壞死因子（cytotoxic necrotizing factor 1，CNF1）遞送到中性粒細(xì)胞內(nèi)以抑制其趨化性和吞噬功能，最終降低中性粒細(xì)胞的抗菌活性。總之，已有研究表明，攜帶大量PAMPs的OMVs可以招募并激活中性粒細(xì)胞從而誘導(dǎo)抗菌免疫的發(fā)生，但OMVs攜帶的毒力因子也可能會(huì)抑制中性粒細(xì)胞的免疫活性以使親本細(xì)菌逃逸免疫監(jiān)測。

Fig.3 Regulatory effects of OMVs on immune cells圖3 OMVs對免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用

2.2 巨噬細(xì)胞

與中性粒細(xì)胞類似，OMVs可以通過激活巨噬細(xì)胞受體來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。一方面OMVs可以激活巨噬細(xì)胞表面的TLR2以誘導(dǎo)有效的促炎反應(yīng)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌IL-6、IL-8、TNF-α和IL-1β（圖3b）［42-43，51］。另一方面，被巨噬細(xì)胞吞噬后，OMVs可以激活巨噬細(xì)胞胞內(nèi)PRR受體引發(fā)炎性反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，不同來源的細(xì)菌OMVs均可以激活巨噬細(xì)胞中的炎性小體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)炎癥因子的釋放［52-54］。其中，牙周病原體OMVs可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的NF-κB活化并刺激促炎細(xì)胞因子反應(yīng)［53］，而鞭毛細(xì)菌OMVs則可以將細(xì)菌鞭毛蛋白遞送到巨噬細(xì)胞胞質(zhì)中觸發(fā)NLRC4介導(dǎo)的典型炎癥小體活化［54］。通過將LPS遞送至巨噬細(xì)胞胞質(zhì)，OMVs還可引發(fā)小鼠胱天蛋白酶（Caspase）-11介導(dǎo)的非典型炎癥小體反應(yīng)［55-58］。其具體作用機(jī)制為，OMVs首先通過LPS激活TLR4與IFN-I信號通路，進(jìn)而誘導(dǎo)鳥苷酸結(jié)合蛋白（guanylate-binding protein，GBPs）的產(chǎn)生，產(chǎn)生的GBPs與胞質(zhì)中OMVs表面LPS結(jié)合促進(jìn)LPS與炎性Caspase-11的相互作用［56，58］，活化的Caspase-11裂解GSDMD得到的氨基端片段促進(jìn)Caspase-1依賴的細(xì)胞焦亡與NLRP3依賴的非典型炎癥小體的激活［56，58-59］。而在人源細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)，OMVs上LPS主要通過Caspase-5（Caspase-11的人類同系物）激活炎癥小體通路［60］。

2.3 樹突狀細(xì)胞（DC）

作為已知功能最強(qiáng)且惟一能活化初始T細(xì)胞的專職抗原提呈細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）是啟動(dòng)、調(diào)控和維持免疫應(yīng)答的中心細(xì)胞。DC可通過經(jīng)典的主要組織相容性復(fù)合物（MHC I和MHC II）呈遞蛋白質(zhì)類抗原、通過非經(jīng)典的CD1分子呈遞脂類抗原。由DC呈遞的抗原可激活抗原特異性T淋巴細(xì)胞，包括CD8 T細(xì)胞、CD4 T細(xì)胞與NK T細(xì)胞，其誘導(dǎo)激活抗原特異性T細(xì)胞的能力遠(yuǎn)超其他抗原提呈細(xì)胞［61］。早在2007年，研究人員就發(fā)現(xiàn)，OMVs能誘導(dǎo)DC分泌促炎因子TNF-α和IL-12，同時(shí)促進(jìn)DC表達(dá)更高的抗原呈遞分子MHC-II與共刺激分子CD86（圖3c）；此外，OMVs可以作為佐劑，通過激活DC增強(qiáng)抗原特異性的B細(xì)胞與T細(xì)胞免疫反應(yīng)［62］。OMVs對DC的激活主要依賴于DC TLR4通路的激活［63］。

同時(shí)，由于DC是適應(yīng)性免疫反應(yīng)的中心細(xì)胞，疫苗接種后需要DC將抗原提呈給T細(xì)胞或B細(xì)胞才能順利激活抗原特異性免疫反應(yīng)，而OMVs即可作為佐劑激活DC又?jǐn)y帶親本細(xì)菌的特異性抗原，因此以O(shè)MVs作為疫苗誘發(fā)適應(yīng)性免疫抵抗細(xì)菌感染的研究由來已久。早在1987年，第一種基于OMVs的疫苗就在古巴獲準(zhǔn)用于血清型腦膜炎奈瑟菌的治療［8］；隨后OMVs疫苗在挪威、新西蘭等地被成功用于預(yù)防B族腦膜炎球菌感染［7，64-66］；OMVs疫苗對多種病原體都可產(chǎn)生預(yù)防效果，包括霍亂弧菌、肺炎克雷伯菌等［67-70］。同時(shí)，多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，以O(shè)MVs作為佐劑的疫苗能誘導(dǎo)比傳統(tǒng)疫苗制劑更強(qiáng)的免疫反應(yīng)［71-75］。

3 OMVs的修飾改造策略

作為細(xì)菌分泌的納米囊泡，OMVs具有易于修飾改造的特性，這使其在抗腫瘤研究中有著巨大的應(yīng)用前景。對OMVs進(jìn)行修飾改造不僅可以加強(qiáng)其腫瘤靶向性、減弱其全身毒性還能根據(jù)需要賦予其特定功能。對OMVs的修飾改造根據(jù)修飾時(shí)間可初步分為分泌前修飾與分泌后修飾。

3.1 OMVs的分泌前修飾

與人工合成的脂質(zhì)體等納米載體相比，OMVs制備簡單，且通過對其親本細(xì)菌進(jìn)行功能化改造即可改變其分泌的OMVs功能。可考慮以基因工程、代謝工程或親本細(xì)菌膜工程的方法對親本細(xì)菌進(jìn)行功能化以實(shí)現(xiàn)OMVs的分泌前修飾。

OMVs的基因工程策略大多基于蛋白質(zhì)或融合蛋白在細(xì)菌中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，這些蛋白質(zhì)或融合蛋白往往跨膜結(jié)構(gòu)域以保證目標(biāo)蛋白在OMVs中的富集。早在2004年，研究人員就已成功利用基因工程向OMVs中摻入了外源蛋白［76］。其中，直接向大腸桿菌導(dǎo)入的異源外膜蛋白Ail（一種來自小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（Yersinia enterocolitica）的外膜黏附素/侵入素）成功摻入大腸桿菌外膜，且在不影響大小的情況下增加了OMVs產(chǎn)量。對于不能定位于細(xì)菌外膜的蛋白質(zhì)，可通過雙精氨酸蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（twin arginine transporter system，Tat）將加有Tat信號序列的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入周質(zhì)空間，且Tat信號序列可在周質(zhì)空間被切除，研究人員利用這種方法成功將GFP蛋白和其他周質(zhì)蛋白一起裝進(jìn)了OMVs中?；蚬こ痰膽?yīng)用使OMVs在遞送蛋白質(zhì)類分子方面相比于人工合成的納米載體或動(dòng)物細(xì)胞的胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）極具優(yōu)勢。這些異源蛋白或作為周質(zhì)蛋白包裹在OMVs中，或通過與外膜蛋白（ClyA、OmpC等）連接表達(dá)在OMVs外膜上。其中，表達(dá)在OMVs腔體內(nèi)的蛋白質(zhì)要么本就是細(xì)菌周質(zhì)蛋白［77-78］，要么就需要利用細(xì)菌轉(zhuǎn)運(yùn)體系將目標(biāo)蛋白從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至周質(zhì)空間［72，76，79］；對于表達(dá)在OMVs膜表面的蛋白質(zhì)，根據(jù)需求的不同可使目標(biāo)蛋白處于OMVs膜外葉［80-85］或內(nèi)葉［86-87］。對OMVs的基因工程化改造可使其獲得多種功能。例如：通過基因工程敲除lpxL1基因在保留OMVs免疫活性的同時(shí)減輕了LPS毒性［88-90］；表面表達(dá)ClyA-Ag-Fc（Ag為腫瘤抗原）的OMVs作為腫瘤疫苗具有顯著的抗腫瘤效果［83］；表面表達(dá)靶向多肽LyP1提高了OMVs的腫瘤靶向能力，使其腫瘤內(nèi)化率提升了10%［80］；腔內(nèi)攜帶重組人腫瘤壞死因子相關(guān)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體（recombinant human tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）的OMVs則具有誘導(dǎo)黑色素瘤凋亡的能力［91］；表面表達(dá)捕獲因子SpC和SnC的OMVs可即時(shí)捕獲用SnT或SnP標(biāo)簽標(biāo)記的腫瘤新抗原，從而快速構(gòu)建個(gè)性化抗腫瘤納米疫苗［85］。

通過干擾內(nèi)源性代謝途徑對親本細(xì)菌進(jìn)行代謝工程改造，也能賦予OMVs新的成分與功能。早在20世紀(jì)50年代，研究人員就通過將硒代甲硫氨酸加入到無甲硫氨酸的培養(yǎng)基中使大腸桿菌合成了含硒的蛋白質(zhì)［92］。通過這種方法，研究人員向細(xì)菌或動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)中摻入了各種生物正交基團(tuán)，例如以甲硫氨酸替代物高丙炔基甘氨酸、高烯丙基甘氨酸和疊氮高丙氨酸向蛋白質(zhì)中高效引入了炔烴、烯烴和疊氮化物［93-94］。包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的大量細(xì)胞會(huì)用唾液酸化聚糖修飾細(xì)胞表面，且在腫瘤外泌體中檢測出特定的含唾液酸的糖蛋白［95］，基于此，研究人員將腫瘤細(xì)胞與可以代謝為唾液酸的四酰化N-疊氮乙酰甘露糖胺（N-azidoacetylmannosaminetetraacylated，ManNAz）共培養(yǎng)，獲得了ManNAz修飾的EVs［96］。類似的，將四酰化N-疊氮乙酰半乳糖胺加入細(xì)菌培養(yǎng)基中，可通過糖綴合將疊氮基團(tuán)（N3）引入細(xì)菌外膜，進(jìn)而得到N3修飾的OMVs，N3與二苯并環(huán)辛炔基團(tuán)（dibenzylcyclooctyne，DBCO）間的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)可使連接在DBCO上的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）包覆于OMVs表面以掩蔽其免疫原性［82］。此外，細(xì)菌可通過OMVs的分泌緩解環(huán)境毒性，基于此，研究人員通過向大腸桿菌培養(yǎng)基中添加其無法代謝的磁性氧化鐵納米顆粒（magnetic iron-oxide nanoparticles，MNPs），最終得到了包裹著MNPs的OMVs，這不僅可以利用磁性吸附顯著提高OMVs的收貨量，還可以得到具有磁靶向能力的磁性O(shè)MVs［97］。相比于基因工程，代謝工程操作簡單，但同時(shí)代謝工程很難控制偶聯(lián)位點(diǎn)的特異性與效率。

除上述兩種策略，直接對親本細(xì)菌進(jìn)行膜工程化也可能對OMVs膜進(jìn)行修飾。研究人員發(fā)現(xiàn)，使用疊氮修飾的脂質(zhì)體與親本細(xì)胞進(jìn)行膜融合，能得到疊氮修飾的EVs以便利用點(diǎn)擊化學(xué)對其進(jìn)行功能化［98］。與此策略相似，膜工程技術(shù)也被應(yīng)用于細(xì)菌膜的改造。早在2000年，研究人員就通過脂質(zhì)體與細(xì)菌膜融合的方式將妥布霉素遞送進(jìn)細(xì)菌胞內(nèi)克服了細(xì)菌耐藥性［99］，此后膜工程化技術(shù)廣泛應(yīng)用于抗菌研究［100-102］。因此，類似于細(xì)胞衍生EVs的修飾策略，將脂質(zhì)體與細(xì)菌進(jìn)行膜融合可將脂質(zhì)體上攜帶的功能性脂質(zhì)或其他膜相關(guān)分子轉(zhuǎn)移到細(xì)菌膜上，最終得到功能修飾的OMVs。

3.2 OMVs的分泌后修飾

與分泌前修飾相比，分泌后修飾雖然需要更長的時(shí)間與進(jìn)一步的純化步驟，但其適用面更廣，可用于各種分子與配體的修飾。另外，由于細(xì)菌菌株與菌種間差異較大，對其膜表面蛋白的研究遠(yuǎn)不如哺乳動(dòng)物細(xì)胞清晰［103］，這不可避免地給基因工程或代謝工程修飾帶來了一定阻礙，而分泌后修飾則避開了這個(gè)問題。OMVs的分泌后修飾多基于物理相互作用或化學(xué)改性的方法，部分修飾還會(huì)與分泌前修飾結(jié)合。

OMVs的物理修飾主要分為膜融合與脂質(zhì)插入兩種方法。其中膜融合的對象可分為人工合成的脂質(zhì)體與生物膜囊泡兩類。雖然有一些問題需要克服（包括如何提高脂質(zhì)體與OMVs的融合效率以及如何分離純化融合產(chǎn)物），但是，與能夠大批量定制生產(chǎn)的脂質(zhì)體融合來對OMVs進(jìn)行表面改性是一種頗有前景的方法。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）常被用于檢測膜融合是否成功，若成功，則脂質(zhì)體膜中含有的互補(bǔ)配對親脂性熒光分子將被稀釋導(dǎo)致供體熒光可被檢測［104］。研究人員通過反復(fù)凍融法實(shí)現(xiàn)了脂質(zhì)體與EVs的融合，并通過FRET實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證［105］；而PEG 8000誘導(dǎo)的膜融合則使超過60%的膜成分與可溶性內(nèi)容物成功從脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移到EVs中且保留了EVs原有的內(nèi)容物［106］。與脂質(zhì)體融合既不影響OMVs完整性，又可根據(jù)需要對脂質(zhì)體進(jìn)行定制以對OMVs進(jìn)行個(gè)性化表面修飾。除了脂質(zhì)體，膜融合技術(shù)還可整合兩種或多種生物膜以獲得具有所需特性的雜化膜囊泡［107］?；贠MVs優(yōu)秀的佐劑性，已證明在OMVs表面修飾腫瘤抗原以誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)是一種行之有效的策略，而通過膜融合技術(shù)將腫瘤細(xì)胞膜與OMVs融合得到的具有腫瘤全抗原的疫苗可引發(fā)比單一抗原更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。例如，通過超聲和擠壓將黑色素瘤膜囊泡與大腸桿菌或沙門氏菌的OMVs融合，得到的雜合囊泡繼承并整合了兩種母體成分的免疫功能，不僅有效激活了DC免疫反應(yīng)，還誘導(dǎo)了基于細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）的強(qiáng)大抗腫瘤特異性免疫，表現(xiàn)出出色的腫瘤預(yù)防與治療效果［108-110］。類似的，與植物類囊體膜融合的OMVs不僅繼承了類囊體膜的光動(dòng)力效果以有效殺傷腫瘤細(xì)胞，還表現(xiàn)出增強(qiáng)的免疫刺激與免疫重編程能力，PDT釋放的腫瘤抗原與具有佐劑性質(zhì)的融合囊泡一起誘導(dǎo)了全身性抗腫瘤免疫反應(yīng)，這不僅進(jìn)一步對原位腫瘤產(chǎn)生了殺傷還有效抑制了腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生［111］。

脂質(zhì)插入是通過與PEG-脂質(zhì)膠束共孵育將PEG化的脂質(zhì)插入囊泡中，這項(xiàng)技術(shù)最初被用于對脂質(zhì)體進(jìn)行表面功能化。其中PEG-脂質(zhì)膠束中的脂質(zhì)多指磷脂和膽固醇，二者區(qū)別在于插入條件與插入后穩(wěn)定性不同。而由于相變溫度較高，磷脂插入需要更高的活化能，膽固醇插入溫度更適用于生物囊泡，但其插入穩(wěn)定性較差［112］。盡管如此，脂質(zhì)插入已被用于對生物囊泡進(jìn)行功能化修飾，因?yàn)楸绕鹋c脂質(zhì)體膜融合，脂質(zhì)插入可以使功能分子不必暴露于常規(guī)脂質(zhì)體合成的有機(jī)溶劑中。研究人員在EVs表面插入了表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）抗體-PEG-磷脂，其中EGFR抗體的修飾增強(qiáng)了過表達(dá)EGFR的腫瘤細(xì)胞對EVs的攝取，而PEG的修飾則延長了EVs的血液循環(huán)時(shí)間［113］。在這項(xiàng)研究中，40℃是平衡插入效率與穩(wěn)定性后的最佳溫度，雖然60℃能獲得更高的插入效率，但會(huì)對EVs造成損傷。類似的，37℃條件下共孵育3 h將甘露糖-PEG-磷脂插入EVs表面，基于DC表面甘露糖受體對EVs表面的甘露糖的特異性識(shí)別成功增加了DC對EVs的攝取，這增強(qiáng)了EVs在小鼠引流淋巴結(jié)處的蓄積［114］。與磷脂類似，用膽固醇修飾siRNA能使其插入EVs中，進(jìn)而利用EVs的藥物遞送能力實(shí)現(xiàn)了對特定基因（如亨廷頓基因、CD45基因或RNA結(jié)合蛋白HuR基因等）的沉默［115-117］。與EVs類似，OMVs同樣能用脂質(zhì)插入技術(shù)進(jìn)行修飾。例如，與二硬脂?；字Ｒ掖及罚?,2-dioctadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DSPE）-PEG-生物素或DSPE-PEG-葉酸膠束的共孵育成功實(shí)現(xiàn)了對OMVs的表面修飾。但值得注意的是，區(qū)別于動(dòng)物細(xì)胞，脂質(zhì)插入技術(shù)僅能對OMVs進(jìn)行修飾，并不能修飾細(xì)菌外膜［118］。可能的原因是細(xì)菌外膜大量糖基化的脂質(zhì)屏蔽了細(xì)胞表面，而高曲率的OMVs往往有著脂質(zhì)堆積缺陷便于插入［119］。脂質(zhì)插入技術(shù)雖然可以避免功能分子暴露于脂質(zhì)體合成過程中的有機(jī)試劑，但穩(wěn)定性不足與插入效率低等問題仍需解決。

對OMVs的化學(xué)改性主要通過功能基團(tuán)與OMVs膜組分間形成化學(xué)鍵來實(shí)現(xiàn)。例如，OMVs表面的酸性殘基可與Ca2+發(fā)生螯合反應(yīng)，并作為成核位點(diǎn)促進(jìn)磷酸鈣成核礦化，最終磷酸鈣晶體覆蓋OMVs表面，礦化的OMVs生物毒性顯著降低，克服了血液循環(huán)中OMVs的抗體依賴性清除，并且酸敏感的磷酸鈣殼可以在腫瘤酸性微環(huán)境中溶解釋放OMVs抑制腫瘤生長［120］。此外，研究人員利用OMVs表面蛋白上的氨基與活性酯（NHS）的反應(yīng)抗原將馬來酰亞胺（maleimide，Mal）-PEG4-NHS接枝到OMVs表面得到OMV-Mal，OMV-Mal能利用Mal與蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的硫醚鍵（圖6a），這使OMVs具備了抗原捕獲的功能［121］。在腫瘤原位捕獲抗原的OMVs能作為腫瘤原位疫苗激活DC，誘導(dǎo)強(qiáng)效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。類似的，Peng等［91］利用棕櫚酸將αVβ3整合素特異性肽RGP與OMVs進(jìn)行偶聯(lián)，實(shí)現(xiàn)了對表達(dá)αVβ3的侵襲性黑色素瘤的特異性靶向。除了OMVs表面自帶的可結(jié)合位點(diǎn)，還可利用分泌前修飾向OMVs添加結(jié)合位點(diǎn)。例如，研究人員利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了一種基于OMVs的多功能疫苗平臺(tái)，該平臺(tái)通過由標(biāo)簽/捕獲蛋白對構(gòu)成的即插即顯示系統(tǒng)來快速在OMVs表面展示多種腫瘤抗原［85］。通過基因工程技術(shù)在OMVs表面表達(dá)了捕獲蛋白SpC/SnC，捕獲蛋白可與抗原上連接的標(biāo)簽蛋白SpT/SnT形成共價(jià)連接，從而將抗原展示在OMVs表面（圖4）。此外，也有研究利用代謝工程向OMVs表面引入可與DBCO發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的N3，然后通過化學(xué)修飾將DBCOPEG/Se接到OMVs表面，PEG對OMVs免疫原性的掩蔽增加了其靜脈注射的安全劑量［82］。

Fig.4 Schematic illustration of OMVs system for antigen display［85］圖4 用于抗原展示的OMVs平臺(tái)［85］

基于上述對OMVs的修飾改造方法已得到廣泛驗(yàn)證，目前的修飾方法中基因工程、膜融合與化學(xué)修飾是最具潛力的3種方法?；蚬こ绦揎棾杀镜?、穩(wěn)定性高、無需額外的分離提純步驟有利于大規(guī)模生產(chǎn)，但基因工程局限于蛋白質(zhì)或多肽，不適用于小分子或脂類的修飾；膜融合效率高、能兼顧表面修飾與載藥，然而由于膜結(jié)構(gòu)的差異，與OMVs的膜融合較難；化學(xué)修飾主要作用于OMVs表面蛋白質(zhì)的氨基，適用面廣，且通過基因工程等方法在分泌前修飾上化學(xué)結(jié)合位點(diǎn)較EVs更易操作，另外化學(xué)修飾的共價(jià)鍵連接可以避免目標(biāo)分子與OMVs的輕易分離?？偟膩碚f，通過修飾改造賦予OMVs特定功能有利于其實(shí)際應(yīng)用與臨床轉(zhuǎn)化。

4 OMVs應(yīng)用于腫瘤治療

目前，臨床試驗(yàn)中OMVs主要作為疫苗應(yīng)用于細(xì)菌感染的防治，且已進(jìn)入臨床應(yīng)用階段［7-8，64-66］。在抗腫瘤研究中，OMVs既能作為載體用于抗腫瘤藥物的遞送，也能作為免疫調(diào)節(jié)劑重塑腫瘤免疫微環(huán)境、激活機(jī)體自身免疫反應(yīng)以協(xié)同化療/PDT等療法抑制腫瘤生長；而在腫瘤疫苗領(lǐng)域，OMVs可同時(shí)作為疫苗納米載體和佐劑以激起強(qiáng)效的腫瘤特異性免疫反應(yīng)。更重要的是，僅OMVs自身就能通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡、調(diào)節(jié)免疫等手段起到一定抑制腫瘤生長的作用。因此，本節(jié)將對OMVs的載體優(yōu)勢，OMVs對腫瘤的殺傷作用，OMVs作為載體、免疫調(diào)節(jié)劑、佐劑等在腫瘤治療中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

4.1 OMVs的載體優(yōu)勢

易于修飾的特點(diǎn)及自身性質(zhì)使OMVs被廣泛作為抗腫瘤藥物遞送載體研究。首先，尺寸效應(yīng)使OMVs本身就具有一定腫瘤靶向能力；其次，靶向修飾可進(jìn)一步的增加OMVs對特定細(xì)胞的靶向性；最后，表面PAMPs分子與納米級的粒徑使得OMVs兼具佐劑性與淋巴滯留能力，這可以極大地協(xié)同抗原增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。

與表面修飾類似，對OMVs進(jìn)行藥物裝載同樣可分為分泌前裝載與分泌后裝載兩類方法。分泌前加載是對細(xì)菌進(jìn)行處理以得到封裝有藥物的OMVs，這種方法主要用于易變性的生物分子。例如，研究人員在細(xì)菌培養(yǎng)過程加入慶大霉素，利用細(xì)菌會(huì)通過OMVs排出有害物質(zhì)的性質(zhì)，得到了封裝有慶大霉素的OMVs［122］，而利用基因工程則可使OMVs高效加載蛋白質(zhì)類藥物［91］。分泌后加載是將藥物封裝入已分離提純的OMVs中，脂雙層結(jié)構(gòu)使OMVs既可封裝疏水藥物又可封裝親水藥物。通過與藥物共孵育，疏水性小分子藥物可封裝在OMVs膜內(nèi)，同時(shí)帶正電的小分子藥物可利用靜電吸附作用封裝在OMVs膜上；而通過電穿孔、超聲處理、物理擠出或滲透處理等方法可使OMVs封裝親水性藥物分子［80-81，123］。

作為載體，OMVs可靶向腫瘤部位（圖5）：OMVs表面富集的PAMPs使其易被血液循環(huán)中的中性粒細(xì)胞吞噬，而由于中性粒細(xì)胞具有炎性靶向能力，因此OMVs可利用中性粒細(xì)胞靶向炎性腫瘤組織。值得注意的是，到達(dá)炎性腫瘤后，OMVs可通過中性粒細(xì)胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，NETs）形成過程中被釋放出來且不影響活性，這使得OMVs具有天然的腫瘤靶向能力［124］。同時(shí)，20~250 nm的粒徑使OMVs可以自由循環(huán)至淋巴結(jié)，表面富集的PAMPs使其易于被DC攝取滯留淋巴，并誘導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng)［125-126］?；诖?，研究表明隨插隨顯示的OMVs抗原展示平臺(tái)在小鼠體內(nèi)有明顯的淋巴蓄積現(xiàn)象，激活了有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)［85］。此外，OMVs可以通過毛囊途徑和表皮滲透兩種途徑穿過角質(zhì)層到達(dá)真皮層，這賦予了其獨(dú)特的優(yōu)勢作為透皮藥物遞送載體［127-130］?；诖耍芯咳藛T利用OMVs將光敏劑吲哚菁綠（indocyanine Green，ICG）與TRAIL以經(jīng)皮給藥的方式遞送至黑色素瘤，成功抑制了腫瘤的生長［91］。

Fig.5 Schematic illustration showing the chemotaxis-driven delivery of NPNs for complete eradication of tumors post-phototherapy［124］圖5 炎癥趨向的中性粒細(xì)胞遞送納米顆粒，用于PTT治療后腫瘤的根除［124］

綜上所述，OMVs的佐劑性與淋巴蓄積能力有利于其在腫瘤免疫治療中作為藥物或抗原的載體，而其腫瘤靶向能力與角質(zhì)層穿透能力使得OMVs也可用于遞送化療藥、光敏劑等藥物進(jìn)行腫瘤治療。

4.2 OMVs對腫瘤的直接殺傷

在抗腫瘤研究中，OMVs自身就對腫瘤具有一定的殺傷效果。PAMPs的富集使OMVs可通過受體激活的死亡途徑在細(xì)胞層面可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生焦亡或凋亡。首先，有研究表明，OMVs通過內(nèi)吞途徑進(jìn)入宿主細(xì)胞后可在早期內(nèi)體階段將LPS釋放到胞質(zhì)中，繼而在GBPs的幫助下激活Caspase-11，引起細(xì)胞焦亡并釋放炎性因子IL-1β，修飾后的LPS則不具有激活Caspase-11的能力［55，57-58，60］。其次，細(xì)菌OMVs可誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體膜電位降低，引發(fā)線粒體功能障礙，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體凋亡、炎癥小體激活，最終觸發(fā)細(xì)胞凋亡［131］。最后，致病菌OMVs可遞送毒力因子誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，例如：致病型大腸桿菌OMVs上攜帶的細(xì)胞質(zhì)酶HlyF可通過阻斷細(xì)胞自噬體與溶酶體的融合阻斷自噬，激活非經(jīng)典炎癥小體途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡［132］。值得注意的是，細(xì)胞可通過多種途徑抑制由OMVs誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡［133-135］。因此，OMVs誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡受多種因素影響，包括OMVs的組分構(gòu)成、PAMPs分子的相對濃度以及宿主細(xì)胞敏感度等。

此外，OMVs在活體層面也有一定的腫瘤抑制效果，這主要?dú)w功于OMVs對機(jī)體免疫系統(tǒng)的激活。首先，OMVs可以誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophage，TAM）向促炎M1型巨噬細(xì)胞極化［82，120］；其次，OMVs可招募包括NK細(xì)胞、T細(xì)胞在內(nèi)的多種免疫細(xì)胞，這既能逆轉(zhuǎn)腫瘤區(qū)域免疫抑制性的微環(huán)境也能在腫瘤區(qū)域誘導(dǎo)γ干擾素（IFN-γ）的產(chǎn)生以介導(dǎo)腫瘤凋亡［136］。然而，IFN-γ在介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的同時(shí)會(huì)上調(diào)腫瘤細(xì)胞程序性死亡配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）的表達(dá)，這抑制了T細(xì)胞活性并最終降低了抗腫瘤效果［137-140］。針對這個(gè)問題，研究人員通過基因工程化修飾得到了程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）修飾的OMVs，在保留OMVs腫瘤殺傷能力的同時(shí)通過對腫瘤細(xì)胞表面PD-L1的封閉解除了腫瘤細(xì)胞對T細(xì)胞的功能抑制，顯著提高了腫瘤抑制效果［80，84］。類似的，通過基因工程得到的表面表達(dá)CD47抗體的OMVs不僅能封閉腫瘤表面CD47分子以解除其對巨噬細(xì)胞的吞噬抑制，還能作為橋梁連接巨噬細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞以增強(qiáng)吞噬，該工程化的OMVCD47nb在小鼠體內(nèi)重塑了腫瘤微環(huán)境且激活了腫瘤特異性免疫反應(yīng)，在有效抑制腫瘤生長的同時(shí)誘導(dǎo)了對腫瘤的長期免疫記憶［82］。

總之，OMVs對機(jī)體免疫系統(tǒng)的激活使其具有一定抗腫瘤效果，當(dāng)OMVs作為載體時(shí)，這種效果能很好地增強(qiáng)其他腫瘤治療方法的療效。

4.3 OMVs激活免疫協(xié)助增強(qiáng)抗腫瘤效果

OMVs對機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用使其在抗腫瘤研究中大有可為。首先，OMVs對免疫細(xì)胞的強(qiáng)烈刺激可對免疫抑制性的腫瘤微環(huán)境進(jìn)行重編程，這可增強(qiáng)化療、光動(dòng)力等對腫瘤的抑制效果。其次，OMVs的佐劑性及淋巴靶向性使其在腫瘤疫苗的應(yīng)用中有著廣泛應(yīng)用前景。因此，OMVs主要作為遞送載體、免疫調(diào)節(jié)劑、佐劑等應(yīng)用于臨床前抗腫瘤研究（表1）。

Table 1 Application of OMVs in tumor treatment表1 OMVs應(yīng)用于腫瘤治療

在腫瘤治療中，OMVs不僅可作為納米遞送載體增加抗腫瘤藥物的利用率并降低藥物副作用，還可以作為免疫調(diào)節(jié)劑激活機(jī)體免疫反應(yīng)以協(xié)同增強(qiáng)化療、PDT等抗腫瘤療法的療效。早在2014年，研究人員利用基因工程化的接有腫瘤靶向肽的減毒OMVs向腫瘤部位遞送了小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），有效抑制了腫瘤生長［141］。此后，OMVs被廣泛用于抗腫瘤藥物的遞送。例如，載有光敏劑二氫卟吩e6（chlorin e6，Ce6）和化療藥阿霉素（doxorubicin，DOX）的OMVs作為治療平臺(tái)，通過光動(dòng)力、化療與免疫療法的有機(jī)協(xié)同實(shí)現(xiàn)了對小鼠三陰性乳腺腫瘤的完全抑制，并成功防止了腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生［142］。負(fù)載黑色素的OMVs有著良好的光熱轉(zhuǎn)換效率，其不僅可在近紅外激光的照射下對腫瘤進(jìn)行局部加熱以殺死腫瘤，還可利用多光譜光聲斷層掃描技術(shù)（multispectral optoacoustic tomography，MSOT）對腫瘤組織進(jìn)行光聲成像［143］?？傊?，OMVs不僅能作為載體將光敏劑、化療藥等抗腫瘤藥物遞送至腫瘤部位，還能激活免疫反應(yīng)以增強(qiáng)抗腫瘤效果［144-147］。

在腫瘤疫苗研究中，OMVs同時(shí)作為疫苗納米載體與免疫佐劑來增強(qiáng)由針對腫瘤抗原的特異性免疫反應(yīng)。作為載體，工程化的OMVs既可以快速捕獲多種腫瘤抗原，又可以靶向淋巴結(jié)并增強(qiáng)DC對抗原的攝取，同時(shí)OMVs能作為佐劑進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤特異性免疫反應(yīng)，強(qiáng)效的免疫反應(yīng)消除了小鼠皮下腫瘤并抑制了腫瘤的轉(zhuǎn)移［85，148］。類似的，利用OMVs向DC遞送抗原mRNA能引起有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)，成功實(shí)現(xiàn)了對腫瘤的抑制并誘導(dǎo)了長期免疫記憶的產(chǎn)生［149］。然而由佐劑誘導(dǎo)的DC快速成熟會(huì)導(dǎo)致其攝取能力降低，這種現(xiàn)象被稱為成熟誘導(dǎo)的攝取阻塞（maturation-induced uptake obstruction，MUO）。對此，研究人員通過在OMVs修飾上葡萄球菌蛋白A的結(jié)構(gòu)域B（domain B of staphylococcal protein A）以結(jié)合αDEC205抗體的Fc端，而αDEC205抗體的Fab端與DC表面DEC205（CD205，一種具有抗原呈遞功能的內(nèi)吞受體）的結(jié)合使OMV-DEC能通過異位攝取途徑突破MUO的限制。因此，DC對OMV-DEC表現(xiàn)出比OMVs更強(qiáng)的攝取能力，這增強(qiáng)了OMV-DEC對抗原的呈遞能力，激活了更強(qiáng)的抗腫瘤免疫反應(yīng)，成功抑制了黑色素瘤的生長與轉(zhuǎn)移［150］。作為細(xì)菌分泌物，OMVs可由腸道細(xì)菌原位產(chǎn)生，因此，研究人員開發(fā)了一種阿拉伯糖誘導(dǎo)型基因工程化大腸桿菌作為口服型腫瘤疫苗。大腸桿菌在小鼠腸道原位產(chǎn)生負(fù)載腫瘤抗原的OMVs，其可穿過腸上皮細(xì)胞屏障，刺激DC成熟，并進(jìn)一步激活腫瘤特異性免疫反應(yīng)以殺傷腫瘤細(xì)胞。在小鼠模型中，該疫苗不僅實(shí)現(xiàn)了對腫瘤的抑制，原位產(chǎn)生的方式還使其避免了分離提純的繁瑣步驟，有效降低了生產(chǎn)成本［83］。而為了實(shí)現(xiàn)個(gè)性化治療，可將OMVs與腫瘤細(xì)胞膜或腫瘤外泌體融合，得到的雜化囊泡作為個(gè)性化腫瘤疫苗能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，提高小鼠生存率并提供對腫瘤的長期防護(hù)［109-110，146，148，151-152］。進(jìn)一步的，OMV-Mal可在腫瘤原位捕獲PTT后釋放的腫瘤抗原，并將之遞送至DC以引發(fā)腫瘤特異性免疫反應(yīng)（圖6b）。這種策略不僅通過增強(qiáng)抗原攝取、刺激DC成熟等手段增強(qiáng)了免疫反應(yīng)，還實(shí)現(xiàn)了免疫療法與PDT、PTT、化療等治療方法的協(xié)同［121］。綜上所述，在腫瘤疫苗研究中，OMVs作為具有內(nèi)在免疫佐劑性質(zhì)的納米載體被廣泛用于遞送腫瘤抗原，引發(fā)強(qiáng)效的抗腫瘤特異性免疫反應(yīng)。

Fig.6 Schematic illustration of preparation of 1-MT@OMV-Mal and in situ vaccine after PTT［121］圖6 1-MT@OMV-Mal的制備與光熱治療后原位疫苗作用示意圖［121］

5 總結(jié)與展望

綜上所述，易于修飾、強(qiáng)佐劑性的細(xì)菌OMVs在腫瘤治療中有著廣大前景。作為載體，OMVs在提升藥物腫瘤蓄積的同時(shí)還能通過激活免疫反應(yīng)對腫瘤進(jìn)行一定殺傷；作為疫苗組分，OMVs不僅可作為佐劑激活DC還能增強(qiáng)DC對抗原的攝取。并且，OMVs易于修飾改造的特性也有助于構(gòu)建多功能OMVs體系以更好地抑制腫瘤生長。

盡管OMVs在腫瘤治療領(lǐng)域有著許多優(yōu)勢，但仍有一些臨床應(yīng)用上的困難需要克服。首先，OMVs的具體成分難以控制且產(chǎn)量較低。其次，OMVs本身具有一定生物毒性，這限制了其使用劑量。最后，在腫瘤疫苗研究中，腫瘤抗原表達(dá)量較低以及針對OMVs自身產(chǎn)生的免疫反應(yīng)可能會(huì)影響腫瘤疫苗的效力。

雖然如此，目前，研究人員已通過多種手段對OMVs產(chǎn)量及毒性問題進(jìn)行了優(yōu)化，比如，通過敲除Lpp基因可以有效提高OMVs產(chǎn)量，而敲除msbB基因或者對OMVs進(jìn)行表面修飾則可以得到低毒性的OMVs。未來，隨著對OMVs生物發(fā)生機(jī)理、OMVs與免疫系統(tǒng)的相互作用等研究的不斷深入，將有望解決機(jī)體產(chǎn)生OMVs特異性免疫反應(yīng)干擾抗腫瘤效果的問題。同時(shí)，細(xì)菌易于基因修飾的特性使得人們能通過基因工程的手段同時(shí)克服上述問題。因此，未來OMVs將很可能作為具有免疫調(diào)節(jié)作用的藥物載體或者具有佐劑作用的抗原載體應(yīng)用于腫瘤的臨床治療。