蘭永利 霍新慧 李盼 阿斯卡爾·牙生 韋芳

急性胃黏膜損傷又被稱為應(yīng)激性潰瘍,通常是由于胃黏膜自身防御屏障功能被破壞下降而又被攻擊因子刺激所致[1]。而酒精刺激是造成急性胃黏膜損傷的主要原因之一,酗酒或者過量飲酒會強(qiáng)烈刺激胃黏膜[2],而且乙醇導(dǎo)致急性胃黏膜損傷的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[3],對人們健康存在嚴(yán)重威脅。

中醫(yī)自古以來就有“以人為本”“治未病”的思想,“治未病”指施以治療手段防止疾病發(fā)生、發(fā)病之后防止發(fā)展,及時(shí)有效控制病情的發(fā)生發(fā)展[4],而國家積極倡導(dǎo)“健康中國”戰(zhàn)略,把保障人民健康放在優(yōu)先發(fā)展的位置[5],這與中醫(yī)思想不謀而合,而針灸作為中醫(yī)學(xué)的重要組成部分,以其綠色、簡便、高效的治療手段很容易被人們普遍接受。本課題組前期實(shí)驗(yàn)證明:針灸預(yù)處理能夠加強(qiáng)胃黏膜微循環(huán)屏障,上調(diào)與屏障相關(guān)的保護(hù)因子,下調(diào)損傷因子,達(dá)到對胃黏膜組織的保護(hù)作用[6]。

香草酸亞型1(transient receptor potential vanillic acid subtype 1,TRPV1)是一種在細(xì)胞膜表面存在的陽離子通道蛋白,對維持胃黏膜穩(wěn)態(tài)具有積極作用[7];降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene and related peptide,CGRP)是一種生物活性多肽,可通過改善大鼠胃黏膜血流量,對乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜損傷起到保護(hù)作用[8],而CGRP的合成分泌受到TRPV1調(diào)控。本研究通過觀察大鼠TRPV1、CGRP蛋白表達(dá)水平的影響,探討針灸預(yù)處理抗無水乙醇致急性胃黏膜損傷的可能機(jī)制,以便為應(yīng)用于預(yù)防疾病提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雌雄各半大鼠52只,體質(zhì)量(180～220)g,購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心,動物合格證號:SYXK(新)2018-0003。大鼠自由攝食、攝水,飼養(yǎng)室溫度:20～25℃,相對濕度:50%～54%,自然晝夜交替。

1.2 藥品與試劑

無水乙醇(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司,執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn):Q/STXH 286-2019),阿司匹林腸溶片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司,規(guī)格100 mg×30片/盒,國藥準(zhǔn)字:J20130078),ELISA試劑盒名稱:腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),上海優(yōu)選生物科技有限公司(批號:YX-E21174 批次:202205);白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6),上海優(yōu)選生物科技有限公司(YX-E21122 批次:202205);表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF),上海優(yōu)選生物科技有限公司(YX-E20968 批次:202205);三葉因子1(trefoil factor 1,TFF1),上海優(yōu)選生物科技有限公司(YX-E28755 批次:202205)

1.3 主要儀器

一次性針灸針(華佗牌,規(guī)格0.25×13 mm),艾灸條(南陽漢醫(yī)艾絨有限責(zé)任公司,規(guī)格4 mm×120 mm),固定支架(知福堂,蘄春上工記艾灸器具開發(fā)有限公司),酶標(biāo)分析儀(型號:Infinite F50,上海優(yōu)選生物科技有限公司),高速冷凍離心機(jī)(德國,型號:Eppendorf 5415C),分光光度計(jì)(日本,型號:SHIMAZDU UV-2540),蛋白印跡儀(臺灣威泰克有限公司,型號:Yrdimes SW07D0567),臺式恒溫振蕩器(中國上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司,型號:THZ-312),凝膠成像分析系統(tǒng)(臺灣威泰克有限公司,型號:KETA M多用凝膠成像系統(tǒng))。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組與干預(yù)方式 隨機(jī)將大鼠分為四組:正常組、模型組、預(yù)灸組、預(yù)針刺組,每組13只。在適應(yīng)性飼養(yǎng)7天之后,每日上午10:00開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

腧穴的取穴依據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》常用動物穴位定位法進(jìn)行確定[9]。正常組和模型組:艾灸支架固定,20分鐘/次,不做處理,1次/天,連續(xù)7天。預(yù)灸組:艾灸支架固定,溫和灸懸灸中脘、足三里(雙),20分鐘/次,1次/天,持續(xù)7天。預(yù)針刺組:艾灸支架固定,一次性針灸毫針針刺中脘、足三里(雙),平補(bǔ)平瀉,20分鐘/次、1次/天,持續(xù)7天。每次處理結(jié)束之后,解除大鼠支架固定,回飼養(yǎng)室進(jìn)行正常喂養(yǎng)。

1.4.2 造模 在預(yù)處理7天結(jié)束之后,第8天禁食不禁水,第9天開始對模型組、預(yù)灸組、預(yù)針刺組進(jìn)行胃黏膜損傷模型的制備。應(yīng)用動物實(shí)驗(yàn)室常用灌胃手法,采用無水乙醇與阿司匹林混懸液法灌胃制備模型,阿司匹林腸溶片與生理鹽水(2 000 mg∶100 mL)配置成阿司匹林混懸液,先用無水乙醇0.6 mL/100 g進(jìn)行灌胃,1小時(shí)后再予以阿司匹林混懸液200 mg/kg進(jìn)行灌胃造模,造模4天。

1.4.3 標(biāo)本采集 造模結(jié)束后,當(dāng)天22:00禁食禁水,次日上午10:00開始取材。采用10%水合氯醛麻醉,起效后,腹主動脈取血,使用離心機(jī)離心后取上層血清。取完血后,統(tǒng)一解剖將全胃取出,在4%多聚甲醛中固定,用于指標(biāo)檢測。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 一般情況 對大鼠攝水?dāng)z食、毛發(fā)、大便、活動度,精神、體質(zhì)量等一般情況進(jìn)行觀察[10],體質(zhì)量每4天測量一次。

1.5.2 評定胃黏膜損傷指數(shù)(ulcer index,UI) 采用Guth PH等[11]的方法計(jì)算:將胃黏膜組織應(yīng)用生理鹽水沖洗干凈,然后平鋪于濾紙上,在10倍放大鏡下,用肉眼觀察,卡尺測量評估損傷程度:1分為損傷(包括糜爛點(diǎn))不大于1 mm;2 mm≥損傷>1 mm為2分;3 mm≥損傷>2 mm為3分;4 mm≥損傷>3 mm為4分;損傷大于4 mm為5分;損傷寬度大于2 mm的時(shí)候計(jì)分加倍。UI評分為胃黏膜各處損傷計(jì)分后值的累加。

1.5.3 HE染色法觀察胃黏膜組織病理變化 胃黏膜損傷指數(shù)評定完成之后,應(yīng)用10 %多聚甲醛溶液對胃組織進(jìn)行固定、脫水、石蠟包埋等常規(guī)操作,而后選取胃黏膜糜爛程度最明顯地方切厚度為5 μm的薄片,之后進(jìn)一步脫蠟脫水、HE染色,完成之后應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠胃黏膜的病理變化(×400)。

1.5.4 ELISA法檢測TNF-α、IL-6、EGF、TFF1濃度 腹主動脈取血,3 000 r/min離心20分鐘,收集上清液,并在-80℃冰箱中儲存待測。嚴(yán)格遵照ELISA試劑盒方法說明進(jìn)行操作,計(jì)算TNF-α、IL-6、EGF、TFF1的濃度水平。

1.5.5 免疫組化法檢測胃黏膜組織TRPV1、CGRP表達(dá) 取材結(jié)束后,每組隨機(jī)選擇5只大鼠,嚴(yán)格按照試劑盒方法進(jìn)行操作,將常規(guī)石蠟包埋和組織切片經(jīng)抗原修復(fù)后,用正常羊血清液封閉20分鐘,將配置好的TRPV1、CGRP一抗工作液(1∶100稀釋)滴加在組織上,4℃過夜,PBS洗滌后滴加生物素化第二抗體、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP),DAB顯色、復(fù)染、封片后,400×的顯微照相,并進(jìn)行圖像分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較

一般情況:預(yù)處理期間,四組大鼠攝水?dāng)z食及二便情況正常,毛發(fā)有光澤、靈活好動,精神良好。造模后,模型組大鼠攝水?dāng)z食量較前明顯減少,大便夾有血絲,毛發(fā)暗淡,精神萎靡;預(yù)灸組和預(yù)針刺組大鼠較模型組情況有所改善。體質(zhì)量比較:與造模前相比,各組大鼠針灸預(yù)處理后的體質(zhì)量顯著上升(P<0.05);與針灸預(yù)處理后相比,模型組和預(yù)針刺組大鼠體質(zhì)量顯著下降(P<0.05),而預(yù)灸組大鼠體質(zhì)量顯著上升(P<0.05);與預(yù)針刺組相比,預(yù)灸組大鼠體質(zhì)量有所上升(P<0.05),提示艾灸效果強(qiáng)于針刺。如表1。

表1 各組大鼠在制備胃黏膜損傷模型前后體質(zhì)量對比

2.2 各組大鼠UI評分

正常組胃黏膜組織表面光滑。與正常組相比,模型組胃黏膜組織表面出現(xiàn)顯著出血灶,UI指數(shù)明顯上升(P<0.01),提示模型制備成功;與模型組相比,預(yù)灸組和預(yù)針刺組胃黏膜組織表面只有少量出血灶,UI指數(shù)下降(P<0.01),提示針灸預(yù)處理對預(yù)防胃黏膜損傷有效;與預(yù)針刺組相比,預(yù)灸組UI指數(shù)下降(P<0.05),提示艾灸效果強(qiáng)于針刺。如圖1,表2。

圖1 胃黏膜組織在肉眼下的形態(tài)觀察

表2 各組大鼠制備胃黏膜損傷模型UI評分比較

2.3 各組大鼠胃黏膜組織病理學(xué)形態(tài)變化比較

正常組大鼠胃黏膜組織未見病理改變,無滲出紅細(xì)胞;模型組大鼠存在嚴(yán)重的胃黏膜損傷,有大量紅細(xì)胞滲出;預(yù)灸組大鼠胃黏膜與正常組相似,未見病理改變;預(yù)針刺組大鼠胃黏膜大部分完整,只有少量紅細(xì)胞滲出。如圖2。

圖2 各組大鼠胃黏膜組織病理學(xué)形態(tài)變化的比較(HE染色,×400)

2.4 ELISA法檢測各組大鼠胃黏膜TNF-α、IL-6、EGF、TFF1濃度水平的情況

與正常組相比,模型組TNF-α、IL-6濃度上升(P<0.05),EGF濃度下降(P<0.05),TFF1濃度有下降趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與模型組相比,預(yù)灸組和預(yù)針刺組大鼠TNF-α、IL-6濃度下降(P<0.05),EGF水平上升(P<0.05),TFF1濃度有上升趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與預(yù)針刺組相比,預(yù)灸組大鼠TNF-α、IL-6濃度下降(P<0.05),EGF水平上升(P<0.05),TFF1濃度有上升趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)如表3。

表3 ELISA檢測各組大鼠血清TNF-α、IL-6、EGF、TFF1濃度比較

2.5 免疫組化法檢測針灸預(yù)處理對胃黏膜損傷大鼠TRPV1、CGRP蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較,模型組大鼠TRPV1、CGRP蛋白表達(dá)水平上升(P<0.05);與模型組相比,預(yù)灸組和預(yù)針刺組大鼠TRPV1、CGRP蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05);與預(yù)針刺組相比,預(yù)灸組大鼠TRPV1、CGRP蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)。如圖3、4,表4所示。

圖3 免疫組化法檢測針灸灸預(yù)處理對急性胃黏膜損傷大鼠TRPV1蛋白表達(dá)的影響(×200)

圖4 免疫組化法檢測針灸預(yù)處理對急性胃黏膜損傷大鼠CGRP蛋白表達(dá)(×200)

表4 免疫組化染色顯示各組大鼠胃黏膜組織中TRPV1、CGRP蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

急性胃黏膜損傷的臨床表現(xiàn)為胃黏膜淺表性潰瘍、糜爛或者出血[12],一般是由于胃黏膜受到攻擊因子刺激使自我防御和修復(fù)功能遭到破壞。隨著醫(yī)療、科學(xué)技術(shù)水平的不斷提高,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)應(yīng)用各種抑制劑藥物治療胃黏膜損傷已經(jīng)取得不錯(cuò)效果,但隨著人們養(yǎng)生意識的不斷增強(qiáng),“未病先防”思想越來越強(qiáng)烈,《素問·四氣調(diào)神大論篇》提到“是故圣人不治已病治未病,不治已亂治未亂”,明確強(qiáng)調(diào)了“未病先防”的重要性[13]。而針刺和灸法較于中醫(yī)其他手段來講,其簡便、安全、綠色的優(yōu)點(diǎn)更容易被人們所接受,特別是灸法,孫思邈在《備急千金要方》中為其“治未病”奠定了理論基礎(chǔ)[14]。

本研究采用胃經(jīng)的合穴足三里和募穴中脘配合使用,以防止胃黏膜損傷的方法為“合募配穴[15]。急性胃黏膜損傷以其臨床表現(xiàn)在中醫(yī)學(xué)屬于“胃脘痛”,為脾胃系統(tǒng)疾病[16],而足三里和中脘穴作為治療脾胃系統(tǒng)疾病的常用穴位,相互配合使用,可激發(fā)胃氣、調(diào)理中焦氣機(jī)、祛邪扶正,調(diào)和陰陽。有研究表明,在治療脾胃疾病方面,足三里、中脘運(yùn)用頻次最高,每一證型及癥狀均選取兩穴為主穴[17]。

本文通過應(yīng)用無水乙醇制備大鼠急性胃黏膜損傷模型,為防止大鼠胃黏膜損傷后的自愈,1小時(shí)后給予阿司匹林混懸液灌胃。大量飲酒后,乙醇代謝不及時(shí),在胃內(nèi)潴留,刺激胃黏膜,降低胃黏膜自我修復(fù)因子的保護(hù)作用,并顯著影響胃黏膜的生理功能[18]。在本次實(shí)驗(yàn)取胃黏膜組織后,與正常組對比,模型組大鼠肉眼觀察下的胃黏膜組織出血、糜爛明顯,且HE染色發(fā)現(xiàn)胃黏膜上皮細(xì)胞固有層充血、出血明顯,提示大鼠無水乙醇致急性胃黏膜損傷模型制備成功。

TNF-α、IL-6是常見的炎癥因子,其濃度水平上升提示炎癥反應(yīng),胃黏膜組織遭到破壞。EGF可促進(jìn)細(xì)胞再生能力,提高胃黏膜自我防御,TFF1主要在胃黏膜表面表達(dá),可促進(jìn)黏膜的再生與修復(fù)[19],其濃度下降表明是胃黏膜發(fā)生了病理性改變。TRPV1可參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生,在胃黏膜損壞發(fā)病機(jī)理中至關(guān)重要。CGRP是重要的具有負(fù)向調(diào)節(jié)功能的免疫調(diào)節(jié)肽[20]。本實(shí)驗(yàn)研究中,與正常組相比,模型組大鼠TNF-α、IL-6水平上升,EGF、TFF1水平下降,TRPV1、CGRP蛋白表達(dá)水平上升;與模型組相比,預(yù)灸組和預(yù)針刺組大鼠TNF-α、IL-6水平下降,EGF、TFF1水平上升,TRPV1、CGRP蛋白表達(dá)水平下降;與預(yù)針刺組比較,預(yù)灸組大鼠TNF-α、IL-6水平下降,EGF、TFF1水平上升,TRPV1、CGRP蛋白表達(dá)水平下降,提示針刺和艾灸預(yù)處理可通過調(diào)控TRPV1、CGRP蛋白表達(dá)水平,降低炎性因子濃度,提高抗炎因子濃度,從而增強(qiáng)胃黏膜的自我修復(fù)和防御能力,減輕胃黏膜的損傷程度。艾灸預(yù)處理效果強(qiáng)于針刺預(yù)處理。

綜上所述,應(yīng)用針灸預(yù)處理“治未病”可預(yù)防胃黏膜損傷,進(jìn)而減輕由胃黏膜損傷引發(fā)的消化系統(tǒng)其他病癥,作用機(jī)制可能是通過影響TRPV1、CGRP蛋白表達(dá)水平來實(shí)現(xiàn)的,可為臨床預(yù)防胃黏膜損傷提供理論基礎(chǔ),但是針灸預(yù)防胃黏膜損傷還有其他作用機(jī)制,需要進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探討。