楊灝穎 劉潤涵 房夢珂 劉洋* 鄭蒙*

（1）河南大學淮河醫(yī)院轉化醫(yī)學中心，開封 475004；2）河南大學生命科學學院，河南省腦靶向生物納米藥物重點實驗室，開封 475004）

1 寡核苷酸藥物是生物技術藥物的前沿

1.1 生物技術藥物和核酸類藥物的定義及分類

1.1.1 生物技術藥物

新興的生物技術（biotech）藥物是基于創(chuàng)新生物技術開發(fā)的治療藥物，生物技術藥物的開發(fā)致力于從實驗室的生物技術轉化出新的特異性高、針對性強的療法［1］。傳統(tǒng)小分子制藥工業(yè)主要基于藥物分子對靶蛋白的結合實現(xiàn)抑制/拮抗，現(xiàn)代藥物發(fā)現(xiàn)小分子藥物是應用最全面、發(fā)展最完善的藥物形式，但是受限于靶蛋白和藥物分子的結合模式，許多不含活性口袋的蛋白質(zhì)較難使用小分子抑制劑/拮抗劑進行干預，對于精細的轉錄水平激活、蛋白質(zhì)活性調(diào)節(jié)、基因突變矯正等，小分子藥物的典型作用機制也較難實現(xiàn)［2］。目前已知的疾病靶點中約有40%靶點因不具有活性口袋或典型小分子藥物作用機制被認為是不可成藥的［3］。生物技術藥物則以中心法則展開，在DNA-RNA-蛋白質(zhì)層面分別通過生物技術進行干預，包括DNA水平的基因編輯，RNA水平的轉錄干擾、沉默、過表達，蛋白質(zhì)層面的多肽、抗體、蛋白質(zhì)等生物大分子藥物對解決小分子藥物的成藥性難題和提高特異性上具有顯著優(yōu)勢。

目前生物技術藥物最成熟的是單克隆抗體（monoantibody）類藥物，單抗類藥物又向著更小分子質(zhì)量、更高特異性、更多靶點的方向發(fā)展出了雙/多特異性抗體、納米抗體、單域抗體等［4］。目前，單抗類藥物已廣泛應用于腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病的臨床治療，是國內(nèi)外生物技術藥物企業(yè)的主要盈利產(chǎn)品。單抗類藥物對抗原的識別特異性與小分子藥物相比極高，但單抗類藥物通常僅能作用于細胞表面靶點，并且分子質(zhì)量大，組織滲透能力較弱，是小分子藥物的補充。

針對許多難成藥靶點，核酸類藥物理論上可以通過理性設計針對幾乎所有mRNA和DNA序列，進而干預轉錄翻譯和蛋白質(zhì)表達，同時因核酸的堿基互補原則，其特異性也相對較高，可以通過序列優(yōu)化實現(xiàn)較低的脫靶［5］。新興的核酸（nucleic acids）類藥物近10年發(fā)展迅速，其中寡核苷酸（oligonucleotide）藥物以干擾小RNA（small interfering RNA，siRNA）/反義寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASO）為代表通過轉錄層面干預，已有多款藥物率先應用于醫(yī)療市場，許多以規(guī)律間隔成簇短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及其衍生技術為基礎的基因編輯工具也已進入臨床試驗評估階段。自2019年新型冠狀病毒感染（COVID-19）廣泛傳播以來，mRNA核酸疫苗也在全球多個國家和地區(qū)被首次應用，與此同時核酸類藥物的遞送工藝的成熟度和社會認可度也逐漸提高［6-7］。

除了特異性高以外，包括核酸類藥物在內(nèi)的生物技術藥物還具有開發(fā)周期短、成本相對較低、實驗室到臨床轉化速度快的優(yōu)勢，傳統(tǒng)小分子制藥工業(yè)依賴于高通量藥物篩選、反復多輪結構改造和生物合成純合/化學全合成，周期相對較長，技術難點多，以跨國藥企羅氏制藥為例，德勤統(tǒng)計稱羅氏通常一個新藥上市平均約需要14年時間和90億人民幣花費。生物技術藥物通常來自生物內(nèi)源機制，如應用最為廣泛的單抗類藥物、ASO藥物、siRNA藥物等，其特異性極高，并且靶點改造靈活，生產(chǎn)和制備周期短，藥物篩選階段相對較為容易，可以直接針對靶點進行結構和序列的設計。中國小分子藥物工業(yè)起步較晚，主要以仿制藥為主，小分子新藥研發(fā)上相對薄弱，生物技術藥物起步盡管也較晚，但生物技術藥物發(fā)展周期短，有望在特定方向做出特色，例如，中國單抗類藥物已經(jīng)非常成熟。生物技術藥物分子質(zhì)量一般較大、結構復雜程度高，能夠提高靶點特異性，但也導致一些應用上的瓶頸，如組織滲透能力差、靶器官生物利用率低，以及生物屏障穿越能力較差，同時生物大分子的儲存條件相對苛刻，單劑生物技術藥物的臨床使用成本相比小分子藥物較為昂貴［5］。寡核苷酸藥物和傳統(tǒng)小分子藥物以及單抗類藥物的特點對比見表1。

Table 1 Comparison of oligonucleotide drugs，small molecule drugs，and monoclonal antibody drugs，partially compiled from the reference［8］表1 寡核苷酸藥物、小分子及單抗藥物的比較，部分內(nèi)容整理自參考文獻［8］

1.1.2 核酸類藥物

核酸類藥物是新興生物技術藥物的一類，廣義上包括核酸類似物和衍生物（如一些抗病毒藥物）、寡核苷酸藥物、長鏈mRNA、核酸參與的基因編輯工具、核酸適配體等［9］。其主要利用核酸和特定靶序列的反向互補進行識別，因此可以獲得較高的特異性。干預機制則根據(jù)具體工具的形式各異，可實現(xiàn)RNA水平沉默（如siRNA/ASO），補充mRNA，DNA/RNA水平剪切、插入、替換（如CRISPR系統(tǒng)），蛋白質(zhì)水平結合（如核酸適配體），利用編碼蛋白誘發(fā)免疫反應實現(xiàn)疫苗效果等［10-11］。核酸類藥物中以寡核苷酸藥物的臨床轉化最為迅速，目前已有十余款ASO/siRNA療法獲美國FDA批準（表2），中國也有多款寡核苷酸藥物進入臨床試驗。

Table 2 Nucleic acid drugs approved for marketing by the US FDA（compiled from references［18-19，22-23］ and the FDA website）表2 美國FDA批準上市的核酸類藥物（整理自參考文獻［18-19，22-23］及FDA網(wǎng)站）

1.1.3 寡核苷酸藥物的定義及分類

寡核苷酸藥物也稱小核酸藥物，通常指經(jīng)特殊設計的短鏈核酸，通過干預靶基因的表達，用于疾病治療的目的［10］。寡核苷酸藥物是目前研究較為廣泛并且臨床轉化較為成熟的一類核酸類藥物形式。其通常具有20個以下核苷酸構成，但并非嚴格定義，有時包括30個以上核苷酸殘基組成的也被稱為寡核苷酸，其組分可以為脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。寡核苷酸療法主要包括ASO、siRNA、microRNA（miRNAs）、核酸適配體（aptamer）、CpG寡核苷酸、ADAR（RNA-editing enzyme adenosine deaminase acting on RNA）等［9-10］。根據(jù)需要寡核苷酸類藥物也可以進行修飾，以獲得器官靶向能力或更好的血液循環(huán)表現(xiàn)。

ASO是較早開發(fā)的寡核苷酸藥物，其為單鏈核酸，分子質(zhì)量6~9 ku，ASO通過經(jīng)典Watson-Crick堿基配對識別RNA序列，ASO的DNA序列與RNA結合產(chǎn)生異源雙鏈體招募RNase H1導致目標RNA切割。ASO也可以干擾mRNA成熟的拼接機制，通過與pre-mRNA相互作用，調(diào)節(jié)可變剪接和增加目標蛋白表達，因此除了沉默目標RNA，具有入核能力的ASO也可以作用于pre-mRNA用于增加蛋白質(zhì)活性。此外，ASO可以通過與特定起始密碼子結合導致翻譯停滯，mRNA表達下調(diào)進而目標蛋白下調(diào)［12］。

siRNA是雙鏈RNA分子，分子質(zhì)量約13 ku，與ASO不同，siRNA通過Watson-Crick堿基配對識別RNA序列招募RNA誘導沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC），通過催化Argonaute家族的Ago2進行mRNA切割，siRNA被認為可以沉默任何編碼蛋白質(zhì)的基因表達［13-14］。

微RNA（microRNA，miRNAs）是真核生物內(nèi)源性具有調(diào)控功能的非編碼RNA，長約21~23堿基，廣泛存在于真核生物中，通常由基因組轉錄而來，無法翻譯成蛋白質(zhì)，miRNA和靶基因mRNA堿基配對通過RISC降解mRNA或阻礙其翻譯，作用機制類似于siRNA。miRNA類似物（mimics）也具有治療潛力，而miRNA的拮抗物，理論上也可以通過抑制miRNA實現(xiàn)治療效果［15］。

核酸適配體是人工設計、體外篩選獲得的能特異結合蛋白質(zhì)或其他分子的寡聚核苷酸，可以通過DNA或RNA的高級結構實現(xiàn)結合［16］。

siRNA和ASO是目前主要的寡核苷酸療法，ASO發(fā)現(xiàn)較早，作用機制也較多，獲批上市的較多，RNAi機制起步較ASO晚，但因安全性、長效性和效率優(yōu)勢目前熱度較高。此外小激活RNA（small activating RNA，saRNA）也有候選藥物進入臨床試驗階段。寡核苷酸藥物研發(fā)的里程碑見圖1。

Fig.1 The development process and milestones of oligarchic drugs，some of which were compiled from the references［10，17］圖1 寡核苷酸藥物的發(fā)展歷程和里程碑，部分內(nèi)容整理自參考文獻［10，17］

1.2 已進入市場的寡核苷酸類藥物

近年來已有多款寡核苷酸藥物進入醫(yī)藥市場，主要針對由基因突變導致的傳統(tǒng)小分子藥物難成藥的罕見病（表2），當前研究熱點已經(jīng)覆蓋了諸如病毒性肝炎、代謝系統(tǒng)疾病、神經(jīng)退行性疾病（neurodegeneration diseases）、心血管疾病等常見?。?8］。寡核苷酸藥物自1998年首款ASO被美國食品藥品管理局（US FDA，下文簡稱FDA）獲批上市至今已有20余年，期間也經(jīng)歷了螺旋上升的發(fā)展階段［19］，2006年RNA干擾（RNA interference，RNAi）機制獲得諾貝爾生理學和醫(yī)學獎，工業(yè)界和學術界均認為其潛力巨大，但因多款RNAi藥物臨床試驗也曾折戟，一度被認為是醫(yī)藥行業(yè)的一大泡沫，隨著技術成熟多款siRNA藥物成功獲批上市，用于小核酸藥物遞送的脂質(zhì)納米顆粒（lipid nanoparticle，LNP）遞送策略和GalNAC肝靶向策略也取得了突破性進展［20］，加之自2019年COVID-19爆發(fā)后兩款代表性基于LNP的mRNA疫苗廣泛使用，工業(yè)界和學術界對核酸藥物和其遞送的興趣達到了新的高度［21］。以AlnylamPharmaceuticals為代表的眾多RNAi先驅(qū)企業(yè)也成長為市值百億美元的生物技術藥物巨頭。

1.3 器官靶向的寡核苷酸類藥物和非肝靶向核酸藥物研究趨勢

目前已上市的寡核苷酸類藥物通常避免較為困難的遞送環(huán)節(jié)，多采用直接病灶部位注射、皮下注射、肌肉注射等。研究中較為流行的器官靶向寡核苷酸類藥物遞送目前以肝臟靶向為主，尤其以N-乙酰半乳糖胺（GalNAC）偶聯(lián)修飾的肝臟靶向［24］和LNP應用最為成熟［25］（圖2）。肝臟靶向寡核苷酸藥物的成功，讓學界和工業(yè)界的研究者對肝臟靶向以外的器官靶向寄予厚望，該方向是未來的重點研究方向之一［26］。其他器官的靶向策略目前較為罕見，當前器官靶向通常采用前藥或納米遞送等策略，通過偶聯(lián)能夠識別靶器官高表達蛋白質(zhì)的基團到寡核苷酸序列上或納米載體表面，進而實現(xiàn)靶器官的富集。

Fig.2 Mainstream organ targeted delivery strategies for oligonucleic acids圖2 主流的寡核苷酸器官靶向遞送策略

2 寡核苷酸藥物在腦部疾病的應用

2.1 腦部疾病藥物開發(fā)的挑戰(zhàn)

腦部疾病的藥物開發(fā)被認為較為困難，血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）的存在、腦部生理結構以及腦組織構成細胞的特殊性是關鍵挑戰(zhàn)。BBB系統(tǒng)是指腦組織-腦脊液-毛細血管血液之間的屏障系統(tǒng)，其能夠進行營養(yǎng)物質(zhì)交換，同時阻礙了大部分非脂溶性分子的通過和幾乎所有大分子的通過，能夠阻礙病原體和血液代謝物對腦部生理環(huán)境的影響。目前已知包括阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）在內(nèi)的許多腦部疾病的發(fā)生和BBB的破壞或不完整密切相關［27］。BBB的存在也導致大部分藥物分子尤其生物大分子藥物幾乎無法通過，因此腦部疾病療法開發(fā)相對其他系統(tǒng)較為滯后［28］。此外，腦部細胞與其他體細胞具有較大差異，其免疫、代謝、結構均較為特殊，一些其他體細胞內(nèi)信號通路在腦部并非總是一致，這也是腦部疾病療法開發(fā)的困難之一［29］。

腦部疾病包括腦膠質(zhì)瘤、神經(jīng)退行性疾病、運動神經(jīng)元疾病、癲癇、腦外傷等疾病的療法都十分有限，許多疾病只有妥協(xié)療法，缺乏直接針對病因的療法。隨著研究的逐漸深入，研究者們意識到許多腦部疾病的病因和遺傳風險密切相關，或因基因突變導致，因此針對致病基因采用寡核苷酸藥物直接在轉錄水平干預被寄予厚望［30-31］。

當前已知的BBB交換主要分為：親脂小分子自由擴散；水通道、離子通道；激素、核酸、氨基酸、糖等的轉運體介導的運輸途徑；多肽、蛋白質(zhì)的受體介導的運輸途徑，以及一些人工設計的主動靶向策略（圖3）。

Fig.3 The main known pathways for substance exchange across the blood-brain barrier［32］圖3 目前已知的主要跨血腦屏障的物質(zhì)交換途徑［32］

隨著學術界對物質(zhì)跨BBB交換途徑認識的逐漸積累，一系列腦部遞送策略應運而生（圖4）。目前主要包括病毒載體、人工納米粒子、外泌體等跨BBB的遞送載體和一些輔助BBB穿越的物理、化學調(diào)節(jié)劑。當前基因治療臨床上應用最多的是腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）為載體的基因沉默和mRNA遞送，其不同血清型有一定器官靶向能力，其中AAV9常常被用作跨BBB的基因療法［33］。AAV病毒轉染能力強，一般認為是非整合病毒載體，相比其他病毒載體整合基因組風險低，因而其遺傳毒性被認為較低，但AAV病毒的有效荷載核酸有大小限制，一般裝載不超過4.7 kb的核酸［34］。此外，盡管AAV病毒的轉染效率高，但是仍然有報道稱長期AAV治療有基因組整合風險［35］，并且病毒載體存在生物體機體自體免疫的限制，導致AAV反復給藥耐藥，多次給藥成為困難［34］。除利用載體遞送以外，聚焦超聲、滲透破壞、磁場和小分子介導的機制也可以短暫地打開BBB，因有可能對組織器官造成損傷，該類策略通常用于輔助藥物輸送［36-37］。其中較為成功的案例是FDA批準的Lexiscan可通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)肌動蛋白動力學，改變細胞骨架瞬時破壞細胞緊密連接（tight junction，TJ）完整性，增加腦毛細血管內(nèi)皮細胞之間的細胞間隙進而促使藥物通過BBB，此類輔助策略的可選對象非常少，并且短暫打開BBB缺乏對物質(zhì)交換的選擇性［38］。

Fig.4 The blood-brain barrier crossing strategy of mainstream drugs［39］圖4 藥物主流的血腦屏障穿越策略［39］

人工納米顆粒相比病毒載體具有極高的靈活性，其表面可被修飾多種靶向分子或探針，研究中通過聚乙二醇（PEG）偶聯(lián)抗體、多肽、小分子、核酸適配體等功能性分子在實驗室中已經(jīng)成功賦予了納米顆粒靶向能力，也被廣泛用于寡核苷酸藥物的腦部遞送研究。納米載體主要包括脂質(zhì)納米載體、聚合物納米載體、病毒納米載體、生物膜來源納米載體、外泌體、無機納米載體等［40-41］。為了實現(xiàn)器官靶向和BBB穿越，轉運體介導的內(nèi)吞和受體介導的內(nèi)吞被廣泛地應用在納米載體上。納米載體穿越BBB的方式主要包括細胞緊密連接開放、受體介導的轉胞吞作用（receptor-mediated transcytosis，RMT）、細胞介導的轉運、載體介導的轉運和吸附介導的轉胞吞作用等，其中RMT是最常見的策略［42］。RMT借助腦部內(nèi)皮細胞受體的識別作用，對一系列物質(zhì)選擇性地進行囊泡運輸，從而實現(xiàn)BBB穿越，這些物質(zhì)包括轉鐵蛋白、胰島素、低密度脂蛋白（LDL）、瘦素等，均可以通過RMT進入腦部。目前認為配體修飾的納米藥物可以首先與內(nèi)皮細胞表面的跨膜受體結合，形成細胞內(nèi)囊泡并穿梭至內(nèi)皮細胞另一側發(fā)生胞吐作用，進而將納米藥物釋放到腦實質(zhì)中［42］。

目前研究者們已鑒定出一系列能夠促進腦部積累、穿越BBB的靶向基團，包括多肽、轉鐵蛋白、葡萄糖、半乳糖、氨基酸等［43］，以糖轉運體為例，研究發(fā)現(xiàn)，將葡萄糖、半乳糖修飾在納米載體或抗體表面后，修飾后的物質(zhì)可以通過轉運體介導的內(nèi)吞途徑穿越BBB，并且在短暫節(jié)食后給予血糖補充可以顯著提高轉運效率［44］。類似的一些本身具有BBB穿越能力的物質(zhì)被修飾于遞送載體表面也可以促進BBB的穿越，但值得一提的是，這些新的偶聯(lián)物未必僅依賴其原有的受體或轉運體進行內(nèi)吞。當開發(fā)腦靶向遞送系統(tǒng)時，受體介導的內(nèi)吞是一種經(jīng)典策略，借鑒“配體-受體”結合模式，將配體修飾在遞送物表面，或?qū)⑹荏w結合多肽/小分子等修飾于被遞送物表面，已被用于開發(fā)多種腦靶向遞送策略（圖5）。由于多肽的合成和修飾工藝成熟、便于保存、反應條件要求不苛刻，使得靶向多肽成為了非常熱門的修飾策略，研究者篩選出了相當多的腦靶向多肽用于促進被修飾物的腦部積累［45］。相比多肽，抗體用作靶向修飾則對反應條件溫和程度要求較高，并且儲存條件也更加苛刻，不過由于抗體對靶蛋白的親和力極高，目前有不少研究者在通過納米抗體、單域抗體等方式縮小抗體的分子質(zhì)量以期待在靶向遞送中能有更好的表現(xiàn)。此外，一些蛋白質(zhì)本身也可以充當遞送載體，如轉鐵蛋白由于其具有籠式結構也被用于工程化改造以促進所裝載藥物的腦部遞送［39］。更多腦部特異性受體和轉運體的發(fā)現(xiàn)會非常有助于腦部藥物遞送領域的發(fā)展。

Fig.5 Common surface modifications of nanoparticles and targeted receptors for crossing the blood-brain barrier［46-47］圖5 納米顆粒常見的表面修飾和用于穿越血腦屏障的靶向受體［46-47］

2.2 衰老相關腦部疾病的研究進展和核酸治療靶點

寡核苷酸類藥物目前已有十余款應用于醫(yī)療市場，眾多在臨床試驗進行評估，其中通過皮下注射和靜脈注射給藥的疾病以肝臟疾病占比較高，原因之一是肝臟是最主要的代謝場所，藥物具有較高的肝臟富集。為了實現(xiàn)寡核苷酸藥物的腦部遞送，需要首先針對BBB進行攻堅。

目前的主流策略主要分為靶向基團對寡核苷酸的直接修飾和納米遞送策略［48-49］。寡核苷酸理論上可以在特定位點（不限于末端）進行一系列修飾以實現(xiàn)腦部靶向，同時在靶向基團和寡核苷酸之間可以進行條件響應斷裂基團的設計，以實現(xiàn)在病灶部位使寡核苷酸完全暴露并發(fā)揮作用，避免靶向基團對寡核苷酸產(chǎn)生空間位阻影響作用效果［50］。納米遞送策略則主要以納米載體通過電荷裝載核酸類藥物，并通過納米系統(tǒng)表面腦靶向修飾或其生物物理特性進行腦部遞送。相關研究目前較為火熱，但是目前腦部靶向遞送策略在臨床上仍然較為罕見。對于寡核苷酸藥物遞送包括本課題組在內(nèi)的一些研究者采用了自組裝球形核酸［51-53］結構，一項以金納米顆粒為核心的球形siRNA核酸藥物NU-0129［54］，已經(jīng)進入了早期一期臨床試驗，通過沉默BCL2L12基因用于評價復發(fā)性惡性腦膠質(zhì)瘤的治療效果（臨床試驗ID：NCT03020017）。這一臨床試驗是寡核苷酸藥物腦部治療較為前沿的探索。更多前沿研究案例和核酸治療靶點，將在隨后的具體疾病模型中展開綜述（表3）。

Table 3 Oligonucleotide treatment targets for different age-related diseases表3 不同衰老相關疾病的寡核苷酸治療靶點

衰老相關腦部疾病的治療靶點因疾病不同而異，目前主要的衰老相關腦部疾病主要包括神經(jīng)退行性疾病和腦腫瘤［55-56］。最為常見的神經(jīng)退行性疾病包括AD、帕金森病（Parkinson’s disease，PD）均與個體衰老密切相關，并且其有效的療法極為有限。AD以神經(jīng)元丟失、意識和記憶喪失為特征，是目前患病人群基數(shù)最大的神經(jīng)退行性疾病，β淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）堆積形成的斑塊、Aβ前體蛋白的基因突變、tau蛋白的過度磷酸化、載脂蛋白E4（APOE4）的突變、神經(jīng)炎癥、細胞衰老均被認為是AD的重要原因［57］。在這些靶點中，以淀粉樣蛋白假說研究最久、較為深入。Aβ肽的纖維沉積物形成的淀粉樣蛋白斑塊通常在AD患者腦內(nèi)可見，也有研究表明淀粉樣蛋白對神經(jīng)元的毒性［58］。目前Aβ也是AD研究較為清楚的寡核苷酸藥物可干預靶點，針對Aβ斑塊形成過程中關鍵的β分泌酶1（β-secretase 1，BACE-1），有研究通過偽裝半乳糖到聚合物納米顆粒表面遞送了BACE-1的siRNA并且緩解了Aβ轉基因小鼠的AD病情［44］，此外，通過一種具有腦靶向能力的CGN多肽修飾的一種荷載BACE-1siRNA的納米載體也表現(xiàn)出了對AD小鼠模型的療效［59］。近兩年FDA批準了兩款干預Aβ斑塊形成的單抗，但其大規(guī)模人群上的療效尚無確鑿數(shù)據(jù)，并且也存在一定安全性的爭議［60］，寡核苷酸藥物和單抗各有利弊（表1），目前單抗用于AD治療的主要擔憂是抗體帶來的微血管出血和腦水腫風險［61］，有較多研究聚焦在如何盡可能保留抗體功能性結構縮小分子質(zhì)量，以降低安全風險，而寡核苷酸藥物安全性的擔憂主要是脫靶，不過由于寡核苷酸的序列多變，在優(yōu)化上更加靈活。此外，AD的病因復雜、人群異質(zhì)性高，針對Aβ形成的療法未必適合所有患者，也有研究發(fā)現(xiàn)，一些AD患者的病情與Aβ并無直接關系［62］，除Aβ假說外，APOE4風險等位基因，tau蛋白相關的纖維纏結以及神經(jīng)炎癥也是主流AD病因假說。tau蛋白相關的纖維纏結目前主要認為是tau蛋白的翻譯后修飾問題［63］，其促進了Aβ誘導的神經(jīng)毒性［64］；而APOE4作為最重要的AD遺傳風險等位基因，被發(fā)現(xiàn)會損害Aβ的清除［65］，也和BBB的完整性和神經(jīng)炎癥有關［66］，目前有研究提示通過ASO調(diào)控載脂蛋白受體2（APOE-R2）的剪切變體對AD鼠有一定療效［67］，此外也有一項臨床研究在評價通過ASO去降低tau的水平［68］。綜上，盡管有一些研究案例和早期臨床研究，目前還沒有理想的寡核苷酸藥物策略用于AD的治療。由于AD的病理機制還存在大量未知，未來可能在病理機制逐漸清晰的過程中有更多寡核苷酸藥物干預機會。

PD是最常見的衰老相關運動障礙，其特征是逐漸喪失多巴胺能神經(jīng)元，并被發(fā)現(xiàn)與中腦中的α突觸核蛋白（α-Synuclein，編碼基因SNCA）的突變和α突觸核蛋白異常積累密切相關。PD是一種嚴重的神經(jīng)退行性疾病，目前可通過手術和小分子藥物加以控制，但無法治愈。針對α突觸核蛋白的寡核苷酸藥物目前認為是較為有前景的策略。有研究者通過顱內(nèi)原位注射SNCA的ASO［69-70］或原位注射聚乙烯亞胺包裹的SNCAsiRNA至PD小鼠腦內(nèi)，發(fā)現(xiàn)對病情有緩解效果［71］，另一組研究者通過鼻腔給藥將ASO遞送至小鼠腦內(nèi)也取得了正向收益［72］。也有研究者通過腦靶向RVG多肽修飾的外泌體將SNCA的siRNA遞送至小鼠腦內(nèi)，也成功降低了α突觸核蛋白表達量［73］。除了SNCA靶點，富亮氨酸重復激酶2（leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2）的激活也和PD有關，有研究者通過對幼鼠原位注射ASO干預PD進程［74］。此外，針對神經(jīng)毒性和氧化自由基壓力，有研究者通過KEAP1的siRNA降低了腦部活性氧，并部分保護了經(jīng)典PD造模神經(jīng)毒性藥物MPTP誘發(fā)的神經(jīng)毒性［75］。綜上，目前已經(jīng)有一些研究通過納米載體將SNCA的siRNA成功遞送至腦內(nèi)，但是目前研究者聚焦的挑戰(zhàn)是PD治療需要精準遞送至病灶腦區(qū)和功能性細胞，即多巴胺能神經(jīng)元的有效遞送。

膠質(zhì)瘤（glioma）是一種和年齡相關的惡性腫瘤，具有高復發(fā)、高死亡率，其標準療法主要是手術結合放化療。膠質(zhì)瘤的一線藥物主要是烷化劑類廣譜抗腫瘤藥物替莫唑胺，受限于BBB，膠質(zhì)瘤的可用藥物選擇少，常面臨耐藥的問題［76］。針對藥物選擇少這一挑戰(zhàn)，寡核苷酸藥物在膠質(zhì)瘤治療中的研究具有一定優(yōu)勢，也產(chǎn)生了一系列具有代表性的針對熱門腫瘤靶點進行的不同載體的寡核苷酸藥物遞送。外泌體作為生物相容性較高的納米載體也被廣泛應用于膠質(zhì)瘤的寡核苷酸藥物遞送研究，比如有研究通過神經(jīng)干細胞的外泌體遞送了STAT3的ASO［77］，也有研究者通過血紅素加氧酶結合多肽修飾的裝載了STAT3基因的siRNA的間充質(zhì)干細胞來源外泌體用于耐藥膠質(zhì)瘤靶向［78］，以及使用T7肽裝飾的外泌體向大腦輸送microRNA-21的ASO［79］。因外泌體可以來源于患者本身，而且具有一定病灶遷移能力，因而被認為是較為理想的低毒性個性化遞送載體，在眾多靶向遞送策略中展現(xiàn)出優(yōu)勢［80-81］。實際上針對膠質(zhì)瘤的寡核苷酸遞送策略近些年非?；馃?，許多明星腫瘤靶點如胰島素樣生長因子1（IGF-1）受體也被用作寡核苷酸藥物的靶點，并協(xié)同增強了T細胞的抗腫瘤反應［82］，轉化生長因子β（TGF-β）也被用作膠質(zhì)瘤的寡核苷酸藥物靶點［83］。研究者也在不斷豐富遞送載體的多樣性，如通過聚合物載體設計活性氧響應性釋放的寡核苷酸遞送載體，用于PLK1基因的siRNA沉默［84］。此外，給藥途徑也有多重選擇，如有研究通過陽離子納米乳液作為CD73-siRNA的遞送系統(tǒng)進行鼻腔給藥［85］，鼻腔給藥在動物模型上經(jīng)常取得優(yōu)秀的表現(xiàn)，但是必須注意的是，小鼠的嗅球相對體重要遠超人類，在人體中鼻腔給藥能否達到理想的效果需要進一步的實驗證據(jù)。綜上，對于膠質(zhì)瘤的寡核苷酸藥物應用研究較為豐富，在載體形式、靶向遞送基團、可控釋放、給藥途徑等多方面均有研究，但是目前尚無進入晚期臨床試驗的膠質(zhì)瘤寡核苷酸藥物，主要挑戰(zhàn)依然是提高遞送載體安全性、提高病灶有效積累、降低肝臟積累、提高血液循環(huán)穩(wěn)定性以及降低治療成本。

2.3 衰老是腦部疾病的可干預對象

腦部疾病藥物開發(fā)的挑戰(zhàn)除了BBB和特殊的組織構成以外，其病因也極為復雜，不同病理之間相互影響，針對單一靶點進行藥物開發(fā)因疾病在人群上的異質(zhì)性導致療效差異較大。隨著研究的積累，個體衰老（ageing）和細胞衰老（cellular senescence）在近10年中被越來越廣泛地研究，研究者意識到衰老本身是許多腦部疾病的誘因，并且在不同衰老相關疾病中有相似的生理病理過程［86-87］。高齡和細胞衰老在神經(jīng)退行性疾病［88］和膠質(zhì)瘤［89］中均被認為是風險因素。包括基因組不穩(wěn)定、表觀遺傳改變、細胞通訊改變、干細胞耗竭、細胞衰老、線粒體功能失調(diào)、營養(yǎng)感受器失調(diào)、蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)丟失、端粒損傷等衰老相關病理過程均在神經(jīng)退行性疾病和膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色（圖6）［88］。這些病理改變產(chǎn)生了相當多的潛在靶點，也產(chǎn)生了相當多的小分子藥物難成藥靶點。小核酸藥物針對這些難成藥靶點展現(xiàn)出了成藥性的優(yōu)勢。

Fig.6 Aging is a contributing factor to neurodegenerative diseases （with reference to the image from［88］）圖6 衰老是神經(jīng)退行性疾病的誘因（圖片參考文獻［88］）

盡管針對衰老相關疾病寡核苷酸藥物展現(xiàn)出了靶點選擇上的豐富性，但是當前針對衰老過程的可干預靶點仍然比較有限。已有較為充分的證據(jù)說明衰老是多種疾病的誘因，也細化了個體衰老和器官衰老中的一些典型分子事件，但因衰老是進行性、系統(tǒng)性的，也存在較大的人群異質(zhì)性和器官異質(zhì)性，衰老的生物學認識還有待深入研究。目前較為成熟的認識是隨著個體衰老，衰老細胞的積累也會通過旁分泌持續(xù)性產(chǎn)生慢性炎癥微環(huán)境，而慢性炎癥本身也是衰老的誘因之一，也會誘發(fā)疾病的發(fā)生發(fā)展［90］，因此針對炎癥信號通路可以進行干預［91］。炎癥因子以蛋白質(zhì)形式在細胞通訊和調(diào)控生理狀態(tài)中也扮演一定積極作用，因此需要短期調(diào)控炎癥信號。目前針對急性炎癥，通常選用單抗類藥物，寡核苷酸藥物的應用相對較少，但對于腦部疾病包括腦外傷在內(nèi)，慢性神經(jīng)炎癥的貢獻都被認為較大，因此寡核苷酸藥物抗神經(jīng)炎癥方面也同樣具有潛力［92-94］。炎癥信號網(wǎng)絡極為復雜，在不同疾病、甚至同一疾病的不同病程都有較大的異質(zhì)性，而近期研究發(fā)現(xiàn)髓系細胞觸發(fā)受體2（trigger receptor expressed on myeloid cells-2，TREM2）在神經(jīng)炎癥和退行性疾病中發(fā)揮了較為廣譜的作用，TREM2激活會誘發(fā)神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元凋亡，也有研究表明，通過TREM2的沉默有助于改善神經(jīng)炎癥［95］，因此提供了一個可干預靶點。

此外，衰老細胞的堆積也會導致器官功能的衰退，近期研究發(fā)現(xiàn)清除衰老細胞對緩解衰老相關腦部疾病有收益［96-97］，因此衰老細胞本身也成為了較為新穎的可干預對象之一，并且針對衰老細胞殺傷藥物的研究成為了近年的熱點［98-99］。目前較為成熟的清除衰老細胞的策略是通過抑制衰老細胞抵抗凋亡的核心BCL2、BCL-xl/w等信號通路，誘發(fā)衰老細胞凋亡，此類靶點的寡核苷酸藥物也有一定潛力［100］。但通過寡核苷酸藥物殺傷衰老細胞緩解神經(jīng)退行性疾病的研究尚少，對于慢性神經(jīng)退行性疾病而言，此類療法的收益和風險還需要謹慎討論。此外，細胞衰老和衰老相關炎癥因子對腦部衰老相關疾病的貢獻是長期的，也和其他病理事件協(xié)同作用，因此多靶點干預的寡核苷酸藥物的雞尾酒療法（cocktail therapy）也被認為在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有潛力［101］。

3 挑戰(zhàn)和展望

寡核苷酸藥物理論上可以實現(xiàn)高特異性而且?guī)缀跛泻怂嵝蛄芯梢员辉O計成為靶點，因此避免了小分子藥物和單抗藥物靶點的成藥性限制。成功應用于醫(yī)療市場的寡核苷酸藥物也給了研究者更多信心去開發(fā)更多靶點和更多器官靶向的寡核苷酸藥物［102］。目前寡核苷酸藥物應用于腦部疾病的挑戰(zhàn)仍然存在，其相對較大的分子質(zhì)量，攜帶的陰離子電荷，以及血液和組織中的核酸酶使得其進入細胞和發(fā)揮有效功能的效率較低。盡管遞送系統(tǒng)的開發(fā)解決了部分問題，如病毒載體的和非病毒遞送系統(tǒng)能夠保護核酸免于被循環(huán)系統(tǒng)中的核酸酶降解，并最大限度地輸送到靶細胞，盡量減少組織、細胞水平的脫靶，但仍然存在提高的空間。

病毒介導的遞送療法是當下臨床試驗中較為熱門的選擇，也已有多款AAV載體的基因治療獲批上市，病毒遞送載體的細胞轉染效率通常較高，并且AAV根據(jù)血清型有一定的組織特異性［103］，因此也受到研究者的青睞，但病毒載體可能會由于預先存在的免疫導致失效或再次給藥失效，并且存在隨機整合至基因組上的安全風險，與此同時病毒載體也存在裝載核酸的分子質(zhì)量限制和造價昂貴的問題［9］。

非病毒遞送載體在近些年隨著技術成熟激發(fā)了學術界和工業(yè)界越來越多的興趣［104］，從早期的脂質(zhì)體到包含可電離脂質(zhì)（ionizable lipid）的脂質(zhì)納米顆粒［105-106］，核酸藥物包裝效率和穩(wěn)定性都得到了提高，脂質(zhì)納米顆粒曾經(jīng)也經(jīng)歷了治療窗口狹窄的問題，遞送的藥物劑量提高的同時，毒性也顯著提高。以Alnylam為代表的一系列RNAi企業(yè)后續(xù)開發(fā)了一系列新型脂質(zhì)分子，如MC3，一定程度上解決了治療窗口窄的問題，并催生了首款獲得FDA批準上市的RNAi療法Patisiran［107］。肝臟以外組織的靶向遞送是目前的研究難點和熱點［108］。

除了LNP以外，GalNAC偶聯(lián)的核酸藥物在肝臟靶向上也取得了成功，目前全球寡核苷酸藥物發(fā)展火熱，相關遞送技術核心專利如LNP和GalNAC-siRNA主要為美國企業(yè)所有，中國大陸也有少數(shù)藥企和生物技術企業(yè)開發(fā)了擁有自主知識產(chǎn)權的遞送技術平臺，未來在器官靶向、更高的遞送效率、材料的安全性方面中國企業(yè)有望實現(xiàn)差異化發(fā)展。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Alnylam后續(xù)又開發(fā)了新的十六烷基（C16）脂質(zhì)用于偶聯(lián)siRNA以實現(xiàn)鞘內(nèi)給藥［109］，這一策略也有望為寡核苷酸藥物的腦部遞送提供新的臨床應用的機遇。此外，近期外泌體研究也較為火熱，因外泌體是可從自體細胞獲取的天然納米顆粒，其生物相容性較高，而且一些細胞來源的外泌體本身也具有一定的BBB穿越能力和病灶部位遷移能力，因此解決生產(chǎn)上的質(zhì)量控制和更高載藥效率問題后，也是極有潛力的腦部遞送載體［80-81］。

寡核苷酸藥物除了靶向難題以外，臨床轉化中化學生產(chǎn)和質(zhì)量控制（chemical manufacturing and control，CMC）過程也是難點之一，其大規(guī)模制備、質(zhì)控、純化是難點。小核酸藥物合成過程中的不完整寡核苷酸，脫保護不完全的產(chǎn)物均較難純化和分離，這些化學修飾、雜質(zhì)也是毒性產(chǎn)生的原因之一［110］。小核酸藥物的藥效學、藥代動力學、安全性評價也與小分子和單抗較為不同，目前沒有統(tǒng)一的標準［10］。此外，盡管核酸類藥物被認為特異性較高，但仍然存在安全性擔憂，因藥理作用放大而引起的在靶（on-target）毒性，以及序列和理化性質(zhì)帶來的脫靶（off-target）毒性以及遞送系統(tǒng)的材料毒性都需要嚴謹評價，其毒理研究與生物制品或者化學藥物的非臨床安全性評價或有較大差異，此外也需要注意核酸類藥物的遺傳生殖毒性［111］，這些挑戰(zhàn)是當前繼續(xù)攻堅的主要方向（圖7）。

Fig.7 Research trends and application challenges in oligonucleotide drug delivery圖7 寡核苷酸藥物遞送的研究趨勢和應用挑戰(zhàn)