陳偉棠 俞淵 龐澆安 李敏鵬 潘孟 陸世鋒 楊文 滕金豪 葉桂源

原發(fā)性肝內(nèi)膽管結(jié)石是指發(fā)生于左右肝管匯合部位以上的肝膽管結(jié)石,是我國(guó)常見(jiàn)的良性膽道疾病,具有發(fā)病隱匿、病變復(fù)雜、術(shù)后殘石復(fù)發(fā)高等特點(diǎn)[1]。該病早期易繼發(fā)膽管炎癥、膽道出血、化膿性膽道炎、梗阻性黃疸等,病程晚期可并發(fā)膽汁性肝硬化、肝實(shí)質(zhì)損壞甚至膽管癌等危重并發(fā)癥,嚴(yán)重影響患者的生命安全[2]。流行病學(xué)顯示:該病的好發(fā)年齡群體主要為35歲至75歲[3],男女之間發(fā)病率無(wú)明顯差異,而在國(guó)家和種族人群之間存在差異,東亞地區(qū)發(fā)病率約占25%,歐美發(fā)病率約為1%[4]。中國(guó)是膽結(jié)石發(fā)病的重災(zāi)區(qū)國(guó)家之一,膽結(jié)石的發(fā)病率可占所有疾病的10%,而肝膽管結(jié)石的發(fā)病率約占膽石病的30%[2]。

相關(guān)研究證實(shí):肝膽管結(jié)石的發(fā)病機(jī)制涉及多種因素和多個(gè)環(huán)節(jié),常見(jiàn)的病因主要有膽道感染、膽管炎、膽汁淤積以及膽管解剖變異等因素[5],其中以感染致結(jié)石最為顯著。本課題組前期已證實(shí):大黃靈仙方可有效預(yù)防肝內(nèi)膽管結(jié)石的形成及術(shù)后復(fù)發(fā),改善膽管微環(huán)境,降低膽道感染發(fā)生幾率,使膽管恢復(fù)到非炎性狀態(tài),其機(jī)制可能與調(diào)控Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)/髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)信號(hào)通路和激活核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信號(hào)通路相關(guān)炎癥因子的表達(dá)水平有關(guān)[6-7]。而白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶(interleukin-1 receptor-associated kinase,IRAK)-1、IRAK-4以及成纖維生長(zhǎng)因子激活酶1MAP3KT結(jié)合蛋白2(TGF-3 activator 1 map3KT-binding protein 2,TAB2)作為上述信號(hào)軸的下游信號(hào)分子,在該通路中具有正向傳導(dǎo)信號(hào)的作用,與骨關(guān)節(jié)炎、胃腸道炎癥、癌癥等疾病密切相關(guān)。但在膽管炎癥中,通過(guò)調(diào)控IRAK-1、IRAK-4以及TAB2的異常表達(dá),緩解和抑制膽管細(xì)胞炎癥反應(yīng),預(yù)防肝膽管結(jié)石的形成及術(shù)后復(fù)發(fā),尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)研究。為進(jìn)一步完善大黃靈仙方修復(fù)膽管細(xì)胞炎癥損傷的作用靶點(diǎn),本課題通過(guò)內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)構(gòu)建膽管炎癥大鼠模型,推測(cè)大黃靈仙方可能通過(guò)調(diào)控IRAK-1、IRAK-4和TAB2的異常表達(dá),抑制膽管系統(tǒng)炎癥損傷,進(jìn)而防治肝膽管結(jié)石。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠45只,平均鼠齡6周,體質(zhì)量:160～200 g。購(gòu)買(mǎi)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證號(hào)SCXK(湘)2019-0004],飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)仙葫校區(qū)動(dòng)物房,室溫20～24℃,濕度45%～55%。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)同意通過(guò),相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作均按照動(dòng)物倫理審查標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格進(jìn)行,批準(zhǔn)號(hào)DW20191017-023。

1.2 動(dòng)物分組

45只大鼠隨機(jī)分為9組:空白組、模型組、大黃靈仙顆粒組、NF-κB阻斷劑組、p38MAPK阻斷劑組、NF-κB阻斷劑+p38MAPK阻斷劑組、NF-κB阻斷劑+大黃靈仙顆粒組、p38MAPK阻斷劑+大黃靈仙顆粒組、NF-κB阻斷劑+ p38MAPK阻斷劑+大黃靈仙顆粒組,每組大鼠5只。本課題均在廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院7樓實(shí)驗(yàn)操作室進(jìn)行操作。

1.3 主要藥物與器材

大黃靈仙方:生大黃15 g、威靈仙30 g、金錢(qián)草30 g、黃芪30 g、芒硝10 g、澤蘭15 g、柴胡12 g、郁金12 g、雞內(nèi)金12 g、枳殼12 g、磁石10 g、炙甘草5 g,經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科按相當(dāng)量換算配為顆粒劑,所有中藥顆粒劑均由江陰天江藥業(yè)有限公司提供,LPS、p38絲裂活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路阻斷劑、p38MAPK信號(hào)通路阻斷劑、NF-κB信號(hào)通路阻斷劑(均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司,批號(hào)分別為L(zhǎng)4391-1MG、IC50-17、5108-96-3),IRAK4 Antibody、TAB2(C88H10)Rabbit mAb(均購(gòu)于美國(guó)CST公司,批號(hào)分別為:4363、3745)、Mouse Anti-βactin mAb(購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,批號(hào):TA-09)、IRAK-1 Antibody(購(gòu)于Santa Cruz公司,批號(hào)sc-5288),羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG(均購(gòu)于Proteintech公司,批號(hào)分別為SA00001-2、SA00001-1),PVDF膜浸潤(rùn)活化液、特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(均購(gòu)于上海碧云天,批號(hào)分別為P0021S、P0018AS)。

1.4 造模與給藥

大鼠膽管炎癥模型參考文獻(xiàn)進(jìn)行,在膽總管一次注射5 mg/kg LPS以構(gòu)建肝內(nèi)膽管感染動(dòng)物模型[8]。根據(jù)等效劑量系數(shù)折算法及前期研究基礎(chǔ),大鼠劑量=6.3×成人的臨床劑量,最終確定大黃靈仙顆粒給藥劑量320 mg/kg。具體造模如下:(1)空白組:第1～7天予蒸餾水灌胃(2次/天,灌胃量為2 mL/100 g)(2)模型組:第1～3天予蒸餾水灌胃(2次/天,灌胃量為2 mL/100 g),第4天在膽總管注射LPS以構(gòu)建肝內(nèi)膽管炎癥大鼠模型,第5～7天繼續(xù)予蒸餾水。(3)大黃靈仙顆粒組、NF-κB阻斷劑組、p38MAPK阻斷劑組、NF-κB阻斷劑+p38MAPK阻斷劑組:第1～3天予分別行320 mg/kg大黃靈仙顆粒、120 mg/kg NF-κB信號(hào)阻斷劑、10 mg/kg p38MAPK信號(hào)阻斷劑、120 mg/kg NF-κB信號(hào)阻斷劑聯(lián)合10 mg/kg p38MAPK信號(hào)阻斷劑進(jìn)行腹腔注射(1次/天,連續(xù)干預(yù)3天),第4天在膽總管注射LPS 以構(gòu)建肝內(nèi)膽管炎癥大鼠模型,第5～7天繼續(xù)予大黃靈仙方灌胃;(4)NF-κB阻斷劑+大黃靈仙顆粒組、p38MAPK阻斷劑+大黃靈仙顆粒組、NF-κB阻斷劑+ p38MAPK阻斷劑+大黃靈仙顆粒組:第1～3天予大黃靈仙方灌胃(2次/天,灌胃量為2 mL/100 g)并分別予120 mg/kg NF-κB信號(hào)阻斷劑、10 mg/kg p38MAPK、120 mg/kg NF-κB信號(hào)阻斷劑聯(lián)合10 mg/kg p38MAPK信號(hào)阻斷劑進(jìn)行腹腔注射(1次/天,連續(xù)干預(yù)3天),第4天在膽總管注射LPS以構(gòu)建肝內(nèi)膽管炎癥大鼠模型,第5～7天繼續(xù)予大黃靈仙方灌胃;(5)第7天灌胃結(jié)束后禁食禁水12小時(shí),隨后無(wú)菌操作下取材,各組大鼠在造模和干預(yù)期間無(wú)死亡。

1.5 標(biāo)本采集及方法

大鼠術(shù)前12小時(shí)禁食禁水,使用3%戊巴比妥鈉4 mg/100 g腹腔注射麻醉大鼠,隨后腹部去毛,置于無(wú)菌手術(shù)臺(tái)上在劍突下作橫行切口,經(jīng)全身肝素化、灌注預(yù)熱后,大鼠肝臟由紅褐色變成土黃色,在顯微鏡下剔除多余的肝臟組織,保留完整的膽管樹(shù),進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)、蛋白免疫印跡法(Western blot,WB)等相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.6 觀察指標(biāo)及方法

1.6.1 RT-qPCR技術(shù)檢測(cè) IRAK-4、IRAK-1、TAB2 mRNA表達(dá)情況 (1)引物合成。各基因及內(nèi)參基因β-actin引物采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì),見(jiàn)表1。(2)檢測(cè)方法。采用Trizol法從膽管樹(shù)中提取總RNA,于超微量紫外線光度儀分析RNA濃度、純度及完整性,提取質(zhì)量:OD260/OD280應(yīng)在1.8～2.0之間;按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄從而獲得 cDNA;依據(jù)熒光定量PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),檢測(cè) IRAK-4、IRAK-1、TAB2 mRNA表達(dá)量,最終采用2-△△ct計(jì)算。

表1 目的基因熒光定量PCR引物序列

1.6.2 WB技術(shù)檢測(cè)IRAK-1、IRAK-4、TAB2蛋白表達(dá)水平 剪取等體積膽管樹(shù)研磨,用移液槍吸取1 mL細(xì)胞裂解液加入研磨管后置于冰上充分研磨,待組織完全裂解后轉(zhuǎn)移至EP管中4℃離心取上清液,采用BCA法測(cè)定蛋白含量。制備SDS-PAGE凝膠,電泳分離蛋白濕轉(zhuǎn)模式下將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封PVDF膜然后加入相應(yīng)一抗:β-actin(1∶2 000)、IRAK-4(1∶1 500)、IRAK-1(1∶1 500)、TAB2(1∶1 500),4℃冰箱中孵育過(guò)夜?；厥找豢?TBST洗PVDF膜,加入二抗(1∶10 000),室溫孵育1小時(shí)后用TBST 洗滌3次。超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行檢測(cè),Image J軟件計(jì)算各組蛋白條帶與β-actin的灰度值比值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大黃靈仙方對(duì)IRAK-4、IRAK-1、TAB2蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較,模型組的IRAK-1、IRAK-4、TAB2的蛋白表達(dá)量升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,大黃靈仙顆粒組、p38MAPK阻斷劑組、NF-κB阻斷劑組、NF-κB阻斷劑+p38MAPK阻斷劑組、NF-κB阻斷劑+大黃靈仙顆粒組、NF-κB阻斷劑+ p38MAPK阻斷劑+大黃靈仙顆粒組的IRAK-1、IRAK-4、TAB2的蛋白表達(dá)量降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與大黃靈仙顆粒組比較,NF-κB阻斷劑+大黃靈仙顆粒組、NF-κB阻斷劑+ p38MAPK阻斷劑+大黃靈仙顆粒組的IRAK-1、IRAK-4、TAB2的蛋白表達(dá)量下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1,表2。

注:A為空白組;B為模型組;C為大黃靈仙顆粒組;D為p38MAPK阻斷劑組;E為NF-κB阻斷劑組;F為NF-κB阻斷劑+p38MAPK阻斷劑組;G為p38MAPK阻斷劑+大黃靈仙顆粒組;H為NF-κB阻斷劑+大黃靈仙顆粒組;I為NF-κB阻斷劑+ p38MAPK阻斷劑+大黃靈仙顆粒組。

表2 IRAK4、IRAK1、TAB2蛋白表達(dá)情況鼠只=5)

2.2 大黃靈仙方對(duì)IRAK-4、IRAK-1、TAB2 mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較,模型組的IRAK-1、IRAK-4、TAB2 mRNA表達(dá)量升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,大黃靈仙顆粒組、p38MAPK阻斷劑組、NF-κB阻斷劑組、NF-κB阻斷劑+p38MAPK阻斷劑組、NF-κB阻斷劑+大黃靈仙顆粒組的IRAK-1、IRAK-4、TAB2 mRNA表達(dá)量下降(P<0.05),NF-κB阻斷劑+p38MAPK阻斷劑+大黃靈仙顆粒組的TAB2 mRNA表達(dá)量下降(P<0.05);與大黃靈仙顆粒組比較,NF-κB阻斷劑+p38MAPK阻斷劑組的IRAK-1、IRAK-4、TAB2 mRNA表達(dá)量下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3,圖2、3、4。

圖2 IRAK-1的擴(kuò)增曲線與溶解曲線

圖4 TAB2的擴(kuò)增曲線與溶解曲線

表3 IRAK4、IRAK1、TAB2 mRNA表達(dá)情況鼠只=5)

3 討論

肝臟是人體最大的實(shí)質(zhì)器官,具有分解代謝、清除毒素、抗氧化等功能,然而肝臟容易受到體內(nèi)外各種致病因素的侵?jǐn)_而損傷,原發(fā)性肝內(nèi)膽管結(jié)石作為常見(jiàn)的難治性良性膽道疾病,一直是肝臟疾病中的研究熱點(diǎn)。因此,探索針對(duì)其機(jī)制的有效防治措施是現(xiàn)今亟需解決的難題。而中醫(yī)藥對(duì)膽石癥的治療由來(lái)已久,許多臨床實(shí)踐及實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了其在緩解患者臨床癥狀、溶石排石及改善血清學(xué)指標(biāo)等方面具有確切的療效。大黃靈仙方是唐乾利根據(jù)十多年臨床經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)制的中藥復(fù)方,該方以疏肝利膽、攻下排石為立方原則,全方由生大黃、威靈仙、芒硝、金錢(qián)草、枳殼、雞內(nèi)金、澤蘭、柴胡、郁金、磁石、黃芪、炙甘草組成,臨床上常用于肝內(nèi)膽管結(jié)石的治療。現(xiàn)代藥理學(xué)證明:大黃、威靈仙可作用于肝臟的酶和蛋白,調(diào)節(jié)膽汁酸與肝臟脂質(zhì)的平衡,增強(qiáng)膽囊收縮,減少膽汁淤積,從而降低結(jié)石的形成幾率[9]。而柴胡中蘊(yùn)含的皂苷、有機(jī)酸、揮發(fā)油等化學(xué)成分,可促進(jìn)膽汁、膽固醇的分泌與排泄,枳實(shí)中的黃酮類,甘草中的甘草酸、甘草苷,金錢(qián)草中的酚性成分、黃酮類等均有疏肝、利膽、排石等功效[10-11]。由此可見(jiàn),大黃靈仙方中的組方藥物具有緩解膽道炎癥、增強(qiáng)膽道收縮功能、抑制結(jié)石形成等功效。

目前已經(jīng)證實(shí),肝膽管結(jié)石的形成與感染互為因果[12]。2015年,Peers C等[13]發(fā)現(xiàn),膽管感染以革蘭氏陰性菌感染為主,LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的重要組成部分,經(jīng)肝臟排入膽汁中的內(nèi)毒素大部分仍保留LPS完整的分子結(jié)構(gòu),具有內(nèi)毒素的生物特性,當(dāng)LPS作用于細(xì)胞膜受體,通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞級(jí)聯(lián)使基因表達(dá)發(fā)生變化,介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及單核巨噬細(xì)胞的激活,誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子合成和釋放,從而引發(fā)膽道內(nèi)慢性炎癥。

炎癥的發(fā)生與信號(hào)通路的調(diào)控失常及關(guān)鍵基因的異常表達(dá)存在關(guān)聯(lián),而藥物治療膽石癥常從削弱炎癥信號(hào)通路出發(fā),通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)減少結(jié)石形成。2015年,Skevaki等[14]研究發(fā)現(xiàn),IRAK1和IRAK-4是IRAK激酶家族成員,在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用,參與調(diào)控Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表達(dá)。當(dāng)IRAK-1發(fā)生磷酸化反應(yīng)時(shí),亦會(huì)活化TRAF6并與由TABs(TAB2)組成的蛋白激酶復(fù)合物結(jié)合,引起NF-κB信號(hào)通路產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子[15]。2019年,Yin D等[16]也證實(shí)了,IRAK-1能通過(guò)驅(qū)動(dòng)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),促進(jìn)炎性細(xì)胞的分泌,通過(guò)對(duì)慢性壓迫性損傷大鼠模型注射IRAK1的siRNA可降低IRAK-1的表達(dá),逆轉(zhuǎn)脊髓中該信號(hào)通路下游分子p-NF-κB表達(dá)的上調(diào),抑制神經(jīng)炎癥的進(jìn)展。IRAK-4過(guò)度表達(dá)可增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的NADPH氧化酶活性,激活MAPK信號(hào)通路并啟動(dòng)炎癥應(yīng)答[17]。相關(guān)研究也證實(shí)了:在潰瘍性腸炎的炎癥產(chǎn)生機(jī)制中,TLR/MyD88炎癥信號(hào)通路的異常表達(dá)起著關(guān)鍵作用,TLRs能夠通過(guò)與病原識(shí)別模式分子結(jié)合的方式,介導(dǎo)其下游的信號(hào)傳遞分子MyD88進(jìn)行胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),而大量募集的MyD88可誘導(dǎo)IRAK4發(fā)揮激酶活性,產(chǎn)生磷酸化反應(yīng),最終釋放TNF-α、IL-1β等細(xì)胞炎癥因子,引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[18]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了:當(dāng)LPS與TLR4結(jié)合后通過(guò)MyD88招募并活化信號(hào)蛋白IRAK(特別是IRAK-1和IRAK-4),可激活下游NF-κB和MAPK信號(hào)通路并交互放大炎性反應(yīng)[19],通過(guò)抑制IRAK-1、IRAK-4以及TAB2的異常表達(dá)可下調(diào)TLR4/NF-κB/MAPK信號(hào)通路的炎癥應(yīng)激反應(yīng)?？梢?jiàn),IRAK-1、IRAK-4和TAB2作為T(mén)LR4/NF-κB/MAPK信號(hào)通路的下游因子,在炎癥反應(yīng)過(guò)程中扮演著重要角色。但通過(guò)調(diào)控IRAK-1、IRAK-4和TAB2的異常表達(dá),緩解和抑制膽管細(xì)胞炎癥反應(yīng),進(jìn)而預(yù)防肝膽管結(jié)石的形成及術(shù)后復(fù)發(fā),尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。故本課題采取大黃靈仙方干預(yù)膽管炎癥大鼠模型,探究其抑制膽管細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制。

結(jié)合膽管炎性反應(yīng)是導(dǎo)致肝內(nèi)膽管結(jié)石形成的關(guān)鍵因素的論點(diǎn),IRAK-1、IRAK-4、TAB2作為T(mén)LR4/NF-κB/MAPK信號(hào)通路的下游信號(hào)分子,在該通路中具有正向傳導(dǎo)信號(hào)的作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證IRAK-1、IRAK-4和TAB2與膽管炎癥之間的關(guān)系,筆者運(yùn)用WB和RT-qPCR對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。研究結(jié)果顯示:與空白組對(duì)比,模型組的IRAK-1、IRAK-4、TAB2蛋白及mRNA表達(dá)顯著增加,提示經(jīng)LPS誘導(dǎo)后模型組大鼠的信號(hào)通路被激活并呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài),大鼠膽管細(xì)胞炎癥反應(yīng)增強(qiáng),分別給予大黃靈仙方、p38MAPK信號(hào)通路阻斷劑以及NF-κB信號(hào)通路阻斷劑干預(yù)后,IRAK-1、IRAK-4、TAB2的蛋白及mRNA表達(dá)量均有不同程度下調(diào),表明大黃靈仙方可阻礙其所介導(dǎo)的TLR4/NF-κB/MAPK信號(hào)通路進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo),降低大鼠膽管組織炎癥反應(yīng)。當(dāng)p38MAPK信號(hào)通路阻斷劑與NF-κB信號(hào)通路阻斷聯(lián)合使用后,其抑制膽管炎癥反應(yīng)的效果明顯優(yōu)于單一使用信號(hào)通路阻斷的大鼠,說(shuō)明同時(shí)下調(diào)IRAK-1、IRAK-4和TAB2三者的炎癥表達(dá)水平,能進(jìn)一步抑制TLR4/NF-κB/MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥瀑布反應(yīng),使得大鼠膽管炎癥損傷進(jìn)一步緩解。而大黃靈仙顆粒和P38MAPK信號(hào)通路阻斷劑、NF-κB信號(hào)通路阻斷劑三者聯(lián)合使用后,上述通路指標(biāo)的表達(dá)量進(jìn)一步降低的同時(shí),膽管組織炎癥損傷也進(jìn)一步緩解,表明大黃靈仙顆粒聯(lián)合信號(hào)阻斷劑可進(jìn)一步促進(jìn)大黃靈仙方抑制炎癥信號(hào)通路的活化作用,可能是防治肝膽管結(jié)石的機(jī)制之一。但在與模型組對(duì)比中,p38MAPK阻斷劑+大黃靈仙顆粒組中的IRAK-4的蛋白及mRNA表達(dá)量和p38MAPK阻斷劑+大黃靈仙顆粒組中的IRAK-1的蛋白表達(dá)量異常增加,引起的炎癥反應(yīng)的結(jié)果與其它研究不一致[20],推測(cè)其原因可能是存在其它炎癥因子與IRAK-1或IRAK-4發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,使TLR4/NF-κB/MAPK信號(hào)通路表達(dá)異常上升,具體作用機(jī)制仍需進(jìn)行下一步驗(yàn)證。

綜上所述,初步推測(cè)大黃靈仙方可緩解LPS誘導(dǎo)的大鼠膽管炎癥反應(yīng),促進(jìn)膽管細(xì)胞的修復(fù),從而達(dá)到減少肝膽管結(jié)石發(fā)生及術(shù)后復(fù)發(fā)的目的,其作用機(jī)制可能與抑制TLR4/NF-κB/MAPK信號(hào)通路下游IRAK-1、IRAK-4、TAB2炎癥因子的活化有關(guān)。但該方是復(fù)方中藥,具有多靶點(diǎn)、多途徑的特征,其確切的抗膽管炎癥的作用機(jī)制尚未完全闡明,后續(xù)對(duì)于具體分子機(jī)制以及相關(guān)信號(hào)通路之間的聯(lián)系仍需進(jìn)行基因靶點(diǎn)敲除或網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等研究。