仝津愷 閆思翔 張艷多 侯凱龍 張科 張昊楠 常順 賈舒婷**

（1）昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院衰老與腫瘤分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500；2）云南省第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科，昆明 650032）

膠質(zhì)瘤主要起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，有部分來(lái)源于神經(jīng)干細(xì)胞，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的80%，惡性膠質(zhì)瘤5年死亡率僅次于肺癌和胰腺癌［1］。2021年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類中根據(jù)不同組織的表型及基因型將中樞神經(jīng)系統(tǒng)分為1、2、3、4級(jí)，其中1、2級(jí)屬于低級(jí)別膠質(zhì)瘤，3、4級(jí)屬于高級(jí)別膠質(zhì)瘤，不同膠質(zhì)瘤的正確分級(jí)和分類不僅取決于他們的組織學(xué)特征，還取決于分子特征，如一些基因（IDH1、ATRX、TP53、CDK2A、BRAF、FGFR1和PDGFRA）的改變和甲基化特征［2］。高級(jí)別膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)較快、浸潤(rùn)性強(qiáng)且預(yù)后較差，3級(jí)膠質(zhì)瘤的中位總生存期（overall survival，OS）約為3年，而4級(jí)膠質(zhì)瘤，尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM），僅為15個(gè)月，且只有0.05%~4.7%的患者在診斷后存活5年［3］。目前膠質(zhì)瘤的治療手段還比較單一，仍然是手術(shù)切除后輔以放化療的綜合治療，盡管這些治療手段可以一定程度上改善膠質(zhì)瘤患者的生存時(shí)間和生存質(zhì)量，但其OS時(shí)間仍然很短。事實(shí)上，膠質(zhì)瘤患者的低生存率部分歸咎于膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性生長(zhǎng)以及與周圍正常腦組織交錯(cuò)，因而手術(shù)難以完全切除，同時(shí)由于其異常的生物學(xué)特性，對(duì)放療和化療的耐受，導(dǎo)致術(shù)后放化療失敗，而且經(jīng)常以同級(jí)別或高級(jí)別復(fù)發(fā)。因此，新的治療方法和新的治療藥物的開發(fā)對(duì)于膠質(zhì)瘤的治療十分必要。

端粒長(zhǎng)度的維持對(duì)于腫瘤細(xì)胞的生存起著至關(guān)重要的作用，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞會(huì)通過激活端粒酶活性延長(zhǎng)端粒長(zhǎng)度［4-5］。端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，以其自身RNA作為模板在DNA前導(dǎo)鏈的3'端添加端粒序列使端粒延長(zhǎng)［6-8］。然而，大約10%~15%的人類腫瘤并不是通過激活端粒酶去維持或延長(zhǎng)端粒長(zhǎng)度，而是通過端粒延長(zhǎng)替代機(jī)制（alternative lengthening of telomeres，ALT）去延長(zhǎng)端粒［9-10］。目前對(duì)ALT機(jī)制的了解仍不明確，人們普遍認(rèn)為ALT是依賴于端粒序列特異性的同源重組（homologous recombination，HR）機(jī)制延長(zhǎng)端粒［11］。已有研究表明，ALT途徑的激活通常與幾種典型的表型有關(guān)，包括高度異質(zhì)性的端粒長(zhǎng)度，端粒姐妹染色單體交換（telomere sister chromatid exchange，T-SCE），豐富的染色體外端粒重復(fù)序列（extrachromosomal telomeric repeats，ECTRs）以及出現(xiàn)ALT途徑相關(guān)的早幼粒細(xì)胞白血病小體（ALT-associated PML bodies，APBs）［10］。在很多類型的腫瘤中，都可以觀察到ALT的存在，其中骨肉瘤和膠質(zhì)瘤中ALT的發(fā)生率相比于其他癌癥類型更高。尤其在膠質(zhì)瘤中，ALT的發(fā)生率約占30%，其中彌漫型星形膠質(zhì)瘤ALT發(fā)生率為55%，少突星形細(xì)胞瘤ALT發(fā)生率為60%，間變性星形細(xì)胞瘤ALT的發(fā)生率更是高達(dá)65%［12］。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，ALT膠質(zhì)瘤的發(fā)生和維持與某些基因的功能異常有關(guān)，如：IDH1突變、ATRX缺失、p53突變等，提示這些基因可以成為ALT膠質(zhì)瘤治療的靶點(diǎn)［13-14］（圖1）。而最近的一些關(guān)于ALT膠質(zhì)瘤靶向治療的研究通過體內(nèi)或體外的實(shí)驗(yàn)證明了這些靶點(diǎn)的有效性。因此本文通過綜述ALT膠質(zhì)瘤的細(xì)胞及動(dòng)物模型的研究進(jìn)展，為靶向ALT膠質(zhì)瘤的研究提供可以參考的資料。

Fig.1 ATRX mutation was highly correlated with IDH1 mutation and was more common in gliomas without telomerase reverse transcriptase（TERT） activation圖1 對(duì)不同膠質(zhì)瘤患者的基因分析，ATRX突變和IDH1突變高度相關(guān)且常見于端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶沒有激活的膠質(zhì)瘤患者

1 ALT膠質(zhì)瘤細(xì)胞系模型研究進(jìn)展

ALT膠質(zhì)瘤的細(xì)胞系模型的建立對(duì)于移植瘤模型或者膠質(zhì)瘤靶點(diǎn)以及藥物篩選都有著十分重要的作用。目前已經(jīng)有多篇報(bào)道描述了ALT膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的建立過程以及通過這些細(xì)胞系模型進(jìn)行后續(xù)的藥物篩選或者做一些移植瘤模型（表1）。

Table 1 ALT glioma cell line表1 ALT膠質(zhì)瘤細(xì)胞系

由于ALT膠質(zhì)瘤的發(fā)生率較低且體外培養(yǎng)較困難，直到2015年，Jeitany等［15］首次從ALT膠質(zhì)瘤中分離出TG20細(xì)胞。他們證明了TG20具有膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的所有特征，包括神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，在NOD-SCID-IL2Rc（NSG）小鼠和裸鼠模型體內(nèi)均可以產(chǎn)生腦內(nèi)腫瘤，且ALT表型穩(wěn)定。TG20細(xì)胞以及用其構(gòu)建的小鼠模型是一種有效的ALT膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的臨床前模型，對(duì)開發(fā)針對(duì)ALT機(jī)制的抗癌策略起著十分積極的作用。作者進(jìn)一步通過該模型證明了G4體穩(wěn)定劑360B是治療ALT腫瘤的潛在藥物。此外Jeitany等［16］以TG20為模型開展了ALT相關(guān)機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)P300/CBP相關(guān)因子（PCAF）的下調(diào)使ALT細(xì)胞的T-SCE的頻率降低，而與PCAF同源的賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶GCN5（general control non-derepressible 5）的下調(diào)則會(huì)使ALT細(xì)胞的T-SCE頻率升高，提示GCN5和PCAF在調(diào)控ALT細(xì)胞端粒重組中相反的作用。他們還進(jìn)一步證明了組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑漆樹酸（anacardic acid，AA）會(huì)抑制ALT細(xì)胞中APBs和T-SCE的水平，促進(jìn)ALT細(xì)胞死亡。而且與端粒酶陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞相比，AA特異性地使人ALT腫瘤細(xì)胞對(duì)輻射敏感，這可能是由于AA降低了ALT細(xì)胞的活性導(dǎo)致的，提示賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶可能是ALT膠質(zhì)瘤治療的新靶點(diǎn)［17］。

隨著對(duì)ALT機(jī)制研究的不斷深入，目前已有研究揭示了ALT膠質(zhì)瘤的產(chǎn)生與一些基因的突變有關(guān)，如：ATRX缺失、IDH1突變、p53突變等［14］。因此，許多實(shí)驗(yàn)室通過在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中敲除這些基因得到了具有ALT表型的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，并通過這些細(xì)胞系進(jìn)行了一些靶向藥物篩選的工作。

Brosnan-Cashman團(tuán)隊(duì)［13］和Li團(tuán)隊(duì)［18］分別于2018年和2019年通過在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中對(duì)ATRX基因進(jìn)行基因敲除，成功在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中誘導(dǎo)出ALT表型。其中，Brosnan-Cashman等［13］分別在4個(gè)端粒酶陽(yáng)性人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系Mogg-UVW、SF188、U-251和UW479中進(jìn)行了ATRX基因敲除。其中U-251和UW479顯示出ALT陽(yáng)性細(xì)胞的多種特征，包括超亮的端粒DNA信號(hào)、ALT相關(guān)的PML小體和C環(huán)。然而，Mogg-UVW和SF188細(xì)胞系在對(duì)ATRX基因進(jìn)行基因敲除后沒有出現(xiàn)ALT表型，提示除了ATRX缺失外，其他基因組或表觀遺傳學(xué)事件對(duì)于腫瘤細(xì)胞中ALT機(jī)制的誘導(dǎo)也是必要的。同樣，Li等［18］通過CRISPR/Cas9在端粒酶陽(yáng)性的人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87中對(duì)ATRX基因進(jìn)行基因敲除后也誘導(dǎo)出了ALT的表型。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，ATRX和DAXX的基因敲除造成了端粒處的損傷及復(fù)制壓力，進(jìn)一步促進(jìn)了ALT表型的出現(xiàn)，表現(xiàn)為APBs和C環(huán)的水平上升，激活了ALT相關(guān)的DNA修復(fù)。但是，這種ATRX和DAXX的缺失引起的ALT相關(guān)的DNA修復(fù)并不會(huì)迅速出現(xiàn)，在作者的研究中提示，ATRX的缺失導(dǎo)致H3.3組蛋白無(wú)法正常沉積于端粒上，造成了端粒處的復(fù)制壓力，而U87細(xì)胞本身的端粒酶活性并不足以克服ATRX缺失相關(guān)的端粒功能障礙，表現(xiàn)出了生長(zhǎng)活性降低的現(xiàn)象，迫使ATRX缺陷細(xì)胞在生長(zhǎng)過程中不得不采用基于同源重組的ALT途徑作為替代的端粒維持機(jī)制。對(duì)這些新的ALT膠質(zhì)瘤細(xì)胞系進(jìn)行研究和實(shí)驗(yàn)，將進(jìn)一步加深對(duì)ALT分子機(jī)制的理解，有助于為ALT陽(yáng)性腫瘤的治療開拓新的抗癌療法。

之后，有研究人員在ATRX基因敲除或突變的基礎(chǔ)上進(jìn)一步將其他與ALT膠質(zhì)瘤高度相關(guān)的基因，如IDH1和p53同時(shí)突變，成功在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中誘導(dǎo)出ALT的表型，進(jìn)一步鎖定了誘導(dǎo)ALT膠質(zhì)瘤發(fā)生的必需基因。Mukherjee等［14］為了證明IDH1突變和ATRX丟失可能以某種方式協(xié)同作用，有效地解決端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）缺陷細(xì)胞的端粒功能障礙，并促進(jìn)膠質(zhì)瘤的形成。他們通過在TERT陰性的人星形膠質(zhì)細(xì)胞中引入病毒蛋白E6和E7，使其p53和pRB功能喪失，然后通過CRISPR系統(tǒng)對(duì)ATRX進(jìn)行基因敲除后過表達(dá)IDH1突變體，以此成功的誘導(dǎo)出了ALT表型。利用這個(gè)系統(tǒng)，作者發(fā)現(xiàn)IDH1突變會(huì)介導(dǎo)RAP1下調(diào)，RAP1作為端粒保護(hù)蛋白之一，已經(jīng)被證明會(huì)抑制HR的發(fā)生［19］，其下調(diào)促進(jìn)了功能失調(diào)的端粒處啟動(dòng)DNA損傷反應(yīng)。同時(shí)IDH1突變也下調(diào)了XRCC1的表達(dá)，XRCC1是aNHEJ途徑的關(guān)鍵組成部分［20］。因此，突變的IDH1介導(dǎo)的RAP1和XRCC1的下調(diào)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞不通過aNHEJ途徑修復(fù)功能失調(diào)的端粒，而是更依賴于HR等途徑，從而促進(jìn)ALT的發(fā)生［14］。這些發(fā)現(xiàn)有利于對(duì)ALT膠質(zhì)瘤的發(fā)生有進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，同時(shí)對(duì)ALT膠質(zhì)瘤的治療也有很重要的指導(dǎo)意義。

綜上所述，以上實(shí)驗(yàn)室通過腫瘤原代細(xì)胞培養(yǎng)或基因編輯的方法，成功建立了一些ALT膠質(zhì)瘤細(xì)胞系臨床前模型，一定程度上反應(yīng)了ALT膠質(zhì)瘤的生理和病理情況。ALT膠質(zhì)瘤細(xì)胞系臨床前模型的建立為臨床前針對(duì)ALT膠質(zhì)瘤的藥物和新療法的開發(fā)具有十分重要的作用。

2 ALT膠質(zhì)瘤小鼠臨床前模型研究進(jìn)展

盡管體外的細(xì)胞模型研究提供了許多顯著的益處，但它們具有一個(gè)主要的缺點(diǎn)，即無(wú)法模擬藥物如何與復(fù)雜器官中存在的所有分子相互作用。而體內(nèi)研究能夠解決體外研究的局限性，它能夠證明藥物對(duì)個(gè)體的影響，可以更好地體現(xiàn)出藥物在機(jī)體中和器官或者其他體內(nèi)途徑的相互作用，從而改善藥物在臨床使用前安全性、毒性和功效的測(cè)試。這有助于研究者對(duì)于人類疾病靶向藥物的研發(fā)。在膠質(zhì)瘤的臨床前抗腫瘤治療效果的研究中，使用的主要是動(dòng)物異種移植瘤模型。

然而在近十年的研究過程中，才逐漸出現(xiàn)了ALT相關(guān)的膠質(zhì)瘤小鼠模型，目前主要的方法是將臨床上獲得的病人來(lái)源的ALT膠質(zhì)瘤細(xì)胞系或者將現(xiàn)有的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系誘導(dǎo)為ALT細(xì)胞后，通過原位或異位的方法注射到SCID小鼠或裸鼠體內(nèi)，從而建立異種移植模型用于臨床前靶向藥物作用研究。Jeitany等［15］為了證明TG20細(xì)胞具有膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的所有特征，在NOD-SCID-IL2Rc（NSG）小鼠和裸鼠模型中用TG20細(xì)胞在腦內(nèi)進(jìn)行了原位移植，成功在動(dòng)物模型中形成了可以連續(xù)移植的腦腫瘤。并且進(jìn)一步在動(dòng)物模型水平上驗(yàn)證G4體穩(wěn)定劑360B對(duì)ALT膠質(zhì)瘤的抑制作用。2014年Wakimoto等［24］將20例來(lái)自臨床的IDH1突變的膠質(zhì)瘤切除的腫瘤標(biāo)本植入免疫力低下的小鼠腦內(nèi)，成瘤后進(jìn)行體外培養(yǎng)，獲得了一些細(xì)胞系，這些細(xì)胞系在組織學(xué)上都與親本腫瘤表型十分相似。其中MGG119在體外培養(yǎng)后成為了可以穩(wěn)定傳代的細(xì)胞系。雖然Wakimoto等當(dāng)時(shí)并沒有討論關(guān)于MGG119是否是ALT膠質(zhì)瘤，但在后續(xù)其他研究中，對(duì)MGG119進(jìn)行了關(guān)于ALT表型的檢測(cè)，確定了這株細(xì)胞具有ALT細(xì)胞系的特征［14］。除了ATRX、IDH1等基因和ALT的發(fā)生高度相關(guān)，其他一些基因，比如NF1和ALT的發(fā)生同樣關(guān)系密切。最近發(fā)現(xiàn)，在NF1相關(guān)腫瘤尤其是星形細(xì)胞腫瘤，ALT發(fā)生的機(jī)率比較大，且常常伴隨著ATRX突變和NF1突變［25-26］。Yuan等［22］在2022年，利用患者來(lái)源的NF1缺陷和ATRX突變的ALT神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞在裸鼠上的異種移植模型，證明了ATRi（ATR inhibitor）具有特異性抑制NF1缺陷細(xì)胞的能力ALT細(xì)胞系的能力。

雖然異種移植為顱內(nèi)腫瘤的研究提供了許多優(yōu)點(diǎn)：重復(fù)性好，生長(zhǎng)速度標(biāo)準(zhǔn)化，死亡時(shí)間和腫瘤定位方便。然而，由于用于植入的人工、侵入性手術(shù)方法以及準(zhǔn)確復(fù)制人類膠質(zhì)瘤的組織學(xué)特征的能力有限，這些模型具有花費(fèi)的時(shí)間較長(zhǎng)，成本較高，移植成功率不確定，很難完整的復(fù)制患者數(shù)據(jù)等局限性［27］。而轉(zhuǎn)基因自發(fā)腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型的出現(xiàn)在一定程度上解決了上述的問題。近幾年來(lái)，雖然還沒有成功構(gòu)建自發(fā)ALT膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型的報(bào)道，然而通過在動(dòng)物水平上進(jìn)行與ALT相關(guān)的基因的編輯，一些動(dòng)物模型表現(xiàn)出較高水平的膠質(zhì)瘤形成幾率，提示該模型具有自發(fā)形成ALT膠質(zhì)瘤的潛能。

在2016年，Koschmann等［28］通過睡美人轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)（Sleeping Beauty（SB）Transposase System）建立了ATRX基因缺陷小鼠，這種小鼠會(huì)在出生一定時(shí)間后出現(xiàn)自發(fā)的膠質(zhì)瘤，揭示了ATRX缺失對(duì)膠質(zhì)瘤腫瘤增殖的影響。這種小鼠模型可以很大程度地模擬人體自發(fā)形成腫瘤的過程，這一成果也為深入了解ATRX突變?cè)谌四X膠質(zhì)瘤中的作用提供了依據(jù)。有研究已經(jīng)提示了NF1與ALT星形細(xì)胞腫瘤發(fā)生高度相關(guān)，而2021年，Pan等［29］使用的由神經(jīng)纖維瘤病1腫瘤抑制基因(NF1)5突變驅(qū)動(dòng)的視神經(jīng)膠質(zhì)瘤（optic pathway gliomas，OPG）的小鼠模型，證明了刺激視神經(jīng)活動(dòng)會(huì)促進(jìn)視神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)，以及通過光剝奪減少視覺體驗(yàn)可以防止腫瘤的形成和維持。這種NF1基因敲除的小鼠模型表現(xiàn)出膠質(zhì)瘤高發(fā)的特性，雖然還沒有NF1小鼠確實(shí)是自發(fā)ALT腫瘤模型的報(bào)道，但他有望成為一種新型的自發(fā)ALT腫瘤小鼠模型。

3 總結(jié)與展望

由于ALT的發(fā)生機(jī)制目前還不明確，因此靶向ALT腫瘤藥物的研究較少。而在這些研究中，有相當(dāng)一部分研究都是通過上述的ALT膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型或動(dòng)物移植瘤模型完成的。如前文中提到的G4體穩(wěn)定劑360B以及組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑AA都是基于TG20細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)的具有靶向ALT活性的藥物。而ATR抑制劑VE-822、AZD6738和VE-821以及PARP抑制劑Olaparib、Talazoparib、Niraparib等都被證明在ALT膠質(zhì)瘤或者ALT膠質(zhì)瘤小鼠模型體內(nèi)具有較好的殺傷作用［22，30-31］。雖然目前ALT膠質(zhì)瘤的臨床前模型較少，但是已經(jīng)建立的這些ALT細(xì)胞模型和小鼠模型已經(jīng)在藥物篩選等方面發(fā)揮了重要作用，尤其是原代培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，能很好地反映膠質(zhì)瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)狀態(tài)，獲得的數(shù)據(jù)也更加準(zhǔn)確真實(shí)。ALT膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型能更好地反映人類腫瘤的遺傳、形態(tài)和免疫學(xué)特征。本實(shí)驗(yàn)室近幾年通過ALT相關(guān)機(jī)制的研究，也有望在自發(fā)ALT膠質(zhì)瘤小鼠模型的建立上取得突破。這些膠質(zhì)瘤小鼠模型的建立將為更詳細(xì)的研究膠質(zhì)瘤的發(fā)生過程和更準(zhǔn)確地評(píng)估治療的安全性及有效性提供了有利的條件。