趙 琳 倪成華 李 潔 梁 波 付冬冬

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種有發(fā)作趨勢(shì)的慢性、系統(tǒng)性、自身免疫性疾病，由自身抗體或免疫因子聚集引起腎臟、心臟、血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚、肺、肌肉和關(guān)節(jié)等多個(gè)器官和組織發(fā)生損傷，具有較高的發(fā)病率和病死率，嚴(yán)重影響患者的生命健康［1-3］。雖然目前出現(xiàn)新型的生物抑制劑和更有效SLE 治療策略，但其緩解率仍不高，造成這種狀況的原因之一是缺乏高度敏感、特異的SLE 診斷方法，疾病進(jìn)展檢測(cè)以及治療評(píng)價(jià)的方法。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）X 染色體失活特異轉(zhuǎn)錄本（X in-active specific transcription factor，XIST）是細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子，能夠?qū)?xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移和入侵等功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，在腦腫瘤、白血病、肺癌、乳腺癌、肺纖維化、炎癥、神經(jīng)性疼痛、心肌細(xì)胞肥大等多種類型腫瘤以及疾病中發(fā)揮著重要作用［4-6］。微小RNA-101-3p（microRNA-101-3p，miR-101-3p）是一種調(diào)節(jié)炎癥疾病進(jìn)展的重要因子，能夠影響炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生和成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞的增殖，參與多種自身免疫性疾病的發(fā)展［7-8］。本研究通過(guò)檢測(cè)SLE 患者外周血單核細(xì)胞中LncRNA XIST、miR-101-3p 的表達(dá)水平，探討其與患者疾病活動(dòng)性的關(guān)系，分析其對(duì)SLE 的診斷價(jià)值，以期為臨床診斷SLE 提供一定的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年4 月至2021 年10 月在新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院治療的180 例SLE 患者作為觀察組，同期180 例健康體檢者作為對(duì)照組。根據(jù)SLE 疾病活動(dòng)指數(shù)（SLE disease activity index，SLEDAI）評(píng)分，將觀察組分為穩(wěn)定期組80 例（SLEDAI 評(píng)分＜5 分）和活動(dòng)期組100 例（SLEDAI 評(píng)分≥5 分），收集其身體質(zhì)量指數(shù)等資料。兩組對(duì)象性別、年齡、身體質(zhì)量指數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。見(jiàn)表1。

表1 兩組對(duì)象一般資料比較（）

表1 兩組對(duì)象一般資料比較（）

注：SLEDAI為系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)指數(shù)。

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1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①確診且符合SLE疾病相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］者；②近期未使用甾體、激素以及免疫抑制藥物治療者；③年齡≥18 歲，自愿簽署同意書(shū)者；④臨床資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在原發(fā)性腎炎以及其他炎癥者；②有免疫功能缺陷者；③有其他結(jié)締組織病者；④合并有腫瘤者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：2019211）。

1.3 方法

1.3.1 樣本收集 收集所有患者入院后24 h 內(nèi)（對(duì)照組為體檢當(dāng)日）空腹外周靜脈血3～4 mL，于EDTA 抗凝管中利用Ficoll 梯度離心分離單核細(xì)胞，于-80℃冰箱中保存以備檢測(cè)。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈（real-tim e quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR）法檢測(cè)外周血單核細(xì)胞中LncRNA XIST、miR-101-3p 的表達(dá)水平 根據(jù)Trizol 試劑盒（貨號(hào)：SH-2366，北京凱詩(shī)源生物科技有限公司）說(shuō)明書(shū)對(duì)各組樣品中總RNA 進(jìn)行提取，并對(duì)總RNA 濃度和純度進(jìn)行評(píng)估。按照M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)：PR2555，北京普非生物科技有限公司）說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄［反轉(zhuǎn)錄體系：總RNA（2 μL）、RNase Free dH2O（20 μL）、PrimeScript RT Master Mix（4 μL）］，以cDNA 為模板，采用qRT-PCR 檢測(cè)樣本中LncRNA XIST、miR-101-3p 的表達(dá)水平（PCR 體系：0.5 μL cDNA 模板、5 μL ddH2O、0.5 μL 正向引物、0.5 μL 反向引物、6.5 μL 2×Taq PCR master mix），條件：1 個(gè)循環(huán)（預(yù)變性：95℃，15 min），40 個(gè)循環(huán)（變性：95℃，15 s；退火延伸：65℃，45 s）。LncRNA XIST、miR-101-3p 引物及U6、3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）內(nèi)參引物由廣州銳博生物公司提供，引物序列見(jiàn)表2。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。使用2-ΔΔCt方法對(duì)LncRNA XIST、miR-101-3p 的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行分析。

表2 qRT-PCR引物序列

1.4 觀察指標(biāo) 比較兩組對(duì)象外周血單核細(xì)胞LncRNA XIST、miR-101-3p 水平，分析LncRNA XIST、miR-101-3p 表達(dá)與SLE 患者特異性抗體水平的關(guān)系，比較穩(wěn)定期和活動(dòng)期患者外周血單核細(xì)胞LncRNA XIST、miR-101-3p 水平及SLEDAI 評(píng)分，分析患者外周血單核細(xì)胞LncRNA XIST、miR-101-3p 水平和SLEDAI 評(píng)分的相關(guān)性，分析SLE 的影響因素，分析外周血單核細(xì)胞LncRNA XIST、miR-101-3p 水平對(duì)SLE的診斷價(jià)值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料均符合正態(tài)分布用表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)；Spearman 法分析LncRNA XIST、miR-101-3p 與SLEDAI 評(píng)分的相關(guān)性；Pearson 法分析LncRNA XIST與miR-101-3p 表達(dá)水平的相關(guān)性；logistic 回歸分析SLE 的影響因素；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析LncRNA XIST、miR-101-3p 的表達(dá)對(duì)SLE 的診斷價(jià)值；以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組對(duì)象外周血單核細(xì)胞LncRNA XIST、miR-101-3p 水平比較 對(duì)照組外周血單核細(xì)胞LncRNA XIST 水平為（1.01±0.19），觀察組為（1.55±0.32）；對(duì)照組miR-101-3p 水平為（1.03±0.20），觀察組為（0.62±0.18），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=19.467，P＜0.001；t=20.443，P＜0.001）。

2.2 LncRNA XIST、miR-101-3p 表達(dá)與SLE 患者特異性抗體水平的關(guān)系 以觀察組LncRNA XIST 平均值1.55、miR-101-3p 平均值0.62 作為臨界值，將180 例SLE 患者分為L(zhǎng)ncRNA XIST 高表達(dá)組（LncRNA XIST≥1.55，n=93）和LncRNA XIST 低表達(dá)組（LncRNA XIST＜1.55，n=87）；miR-101-3p 高表達(dá)組（miR-101-3p≥0.62，n=96）和miR-101-3p 低表達(dá)組（miR-101-3p＜0.62，n=84），分析二者表達(dá)水平與SLE 患者特異性抗體水平的關(guān)系。結(jié)果顯示，LncRNA XIST、miR-101-3p表達(dá)水平與SLE 患者ANA、抗sm 抗體、抗dsDNA 抗體抗體水平有關(guān)（P＜0.05），LncRNA XIST 高表達(dá)者，miR-101-3p 低表達(dá)者ANA 抗體、抗sm 抗體、抗ds-DNA 抗體陽(yáng)性率均高于LncRNA XIST 低表達(dá)者和miR-101-3p 高表達(dá)者（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 LncRNA XIST、miR-101-3p表達(dá)與SLE患者特異性抗體水平的關(guān)系

2.3 穩(wěn)定期和活動(dòng)期患者外周血單核細(xì)胞LncRNA XIST、miR-101-3p 水平比較 穩(wěn)定期組SLE 患者外周血單核細(xì)胞中LncRNA XIST 水平為（1.35±0.27），活動(dòng)期組為（1.71±0.36）；穩(wěn)定期組miR-101-3p 水平為（0.77±0.23），活動(dòng)期組為（0.50±0.14），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.427，P＜0.001；t=9.708，P＜0.001）。

2.4 患者外周血單核細(xì)胞LncRNA XIST、miR-101-3p水平、SLEDAI 評(píng)分的相關(guān)性 Starbase 網(wǎng)址預(yù)測(cè)LncRNA XIST 與miR-101-3p 間存在結(jié)合位點(diǎn)，SLE 患者外周血單核細(xì)胞中LncRNA XIST 與miR-101-3p 水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.410，P＜0.001）；LncRNA XIST 水平與SLEDAI 評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.425，P＜0.001），miR-101-3p 水平與SLEDAI 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.454，P＜0.001）。見(jiàn)圖1～4。

圖1 LncRNA XIST與miR-101-3p間結(jié)合位點(diǎn)

圖2 SLE 患者外周血單核細(xì)胞LncRNA XIST 與miR-101-3p水平的相關(guān)性

圖3 SLE 患者外周血單核細(xì)胞LncRNA XIST 水平與SLEDAI評(píng)分的相關(guān)性

圖4 SLE 患者外周血單核細(xì)胞miR-101-3p 水平與SLEDAI 評(píng)分的相關(guān)性

2.5 SLE 影響因素的logistic 回歸分析 以是否發(fā)生SLE 為因變量（發(fā)生=1，未發(fā)生=0），LncRNA XIST、miR-101-3p 為自變量（連續(xù)變量帶入原值），采用逐步向前法進(jìn)行l(wèi)ogistic 回歸分析，結(jié)果顯示，LncRNA XIST是影響SLE 的危險(xiǎn)因素（P＜0.05），miR-101-3p 是影響SLE 的保護(hù)因素（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 SLE影響因素的logistic回歸分析

2.6 外周血單核細(xì)胞LncRNA XIST、miR-101-3p水平對(duì)SLE 的診斷價(jià)值 以LncRNA XIST、miR-101-3p 和logistic 回歸模型公式（采用二元Logistic 回歸分析建立LncRNA XIST、miR-101-3p 水平診斷SLE 的聯(lián)合檢測(cè)方程：Logit（P）=-0.781×miR-101-3p+1.177×LncRNA XIST+1.374，）計(jì)算兩指標(biāo)聯(lián)合診斷SLE 發(fā)生的概率值為檢驗(yàn)變量，以患者發(fā)生SLE 為狀態(tài)變量（是=1，否=0）繪制ROC 曲線。結(jié)果顯示，LncRNA XIST、miR-101-3p、二者聯(lián)合診斷SLE 的AUC 分別為0.900、0.917 和0.960，二者聯(lián)合均優(yōu)于其各自單獨(dú)診斷（Z二者聯(lián)合-Ln-cRNAXIST=3.268，P=0.001；Z二者聯(lián)合-miR-101-3p=2.584，P=0.005）。見(jiàn)表5、圖5。

圖5 外周血單核細(xì)胞LncRNA XIST、miR-101-3p 水平診斷SLE的ROC曲線

表5 外周血單核細(xì)胞LncRNA XIST、miR-101-3p水平對(duì)SLE的診斷價(jià)值

3 討論

SLE 是可以影響所有年齡、種族和性別的一種疾病，其中女性患者占比較高，具有一定的異質(zhì)性，疾病活動(dòng)會(huì)有很大的波動(dòng)，會(huì)隨著時(shí)間的推移而改變，其嚴(yán)重程度也可從輕度皮膚損傷到嚴(yán)重器官損傷，其結(jié)果也可從持續(xù)緩解到死亡［10-11］。研究發(fā)現(xiàn)，SLE 是由自身免疫缺陷引起的，一些生物標(biāo)志物如miR-223、白介素-1 受體相關(guān)激酶-M、程序性死亡配體2 等與T 淋巴細(xì)胞功能、炎癥因子的產(chǎn)生、免疫耐受功能等有關(guān)，影響免疫應(yīng)答與炎癥反應(yīng)，從而用于分析SLE［12-14］。因此，尋找與SLE 相關(guān)的生物標(biāo)志物，及時(shí)加以干預(yù)，對(duì)患者具有較大的幫助。

LncRNA XIST 位于X 染色體失活中心，能夠調(diào)節(jié)X 染色體失活，能夠引起女性細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中一條X染色體的遺傳沉默，影響成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞增殖和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生［15］。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA XIST可以改變患者外周血免疫細(xì)胞的平衡，導(dǎo)致患者出現(xiàn)免疫失調(diào)和組織損傷，且能夠很好地診斷SLE［16］。Cheng 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA XIST 表達(dá)與SLEDAI 呈正相關(guān)，在有效治療后顯著降低，且LncRNA XIST 高表達(dá)的患者CD4+T 細(xì)胞水平升高，NK 細(xì)胞水平降低。miR-101-3p 是miR-101 的一種活性形式，廣泛存在于真核細(xì)胞中，在炎癥相關(guān)疾病中影響炎癥因子的表達(dá)［18］。Sun 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，與健康個(gè)體相比，SLE 患者外周血單核細(xì)胞中miR-101-3p 的表達(dá)水平顯著降低，與白細(xì)胞介素-17A、白介素-6 和干擾素-γ 呈負(fù)相關(guān)。Zhao 等［20］研究發(fā)現(xiàn)，miR-101-3p 在SLE 患者外周血單核細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，而過(guò)表達(dá)的miR-101-3p 可以阻斷NF-κB 信號(hào)通路，影響Th17 細(xì)胞分化，起到抑炎的作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，觀察組SLE 患者外周血單核細(xì)胞LncRNA XIST 水平升高，miR-101-3p 水平降低，且LncRNA XIST 高表達(dá)者，miR-101-3p低表達(dá)者ANA 抗體、抗sm 抗體、抗dsDNA 抗體陽(yáng)性率均高于LncRNA XIST 低表達(dá)者和miR-101-3p 高表達(dá)者，與相關(guān)研究［16，19］結(jié)果基本一致，表明LncRNA XIST、miR-101-3p 與SLE 具有一定的關(guān)系，且進(jìn)一步結(jié)果顯示活動(dòng)期組較穩(wěn)定期組SLE 患者外周血單核細(xì)胞中LncRNA XIST 水平升高，miR-101-3p 水平降低；LncRNA XIST 水平與SLEDAI 評(píng)分呈正相關(guān)，miR-101-3p 水平與SLEDAI 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，提示LncRNA XIST、miR-101-3p 與SLE 疾病活動(dòng)性密切相關(guān)，通過(guò)檢測(cè)患者外周血單核細(xì)胞中LncRNA XIST、miR-101-3p 的水平可以對(duì)SLE 的活動(dòng)性進(jìn)行判斷。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA XIST 能夠調(diào)節(jié)miRNA 參與非癌癥相關(guān)疾病的發(fā)展和進(jìn)展［21］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Starbase 網(wǎng)址預(yù)測(cè)LncRNA XIST 與miR-101-3p 間存在結(jié)合位點(diǎn)，患者外周血單核細(xì)胞LncRNA XIST 與miR-101-3p 水平呈負(fù)相關(guān)，與Li 等［22］結(jié)果基本一致，表明LncRNA XIST 與miR-101-3p 之間存在靶向作用。本研究logistic 回歸分析結(jié)果顯示，LncRNA XIST 是影響SLE 的危險(xiǎn)因素，miR-101-3p 是影響SLE 的保護(hù)因素。推測(cè)高水平的LncRNA XIST 可以靶向調(diào)節(jié)miR-101-3p，促進(jìn)促炎因子的產(chǎn)生，影響患者免疫平衡，導(dǎo)致SLE 的發(fā)生。ROC曲線分析顯示，LncRNA XIST、miR-101-3p 聯(lián)合診斷SLE 的AUC 為0.960，均優(yōu)于其各自單獨(dú)診斷，對(duì)SLE具有較好的診斷價(jià)值。提示LncRNA XIST、miR-101-3p 可有效地診斷SLE，當(dāng)LncRNA XIST＞1.14，miR-101-3p＜0.86 時(shí)，應(yīng)在臨床上快速制定診療方案，保障患者的生命安全。

綜上，SLE 患者外周血單核細(xì)胞LncRNA XIST 水平升高，miR-101-3p 水平降低，與SLE 疾病活動(dòng)性有關(guān)，對(duì)SLE 具有一定的診斷價(jià)值。然而仍需大量樣本對(duì)患者外周血單核細(xì)胞LncRNA XIST、miR-101-3p 在SLE 中的臨床價(jià)值進(jìn)行探究，并進(jìn)一步探究二者在SLE中的作用機(jī)制。