王越 劉金民 王凱悅 徐薇薇

癲癇是由大腦神經(jīng)元異常放電引起的突然、短暫、反復出現(xiàn)的慢性發(fā)作性腦功能失調(diào)綜合征,是神經(jīng)科僅次于腦血管病的第二大頑癥[1-2]。抑郁癥以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征,具有患病率高、自殺率高等特點[3-5]。抑郁障礙是癲癇最常見的共患精神障礙[6]。單胺機制是癲癇—抑郁共病的重要機制,該機制認為中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)和多巴胺(dopamine,DA)等單胺遞質(zhì)含量減少及受體功能異常是癲癇—抑郁共病的重要機制[6]。此外,抑郁癥存在的DA功能低下及DA2受體(DA2R)的減低[7]。癲癇—抑郁共病機制及藥物研究已經(jīng)成目前癲癇領域的難點及熱點問題。

筆者團隊在《傷寒論》柴胡加龍骨牡蠣湯、《醫(yī)學心悟》定癇丸基礎上,加減化裁為柴貝止癇湯,應用于顳葉癲癇及難治性癲癇的臨床治療。臨床研究表明,該復方可在減少癲癇包括顳葉癲癇及難治性癲癇發(fā)作的同時,明顯改善患者抑郁情緒[8-9]。柴貝止癇湯主要由柴胡、天麻、法半夏、浙貝母、石菖蒲、牡蠣、地龍七味中藥組成。本研究旨在通過觀察柴貝止癇湯對癲癇—抑郁共病模型抑郁行為及大腦皮層及海馬5-HT轉運體(5-HT transporte,5-HTT)、5-HT受體(5-HT1AR和5-HT2AR)和DA2R的表達影響,分析柴貝止癇湯治療癲癇—抑郁共病的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取6～8周齡SPF級雄性SD大鼠60只,體質(zhì)量180～240 g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,實驗動物使用許可證號:SYXK(津)2019-002。動物實驗倫理批件號:IRM-DWLL-2002229。

1.2 實驗藥物

柴貝止癇湯(柴胡12 g、天麻15 g、浙貝母9 g、法半夏9 g、石菖蒲9 g、牡蠣30 g、地龍6 g)采用水煮醇提法制作濃縮,含生藥量2.14 g/mL。氫溴酸西肽普蘭片(西安楊森制藥有限公司,20 mg/片,批號:2676415)。東茛菪堿(遂成藥業(yè)股份有限公司,0.3 mg/支,批號:1601211)。地西泮(金耀藥業(yè)有限公司,10 mg/支,批號:2206211)。

1.3 實驗試劑與儀器

搖床(Kylin-Bell,TS-200),渦旋混合器(Kylin-Bell,QL-866),移液槍(Dragon,YE193AL0293070),實時PCR儀器(Bio-Rad,CFX96),電泳槽(北京君意,JY-ZY5),PVDF膜(Millipore Cat,ISEQ00010),臺式高速冷凍型微量離心(SCILOGEX,CF1524R),酶標儀(BioTek Instruments,800TS),熒光化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(上海勤翔科學儀器有限公司,3300 Mini)?？贵w5-HTT(Abways,CY8138),5-HT1AR(Alomone,ALO-ASR-021-0.2),5-HT2AR(Bioss,bs-1056R),DA2R(PTG,55084-1-AP),Goat Anti Rabbit IgG/HRP(Abcam,ab205718),Goat Anti Mouse IgG/HRP(Abcam,ab205719),5-HT、DA Elisa試劑盒(上海信裕生物科技有限公司),TRIzon RNA提取試劑盒(Engreen公司),反轉錄試劑盒(全式金,AU341-02),Taq試劑盒(Takara,Japan)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組 將60只大鼠隨機分為正常組、模型組、西藥組和柴貝止癇湯低、中、高劑量組,每組10只。

1.4.2 癲癇—抑郁共病模型造模 匹羅卡品—氯化鋰建立大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后慢性顳葉癲癇動物模型:造模前20小時,腹腔注射氯化鋰(127 mg/kg),匹羅卡品注射前半小時腹腔注射東莨菪堿(1 mg/kg)。腹腔注射匹羅卡品(30 mg/kg)誘發(fā)癲癇持續(xù)狀態(tài)。大鼠癲癇發(fā)作按照Racine分級進行評價,出現(xiàn)Ⅳ級和/或Ⅴ級發(fā)作并持續(xù)30分鐘(癲癇持續(xù)狀態(tài)),則認為建模成功。不成功者追加一次匹羅卡品(30 mg/kg),連續(xù)追加兩次不成功,則認為建模失敗。癲癇持續(xù)狀態(tài)持續(xù)60分鐘后,腹腔注射地西泮(10 mg/kg)終止發(fā)作。大鼠持續(xù)視頻監(jiān)測30天,出現(xiàn)自發(fā)性發(fā)作,認為癲癇大鼠進入慢性期。

慢性不可預知溫和應激刺激制作抑郁模型:造模時間28天。每天從日間、夜間中各挑選一種刺激對大鼠進行處理,順序隨機。日間刺激:在強迫游泳桶中加入4℃冰水,每桶1只大鼠,游泳5分鐘;大鼠單獨接受足底電擊,2 mA,間隔10秒,電擊4秒,重復2次;搖晃鼠籠10分鐘(強度以大鼠不能站穩(wěn)為準),方向不定;大鼠放于束縛罐中束縛2小時;單籠隔離所有大鼠,孤獨3小時;胡椒粉撒入鼠籠,氣味刺激;將所有大鼠放入狹窄的桶中,擁擠3小時。夜間刺激:持續(xù)電燈光照;在鼠籠墊料上噴灑水,潮濕處理;將鼠籠傾斜45°;彩燈置于鼠籠上方,持續(xù)閃爍;禁水禁食12小時。每周測量一次體重,以觀察抑郁動物體重變化。

1.4.3 給藥方法 西藥組:造模成功后予西酞普蘭10 mg/(kg·d),每日分兩次灌胃給藥。柴貝止癇湯低、中、高劑量組:造模成功后分別予柴貝止癇湯低[2.5 g/(kg·d)]、中[4.5 g/(kg·d)]、高[8.5 g/(kg·d)]三個劑量每日分兩次灌胃給藥。正常組:不造模,正常飼養(yǎng),每日分兩次灌胃等量生理鹽水。模型組:造模成功后正常飼養(yǎng),每日分兩次灌胃等量生理鹽水。各組均連續(xù)給藥14天。

1.5 抑郁行為學監(jiān)測

1.5.1 糖水偏好實驗 依據(jù)Moller Marisa等[10]報道的方法,觀察并記錄12小時內(nèi)各組大鼠攝取的蔗糖溶液體積。糖水飲用量=測定前蔗糖水量-測定后的蔗糖水量。

1.5.2 強迫游泳實驗 將大鼠置于盛有水的敞口圓柱形水桶內(nèi)。水桶高50 cm,直徑20 cm,水深30 cm,水溫(24±2)℃,任其自由游泳,通過攝像系統(tǒng)觀察6分鐘內(nèi)大鼠的不動狀態(tài)持續(xù)時間,即大鼠四肢蜷縮不動漂浮水面,僅鼻孔露出水面呼吸,無其他行為的持續(xù)時間。

1.6 取材

給藥結束,完成行為學監(jiān)測后1天,對大鼠斷頭取腦,冰上分離海馬組織,-80℃保存。

1.7 指標檢測

1.7.1 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測5-HT、DA含量 按照試劑盒說明書步驟測定OD值,根據(jù)已知濃度的標準物的OD值繪制標準曲線,并根據(jù)標曲計算得到各組大鼠大腦皮層及海馬組織中5-HT、DA。

1.7.2 實時定量PCR檢測5-HTT、5-HT1AR、5-HT2AR和DA2R的mRNA轉錄水平 使用TRIzon RNA提取試劑盒提取大腦皮層和海馬區(qū)mRNA。隨后,使用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA。在42～65℃合成第一鏈cDNA。引物設計:5-HT1AR-F:CTAGCATCTCCGACGTACC,5-HT1AR-R:AAAGCGCCGAAAGTGGAGTA;5-HTT-F:GATGTGTCAGAGGTGGCCAA,5-HTT-R:GGTAGGGATGCAGATGACGG;5-HT2AR-F:AACCCCATTCACCATAGCCG,5-HT2AR-R:TCTTTGCAGATGACGGCCAT; DA2R-F:AACTTACATCCGGCCTGCTC,DA2R-R:GGAAGCGCG-ATGAGGGATAA;β-actin-F:TCAACACCCCAGCC-ATGTAC,β-actin-R:AATGCCTGGGTACATGGTGG。使用Taq試劑盒,運用實時PCR儀器檢測基因表達水平。

1.7.3 免疫印跡試驗檢測5-HTT、5-HT1AR、5-HT2AR和DA2R蛋白表達情況 每組選擇5只大鼠。依次配置12%的分離膠和5%的濃縮膠。點樣孔中加入10 μL蛋白樣品。設置電泳儀參數(shù)為80 V 40分鐘,130 V 1小時。將分離凝膠中的蛋白在22 V 22分鐘的條件下轉移至PVDF膜。轉膜結束后,5%脫脂牛奶室溫封閉30分鐘。一抗溶液在4℃條件下孵育12小時。1×TBST洗3次,每次10分鐘。二抗溶液在室溫條件下孵育1小時。孵育完用1×TBST洗3次,每次10分鐘。在膜上滴加化學顯色液,使用凝膠成像儀觀察蛋白表達情況。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量變化

給藥前(第0天)、給藥第8天、給藥結束后(第15天),模型組體質(zhì)量均低于正常組(P<0.05)。給藥第8天、給藥結束后(第15天),西藥組和柴貝止癇湯中、高劑量組大鼠的體質(zhì)量均高于模型組大鼠(P<0.05)。見表1。

表1 各組癲癇—抑郁共病模型大鼠體質(zhì)量比較

2.2 各組大鼠抑郁行為觀察

2.2.1 糖水偏好實驗 藥物干預后,模型組較正常組大鼠糖水偏好度較顯著減少(P<0.01),西藥組(P<0.05)和柴貝止癇湯低(P<0.05)、中(P<0.01)、高劑量組(P<0.01)較模型組顯著增加。見表2。

表2 各組癲癇—抑郁共病模型大鼠糖水偏好測試及強迫游泳測試情況比較

2.2.2 強迫游泳實驗 藥物干預后,模型組較正常組大鼠不動時間顯著增加(P<0.01),西藥組和柴貝止癇湯低、中、高劑量組大鼠的不動時間較模型組顯著減少(P<0.01)。見表2。

2.3 各組大鼠大腦皮層和海馬5-HT及DA表達情況

藥物干預后,與正常組比較,模型組大鼠大腦皮層及海馬5-HT、DA含量均顯著減少(P<0.01)。與模型組比較,西藥組大腦皮層和海馬區(qū)的5-HT顯著升高(P<0.01),大腦皮層的DA顯著升高(P<0.05),柴貝止癇湯中(P<0.05)、高劑量組(P<0.01)大鼠大腦皮層及海馬中5-HT含量、皮層中DA含量升高;柴貝止癇湯高劑量組大鼠大腦海馬中DA含量升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組癲癇—抑郁共病模型大鼠皮層及海馬5-HT及DA含量比較

2.4 各組大鼠大腦皮層和海馬5-HTT、5-HT1AR、5-HT2AR和DA2R的mRNA表達情況

藥物干預后,與正常組相比,模型組大鼠大腦皮層中5-HTT mRNA表達增加(P<0.05),海馬中5-HTT mRNA表達減少(P<0.05),大腦皮層及海馬中5HT1AR mRNA表達均減少(P<0.05),5HT2AR、DA2R mRNA表達無明顯變化(P>0.05)。見表4。

表4 各組癲癇—抑郁共病模型大鼠大腦皮層和海馬5-HTT、5-HT1AR、5-HT2AR和DA2R的mRNA表達情況比較值)

與模型組相比,柴貝止癇湯高劑量組大鼠大腦皮層中5-HTT mRNA表達顯著降低(P<0.01),5-HT1AR mRNA表達顯著升高(P<0.05);在大鼠海馬中,柴貝止癇湯高劑量組的5-HTT mRNA(P<0.01)及5-HT1AR mRNA(P<0.05)表達顯著升高;大腦皮層和海馬中5-HT2AR和DA2R mRNA表達均無明顯變化。見表4。

2.5 大鼠大腦皮層和海馬5-HTT、5-HT1AR、5-HT2AR和DA2R蛋白表達的影響

各組大鼠5-HTT、5-HT1AR、5-HT2AR和DA2R蛋白表達的趨勢與mRNA表達趨勢基本一致。與正常組相比,在大鼠大腦皮層中,模型組5-HTT的蛋白表達增加(P<0.05),5-HT1AR的蛋白表達減少(P<0.05),5-HT2AR和DA2R的蛋白表達水平無明顯變化;在海馬中,模型組5-HTT和5-HT1AR的蛋白表達減少(P<0.05),5-HT2AR和DA2R的表達不變。見圖1,表5。

圖1 各組癲癇—抑郁共病模型大鼠大腦皮層和海馬5-HTT、5-HT1AR、5-HT2AR和DA2R蛋白表達情況比較

表5 各組癲癇—抑郁共病模型大鼠大腦皮層和海馬5-HTT、5-HT1AR、5-HT2AR和DA2R蛋白表達情況比較

與模型組相比,在大鼠大腦皮層中,柴貝止癇湯高劑量組5-HTT的蛋白表達減少(P<0.05),5-HT1AR的蛋白表達增加(P<0.05),5-HT2AR和DA2R的蛋白表達水平無明顯變化;在海馬中,柴貝止癇湯高劑量組5-HTT和5-HT1AR的蛋白表達增加(P<0.05),5-HT2AR和DA2R的表達不變。見圖1,表5。

3 討論

大量臨床研究和基礎研究表明,癲癇和抑郁具有共同的發(fā)病機制[11],其中以單胺機制研究最深入。有研究表明,柴胡皂苷A能改善抑郁小鼠懸尾實驗不動時間,增加腦內(nèi)單胺遞質(zhì)去甲腎上腺素、DA含量[12-13]。天麻乙醇提取物增加抑郁小鼠腦組織中海馬區(qū)和紋狀體區(qū)單胺遞質(zhì)5-HT、去甲腎上腺素、DA含量[14-17]。本研究表明,柴貝止癇湯可有效增加共病大鼠體重,改善抑郁行為學表現(xiàn),增加大腦皮層及海馬的5-HT、DA含量,同時調(diào)控5-HTT和5-HT2AR在大腦皮層和海馬中的表達,從而實現(xiàn)對癲癇—抑郁共病的治療。

5-HTT是一種跨膜轉運蛋白,其功能是轉運5-HT。5-HT被釋放入突觸間隙后,5-HTT結合突觸間隙的5-HT并將其轉運到突觸前神經(jīng)元細胞質(zhì)內(nèi)激活受體,隨后5-HT與受體迅速分離,被5-HTT重新攝取進入突觸前膜囊泡內(nèi)。因此,5-HTT的表達量直接影響腦內(nèi)對5-HT的利用效率[18]。本研究表明,與模型組相比,柴貝止癇湯抑制了大腦皮層中5-HTT的表達,但促進了海馬中5-HTT的表達。據(jù)此可以猜測,在癲癇—抑郁共病大鼠腦中,柴貝止癇湯干預優(yōu)先促進了5-HTT蛋白在海馬區(qū)的表達,從而增加5-HT在海馬區(qū)的轉運效率,進而促進海馬這類與情感調(diào)節(jié)有關的邊緣系統(tǒng)中5-HT的快速循環(huán)利用,以第一時間緩解抑郁情緒。

5-HT受體有多種亞型,其中5-HT1AR、5-HT2AR與抑郁癥的關系密切。5-HT1AR和5-HT2AR功能不平衡時,就會出現(xiàn)抑郁情緒[19]。5-HT1AR屬于自身受體,對5-HT的釋放起負反饋調(diào)節(jié)作用,多分布在與情感調(diào)節(jié)有關的邊緣系統(tǒng)中,尤其是海馬、額葉和中縫核[19]。本研究結果顯示,大腦皮層和海馬中5-HT1AR的表達同時升高,這表明當癲癇共病抑郁時,柴貝止癇湯干預會同時促進大腦皮層區(qū)域和海馬區(qū)對5-HT的識別,以提高5-HT的利用效率,緩解抑郁情緒。同時,實驗結果提示發(fā)現(xiàn)5-HT2AR的表達并未受到影響。這可能有兩點原因:一是5-HT1AR和5-HT2AR兩個5-HT受體蛋白具有功能互償作用,當其中一種受體升高時,另一種受體蛋白不需要就可以增加對5-HT的識別靈敏度;二是柴貝止癇湯中的有效成分只能作用于5-HT1AR基因,而非5-HT2AR基因轉錄激活因子的啟動子結合結構域,進而誘導5-HT1AR mRNA的表達水平升高和后續(xù)的蛋白表達增多。

綜上所述,柴貝止癇湯可改善癲癇—抑郁共病模型大鼠的抑郁行為,這可能是通過調(diào)控大腦皮層和海馬中5-HT、DA含量及5-HTT和5-HT1AR的表達而實現(xiàn)。臨床中,柴貝止癇湯的添加治療可為癲癇抑郁共病提供新思路、新方法。