王 清,馬浩然,喻強(qiáng)強(qiáng),孫 朋,余建瑋,葉 超#

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,南昌 330006; 2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肺病科,南昌 330006)

感染后咳嗽(postinfectious cough,PIC)是指上呼吸道感染的急性期出現(xiàn)噴嚏、鼻塞和流涕等癥狀緩解或消失后,咳嗽持續(xù)3～8周,可出現(xiàn)刺激性干咳或咳少量白色黏液痰等,相關(guān)輔助檢查無(wú)明顯異常[1]。臨床上以病毒性感染導(dǎo)致的感冒咳嗽最為常見(jiàn)[1]。一項(xiàng)互聯(lián)網(wǎng)調(diào)查結(jié)果顯示,在過(guò)去3個(gè)月內(nèi)患有感冒和咳嗽的患者中,有81%的患者出現(xiàn)咳嗽癥狀,69%的患者表示咳嗽持續(xù)時(shí)間比其他感染癥狀更長(zhǎng)[2]。PIC是自限性疾病,可以自行緩解,對(duì)于有明顯咳嗽癥狀的患者,一般會(huì)采取相應(yīng)的藥物治療,常用鎮(zhèn)咳藥、抗組胺藥和減充血?jiǎng)┑萚1]。但常療效不佳,不良反應(yīng)較大,且病情反復(fù),無(wú)法完全控制,嚴(yán)重影響了患者的日常生活。杏貝止咳顆粒源自國(guó)醫(yī)大師周仲瑛教授經(jīng)驗(yàn)方,根據(jù)《太平惠民和劑局方》三拗湯+《金匱要略》甘桔湯為基礎(chǔ)加減組方而成[3],有麻黃、苦杏仁、浙貝母、桔梗、前胡、百部、北沙參、木蝴蝶和甘草,共9味藥材,作用為清宣肺氣、止咳化痰[4]。但是其活性成分及其在PIC治療中的主要作用機(jī)制尚不明確,因此,本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法與分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行分析,為探討其作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 杏貝止咳顆粒活性成分篩選及其預(yù)測(cè)潛在靶點(diǎn)

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP,https://tcmsp-e.com/)檢索杏貝止咳顆粒中麻黃、苦杏仁、浙貝母、桔梗、前胡、百部、北沙參、木蝴蝶和甘草等9味藥材的活性成分及其預(yù)測(cè)潛在相關(guān)靶點(diǎn)。其中活性成分篩選條件為口服生物利用度(OB)≥30%,類藥性(DL)≥0.18,藥物半衰期≥4 h[5]。甘草由于成分多,為便于計(jì)算統(tǒng)計(jì),增加氫鍵供體數(shù)(Hdon)<5、脂水分配系數(shù)(AlogP)<5、氫鍵受體數(shù)(Hacc)<5和腸代謝吸收程度(Caco-2)≥-0.40等參數(shù),預(yù)測(cè)靶點(diǎn)來(lái)自DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://go.drugbank.com/)。最后,將靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)中進(jìn)行規(guī)范基因靶點(diǎn)名稱。為方便研究,其活性成分展示為藥材名大寫(xiě)首字母及2個(gè)數(shù)字,共同成分展示為1個(gè)大寫(xiě)字母及數(shù)字。

1.2 PIC相關(guān)靶點(diǎn)收集

利用人類孟德?tīng)栠z傳綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(OMIM,https://omim.org/)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)、Pharm GKB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.pharmgkb.org/)和DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://go.drugbank.com/),以“postinfectious cough”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,獲得PIC疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 杏貝止咳顆粒與PIC共有靶點(diǎn)獲取

將杏貝止咳顆?；钚猿煞譂撛谧饔冒悬c(diǎn)與PIC相關(guān)靶點(diǎn)利用Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)取交集,獲取共有靶點(diǎn)。

1.4 構(gòu)建杏貝止咳顆粒活性成分-靶點(diǎn)-PIC疾病網(wǎng)絡(luò)圖

將杏貝止咳顆?；钚猿煞帧⒅兴幟Q、PIC疾病及預(yù)測(cè)的基因靶點(diǎn)制作成Excel表格,利用Cytoscape 3.8.2軟件,建立杏貝止咳顆粒活性成分-靶點(diǎn)-PIC疾病網(wǎng)絡(luò)圖,并使用“Network analyzer”功能計(jì)算該網(wǎng)絡(luò)的Degree值,篩選出杏貝止咳顆粒治療PIC重要活性成分。

1.5 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)

將杏貝止咳顆粒治療PIC共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cn.string-db.org/)中,設(shè)置物種為人類,置信度為0.04,隱藏游離的節(jié)點(diǎn),得到杏貝止咳顆粒治療PIC的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。將此網(wǎng)絡(luò)以TSV格式文件導(dǎo)出,再將其導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件中進(jìn)一步分析。

1.6 杏貝止咳顆粒治療PIC共有靶點(diǎn)基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)通路富集分析

通過(guò)Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)(https://metascape.org/)對(duì)杏貝止咳顆粒治療PIC的55個(gè)共有靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析,并利用Cytoscope 3.8.2軟件構(gòu)建通路-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 杏貝止咳顆粒重要活性成分與PIC核心靶點(diǎn)分子對(duì)接

以杏貝止咳顆粒活性成分-靶點(diǎn)-PIC疾病網(wǎng)絡(luò)圖中的重要活性成分作為配體分子,通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載其2D結(jié)構(gòu)并保存為 SDF格式,使用Chem3D 20.0進(jìn)行MM2 Minimize能量最小優(yōu)化為3D結(jié)構(gòu)的MOL2格式。從PPI網(wǎng)絡(luò)圖中選取前6個(gè)核心靶點(diǎn)作為受體蛋白,分別從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)保存并下載其3D結(jié)構(gòu)的PDB格式文件,導(dǎo)入PyMOL 2.5.2軟件對(duì)受體蛋白進(jìn)行去水、去配體處理。最后利用AutoDockTools 1.5.6、AutoDock 4.2.6進(jìn)行分子對(duì)接,將結(jié)果依次導(dǎo)入OpenBabelGUI轉(zhuǎn)化文件格式、PyMOL 2.5.2可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 杏貝止咳顆?；钚猿煞旨捌錆撛谧饔冒悬c(diǎn)

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)共篩選得到杏貝止咳顆粒活性成分96個(gè),其中麻黃17個(gè),苦杏仁11個(gè),浙貝母3個(gè),桔梗4個(gè),前胡10個(gè),百部16個(gè),北沙參3個(gè),木蝴蝶16個(gè),甘草16個(gè);潛在作用靶點(diǎn)共1 982個(gè),剔除重復(fù)值后有272個(gè)。

2.2 PIC疾病靶點(diǎn)

分別從OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、Pharm GKB數(shù)據(jù)庫(kù)和DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到相關(guān)靶點(diǎn)基因19、113、17和112個(gè),共261個(gè)靶點(diǎn),剔除重復(fù)值后有212個(gè)。

2.3 杏貝止咳顆粒與PIC共有靶點(diǎn)

利用Venny 2.1.0取交集,獲得杏貝止咳顆?；钚猿煞峙cPIC共有靶點(diǎn)55個(gè)。

2.4 杏貝止咳顆?；钚猿煞?靶點(diǎn)-PIC疾病網(wǎng)絡(luò)圖

篩選出杏貝止咳顆粒共82個(gè)活性成分對(duì)應(yīng)55個(gè)共同作用靶點(diǎn),利用Cytoscape 3.8.2軟件,建立杏貝止咳顆?；钚猿煞?靶點(diǎn)-PIC疾病網(wǎng)絡(luò)圖,見(jiàn)圖1。圖1中共有132個(gè)節(jié)點(diǎn),742條邊,其中活性成分用正六邊形表示,基因?yàn)榱庑?中藥名稱為圓形,疾病為三角形,其Degree值越大,說(shuō)明節(jié)點(diǎn)越大,其成分越重要。該網(wǎng)絡(luò)中重要活性成分為槲皮素、β-谷甾醇和豆甾醇。

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

利用Cytoscape 3.8.2軟件中的CytoNCA插件,根據(jù)介數(shù)中心性(BC)對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析,得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖,見(jiàn)圖2。其BC值越高,表明相關(guān)靶點(diǎn)越重要,影響力越大,相互作用可能性越強(qiáng)。其中BC值排序靠前的靶點(diǎn)有5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體基因(SLC6A4)、白細(xì)胞介素(IL)6、腎上腺素能受體β2(ADRB2)、糖皮質(zhì)激素受體(NR3C1)、原癌基因(JUN)和前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2(PTGS2)。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 G0功能富集和KEGG通路分析

2.6.1 GO功能富集分析:利用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)55個(gè)共有靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析,共獲得877個(gè)生物過(guò)程(BP)、44個(gè)細(xì)胞組分(CC)和103個(gè)分子功能(MF)。根據(jù)基因數(shù)目進(jìn)行排序,篩選出BP、CC和MF各前10條,并使用微生信在線平臺(tái)(http://www.bioinformatics.com.cn/)繪制GO功能富集BP、CC和MF三合一柱狀圖,見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn),BP主要包括對(duì)各種刺激的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)有機(jī)氮化合物的反應(yīng)、系統(tǒng)進(jìn)程的調(diào)節(jié)、離子的調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)、血液循環(huán)、循環(huán)系統(tǒng)流程和細(xì)胞活化等;CC包括突觸膜、突觸后膜、膜筏、膜微區(qū)、突觸前膜、突觸前膜的構(gòu)成和突觸后膜的構(gòu)成等;MF包括G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、細(xì)胞因子活性、受體配體活性、信號(hào)受體調(diào)節(jié)活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、氧化還原酶活性、蛋白質(zhì)同源二聚化活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性和突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性等。

2.6.2 KEGG通路分析:利用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)55個(gè)共有靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路分析,共獲得112條通路。根據(jù)基因數(shù)目進(jìn)行排序,篩選前20條通路,通過(guò)微生信在線平臺(tái)(http://www.bioinformatics.com.cn/)對(duì)KEGG進(jìn)行分析,見(jiàn)圖4。將通路和對(duì)應(yīng)的基因靶點(diǎn)利用Cytoscope 3.8.2軟件,建立通路-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖,見(jiàn)圖5。由圖5可知,神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號(hào)通路、癌癥信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路及糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)-AGE受體(RAGE)信號(hào)通路涉及的相關(guān)靶點(diǎn)基因較多。

圖4 共同靶點(diǎn)KEGG通路分析

圖5 通路-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 分子對(duì)接

選取重要活性成分槲皮素、β-谷甾醇和豆甾醇與核心靶點(diǎn)SLC6A4、IL-6、ADRB2、NR3C1、JUN和PTGS2進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)果顯示,活性成分與核心靶點(diǎn)的結(jié)合能均在-18.16～-36.36 kJ/mol范圍內(nèi),結(jié)合能越低,對(duì)接效果越好,活性成分配體分子與核心靶點(diǎn)受體蛋白之間的結(jié)合越穩(wěn)定,親和力越高,見(jiàn)表1、圖6。

表1 杏貝止咳顆粒重要活性成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接情況

3 討論

PIC為亞急性咳嗽,目前已有研究發(fā)現(xiàn),其發(fā)病機(jī)制與神經(jīng)因素、炎癥因子、氣道內(nèi)皮黏膜損傷、氣道高反應(yīng)和炎癥介質(zhì)的釋放密切相關(guān)[6],而神經(jīng)遞質(zhì)、炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)及免疫球蛋白在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[7]。中醫(yī)認(rèn)為,PIC病位在肺,系風(fēng)邪襲肺,肺氣失宣所致,治宜疏風(fēng)宣肺、利咽止咳[1]。杏貝止咳顆粒是由三拗湯+甘桔湯加減組方而成,其組方為麻黃、苦杏仁、浙貝母、桔梗、前胡、百部、北沙參、木蝴蝶和甘草。其中麻黃和苦杏仁為君藥,麻黃入肺經(jīng),宣肺氣,開(kāi)皮毛,降上逆之氣,善止咳平喘[8];苦杏仁辛散苦降,肅降肺氣而能止咳平喘[9]。浙貝母、桔梗和前胡為臣藥,浙貝母苦寒辛散,開(kāi)泄通降,故能清熱化痰止咳[10];桔梗味苦而辛,苦瀉辛散,宜宣肺氣,善止咳[11];前胡降氣祛痰,宣散風(fēng)熱,臨床可用于肺氣降之不下之喘咳[12]。百部、北沙參和木蝴蝶為佐藥,百部入肺經(jīng),善潤(rùn)肺降氣止咳,臨床用于新久咳嗽、肺癆咳嗽、百日咳等[13];北沙參鎮(zhèn)咳祛痰,主治肺熱燥咳、陰虛咳嗽等癥[14];木蝴蝶清肺熱,潤(rùn)肺止咳、利咽開(kāi)音[15]。甘草為使藥,具有潤(rùn)肺化痰止咳、調(diào)和諸藥的作用[16]。杏貝止咳顆粒中諸藥合用,具有良好的治療PIC的功效。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對(duì)接技術(shù),對(duì)杏貝止咳顆粒治療PIC的作用機(jī)制進(jìn)行探討。

分析可知,槲皮素、β-谷甾醇以及豆甾醇是杏貝止咳顆粒的重要活性成分。槲皮素是黃酮類化合物,具有降低氣道炎癥反應(yīng)的作用,通過(guò)抑制炎癥介質(zhì)IL-1、IL-6和IL-10的分泌釋放,達(dá)到抗炎效果[17-18]。β-谷甾醇能抑制炎癥介質(zhì)釋放、抑制核因子κB(NF-κB)通路的激活[19]。β-谷甾醇的抗炎、抗氧化作用與細(xì)胞中IL-6的表達(dá)有關(guān)。β-谷甾醇可通過(guò)阻斷Toll樣受體4/NF-κB、炎癥小體傳感器蛋白和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子等相關(guān)炎癥信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo),從而降低炎癥介質(zhì)的釋放與表達(dá)[20]。豆甾醇具有顯著的抗炎效果,其作用機(jī)制是通過(guò)抑制環(huán)氧合酶-2以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶等蛋白質(zhì)的表達(dá),從而降低前列腺素E2、一氧化氮的釋放[21]。SLC6A4、IL-6、ADRB2、NR3C1、JUN和PTGS2是治療PIC的核心靶點(diǎn)。有關(guān)研究表明,IL-6是重要的炎癥因子,其可以通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的增殖和分化,從而參與調(diào)節(jié)呼吸道炎癥反應(yīng)[22]。ADRB2可介導(dǎo)去甲腎上腺素誘導(dǎo)相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生和釋放IL-10,調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[23]。ADRB2在肺組織、支氣管平滑肌和支氣管內(nèi)皮細(xì)胞中也起到調(diào)節(jié)肺功能的作用[24]。PTGS2具有抗炎、抗氧化的功能,在炎癥病理過(guò)程中發(fā)揮著巨大作用,能抑制炎癥反應(yīng)[25-26]。根據(jù)KEGG通路分析,杏貝止咳顆粒治療PIC可能與神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、癌癥通路、鈣離子信號(hào)通路及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路等相關(guān),其核心靶點(diǎn)均分布在這些通路上。相關(guān)研究報(bào)告,咳嗽有關(guān)的受體分布于氣道上皮細(xì)胞與感覺(jué)神經(jīng)上的離子通道之間,當(dāng)病原體侵入時(shí),其感覺(jué)神經(jīng)上的離子通道開(kāi)放,在感染過(guò)程中,C纖維會(huì)促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)的分泌與釋放[27-28]。神經(jīng)活性-配體受體相互作用通路是質(zhì)膜上所有與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路相關(guān)的受體和配體集合,其能調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng),從而對(duì)PIC起到治療作用[29]。鈣離子信號(hào)通路在細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)、死亡過(guò)程中有著重要作用,在鈣離子的刺激下,可以通過(guò)一系列信號(hào)通路激活對(duì)應(yīng)的受體,從而調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡。AGE-RAGE信號(hào)通路能通過(guò)激活絲裂原激活的蛋白激酶、NF-κB等信號(hào)通路,促進(jìn)炎癥介質(zhì)的表達(dá)和釋放,進(jìn)而誘導(dǎo)慢性細(xì)胞激活及相關(guān)組織損傷。AGE-RAGE還可誘導(dǎo)激活各種細(xì)胞間的信號(hào)級(jí)聯(lián),促進(jìn)氧化應(yīng)激和一系列炎癥反應(yīng)[30]。

綜上所述,杏貝止咳顆粒具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路防治PIC的特點(diǎn),同時(shí)也反映了中醫(yī)的整體觀。本研究為深入探討杏貝止咳顆粒的作用機(jī)制和臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。