張婧, 楊丹, 陳思言

南充市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)一科,四川南充637000

肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)是非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)的一種,其發(fā)病率逐年升高,早期無(wú)明顯癥狀,就診時(shí)多為中晚期,預(yù)后較差[1-2]。因此,尋找與肺腺癌患者預(yù)后相關(guān)的指標(biāo),對(duì)臨床制定干預(yù)措施,延長(zhǎng)患者生命有積極意義。研究表明,LUAD發(fā)生發(fā)展與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、癌基因激活、自噬等有關(guān)[3-4]。近期報(bào)道顯示,DEP結(jié)構(gòu)域蛋白1(DEP domain containing 1,DEPDC1)在LUAD中呈高表達(dá),與LUAD患者不良預(yù)后相關(guān)[5]。過(guò)表達(dá)鋅指蛋白224(zinc finger protein224,ZNF224)可促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞增殖、侵襲[6];DEPDC1可通過(guò)與ZNF224相結(jié)合,進(jìn)而激活核因子-κB(nuclear factor κB,NF-κB)信號(hào)通路,從而影響肝癌的病理過(guò)程[7]。本文測(cè)定ZNF224、DEPDC1在LUAD患者中的表達(dá),分析二者相關(guān)性及其與LUAD患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2014年5月—2018年9月本院收治的LUAD患者73例,年齡43～74歲,平均(59.13±11.27)歲;男42例,女31例;腫瘤直徑≥5 cm 45例,<5 cm 28例;吸煙39例,未吸煙34例;TNM分期[8]:Ⅰ～Ⅱ期41例,Ⅲ～Ⅳ期32例;<60歲33例,≥60歲40例;中、高分化51例,低分化22例;表皮生長(zhǎng)因子受體(epithelial growth factor receptor,EGFR)表達(dá)陽(yáng)性35例,陰性38例;淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移者30例,轉(zhuǎn)移者43例。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),且符合《赫爾辛基宣言》。

納入標(biāo)準(zhǔn):①患者符合LUAD判定標(biāo)準(zhǔn)[9],且經(jīng)術(shù)后病理學(xué)確診;②受試者或其家屬簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):①轉(zhuǎn)移性肺癌;②臨床資料不全;③有放化療史;④嚴(yán)重肝腎功能不全。

1.2 Ualcan數(shù)據(jù)庫(kù)檢索

運(yùn)用Ualcan數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ualcan.path.uab.edu)檢索LUAD組織和正常肺組織ZNF224、DEPDC1 mRNA表達(dá)。gene symbol為ZNF224、DEPDC1在TCGA數(shù)據(jù)集中選擇肺腺癌進(jìn)行檢索所得。

1.3 組織標(biāo)本收集

收集患者經(jīng)手術(shù)切除的LUAD組織及癌旁組織(距腫瘤邊緣3 cm處的肺組織),剪取一部分,置于福爾馬林中固定,制備石蠟切片;另一部分迅速置于液氮中,24 h后置于-80 ℃冰箱保存。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)ZNF224、DEPDC1 mRNA表達(dá)

研碎凍存的LUAD組織和癌旁組織,以TRIzol Reagent(15596018,美國(guó)GIBCO公司)獲得組織總RNA,以RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(K1622,上海恒斐生物科技有限公司)獲取組織cDNA;利用HieffTTMqPCR SYBR? Green Master Mix(YB11201ES03,上海鈺博生物科技有限公司)、qRT-PCR儀(StepOne TM,美國(guó)ABI公司)擴(kuò)增cDNA,讀取循環(huán)閾值(CT值)。97.8 ℃ 6 min,96 ℃ 20 s,63 ℃ 20 s,62.5 ℃ 15 s,40個(gè)循環(huán)。GAPDH作為內(nèi)參,引物序列ZNF224上游為5′-GACAGCAATCCAAAGGGAAGGG-3′,下游為5′-CAGATTTGCTGGAAGGACCACTC-3′。引物序列DEPDC1上游為5′-CTCGTAGAACTCCTAAAAGGCATG-3′,下游為5′-CAACATCTTCCTGGCTTAGTTCTC-3′。引物序列GAPDH上游為5′-AGAGAGCAGGCTCATTGTG-3′,下游為5′-GCAGGCCAGGGATCGAATGAT-3′。ZNF224、DEPDC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCT法計(jì)算。

1.5 免疫組化法檢測(cè)ZNF224、DEPDC1蛋白表達(dá)

取4 μm厚石蠟切片,SP法染色,依據(jù)免疫組化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行常規(guī)操作,一抗為ZNF224抗體(CSB-PA026592LD01HU,美國(guó)Cusabio公司)、DEPDC1抗體(ab197246,英國(guó)abcam公司),經(jīng)顯色、復(fù)染、脫水、封片后在顯微鏡(Leica DVM6,德國(guó)徠卡公司)下拍照。按染色程度(A)與陽(yáng)性細(xì)胞比例(B)評(píng)分乘積判定ZNF224、DEPDC1蛋白表達(dá)情況:以A×B≥3分為陽(yáng)性,否則為陰性[10]。

1.6 隨訪

73例LUAD患者均隨訪36個(gè)月,以LUAD患者手術(shù)當(dāng)天為隨訪起點(diǎn),以LUAD患者死亡或隨訪至2021年9月為隨訪終點(diǎn),以門診或電話為主要隨訪方式,記錄LUAD患者生存情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用配對(duì)t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。Pearson相關(guān)性分析LUAD組織中ZNF224 mRNA及蛋白表達(dá)分別與DEPDC1 mRNA及蛋白表達(dá)的相關(guān)性。Kaplan-Meier生存曲線法分析LUAD組織ZNF224、DEPDC1 mRNA表達(dá)與LUAD患者預(yù)后的關(guān)系。COX回歸法分析LUAD患者預(yù)后的影響因素。α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 Ualcan數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果

Ualcan數(shù)據(jù)庫(kù)檢索顯示,LUAD組織ZNF224、DEPDC1 mRNA表達(dá)均高于正常肺組織(P<0.05;圖1)。

圖1 Ualcan數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果a為P<0.05,與正常肺組織比較。

2.2 LUAD組織、癌旁組織ZNF224、DEPDC1 mRNA及其蛋白表達(dá)情況

與癌旁組織相比,LUAD組織ZNF224、DEPDC1 mRNA表達(dá)升高(P<0.05;表1)。免疫組化顯示,ZNF224主要定位于細(xì)胞質(zhì)/核,DEPDC1定位于細(xì)胞核(圖2)。LUAD組織ZNF224、DEPDC1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率均高于癌旁組織(P<0.05;表2)。

表2 LUAD組織、癌旁組織ZNF224、DEPDC1蛋白表達(dá)情況(n=73) 例(%)

圖2 LUAD組織ZNF224及DEPDC1蛋白表達(dá)情況(免疫組化法,200×)A為ZNF224蛋白表達(dá)陰性;B為ZNF224蛋白表達(dá)陽(yáng)性;C為DEPDC1蛋白表達(dá)陰性;D為DEPDC1蛋白表達(dá)陽(yáng)性。

2.3 LUAD組織ZNF224、DEPDC1 mRNA及其蛋白表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系

分別以LUAD組織中ZNF224、DEPDC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量平均值2.29、2.35為臨界值,≥臨界值者分別為ZNF224 mRNA高表達(dá)組(37例)、DEPDC1高表達(dá)組(39例),<臨界值者分別為ZNF224 mRNA低表達(dá)組(36例)、DEPDC1低表達(dá)組(34例)。結(jié)果顯示,LUAD組織TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,ZNF224低表達(dá)組與高表達(dá)組、DEPDC1低表達(dá)組與高表達(dá)組比較,差異均有顯著性(P<0.05;表3、表4)。

表3 LUAD組織ZNF224、DEPDC1 mRNA表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系 例(%)

表4 LUAD組織ZNF224、DEPDC1蛋白表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系 例(%)

2.4 LUAD組織ZNF224與DEPDC1的相關(guān)性

LUAD組織ZNF224 mRNA與DEPDC1 mRNA呈正相關(guān)(r=0.569,P<0.05),ZNF224蛋白與DEPDC1蛋白呈正相關(guān)(χ2=27.455,P<0.05)。

2.5 LUAD組織ZNF224、DEPDC1 mRNA表達(dá)與LUAD患者預(yù)后的關(guān)系

73例LUAD患者存活49例,死亡24例,生存率67.12%。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,ZNF224 mRNA低表達(dá)組LUAD患者的平均生存時(shí)間34.69個(gè)月(95%CI:33.45～35.94),長(zhǎng)于ZNF224 mRNA高表達(dá)組28.43個(gè)月(95%CI:25.53～31.34);DEPDC1 mRNA低表達(dá)組LUAD患者的平均生存時(shí)間34.53個(gè)月(95%CI:32.99～36.07),長(zhǎng)于DEPDC1 mRNA高表達(dá)組28.90個(gè)月(95%CI:26.17～31.63)。Log-Rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示,ZNF224、DEPDC1 mRNA高、低表達(dá)組LUAD患者的累積生存率相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05;圖3)。

圖3 LUAD組織ZNF224、DEPDC1 mRNA表達(dá)與LUAD患者預(yù)后的關(guān)系

2.6 COX回歸分析LUAD患者預(yù)后的影響因素

單因素及多因素COX回歸分析結(jié)果顯示,TNM分期、ZNF224、DEPDC1 mRNA、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響LUAD患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05;表5)。

表5 影響LUAD患者預(yù)后的單因素和多因素COX回歸分析

3 討 論

LUAD起病隱匿,多數(shù)患者早期僅出現(xiàn)胸悶、咳嗽等癥狀,患者就診時(shí)多已錯(cuò)失最佳治療時(shí)機(jī)[11]。此外,LUAD具有高度異質(zhì)性,其病變過(guò)程涉及多種信號(hào)通路改變[12],因此,仍需尋找可早期診斷LUAD、評(píng)估LUAD患者預(yù)后的標(biāo)志物。

DEPDC1的基因位于染色體1p31.2,其可參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),影響腫瘤細(xì)胞增殖,與胃癌、大腸癌等關(guān)系密切[13-14]。研究發(fā)現(xiàn),DEPDC1在NSCLC中表達(dá)失調(diào),與NSCLC患者預(yù)后有關(guān)[15];另外,DEPDC1在LUAD中呈過(guò)表達(dá),其可能激活上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)過(guò)程進(jìn)而參與LUAD發(fā)生發(fā)展[16]。本文中LUAD組織DEPDC1 mRNA表達(dá)較高,與Li等[16]結(jié)果相符,且LUAD組織DEPDC1表達(dá)陽(yáng)性率較高,提示DEPDC1可能與LUAD密切相關(guān),推測(cè)DEPDC1可能通過(guò)影響EMT,調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程,進(jìn)而影響LUAD病理過(guò)程。

ZNF224調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[17-18]。研究發(fā)現(xiàn),ZNF224在慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)中呈高表達(dá),可能是治療CLL的潛在靶標(biāo)[19];另外,ZNF224在多發(fā)性骨髓瘤中表達(dá)升高,在多發(fā)性骨髓瘤中發(fā)揮促癌作用[20]。本研究中LUAD組織ZNF224 mRNA表達(dá)較高,與Ualcan數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果相符,且LUAD組織ZNF224表達(dá)陽(yáng)性率高于癌旁組織,提示ZNF224可能與LUAD病理發(fā)展相關(guān),推測(cè)過(guò)表達(dá)ZNF224可能通過(guò)影響血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等分泌,激活相關(guān)信號(hào)通路,進(jìn)而促進(jìn)LUAD病理變化,但其機(jī)制有待深入探討。本文中ZNF224 mRNA低表達(dá)組LUAD患者累積生存率高于ZNF224 mRNA高表達(dá)組,DEPDC1 mRNA高表達(dá)組LUAD患者累積生存率低于DEPDC1 mRNA低表達(dá)組,提示DEPDC1、ZNF224可作為評(píng)估LUAD患者預(yù)后的輔助標(biāo)志物。

Pearson相關(guān)性結(jié)果顯示,ZNF224 mRNA及其蛋白表達(dá)分別與DEPDC1 mRNA及其蛋白表達(dá)呈正相關(guān),提示ZNF224可能與DEPDC1協(xié)同影響LUAD病情進(jìn)程。COX回歸分析結(jié)果顯示,ZNF224 mRNA、DEPDC1 mRNA、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均可能增加LUAD患者發(fā)生不良預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn),及時(shí)測(cè)定ZNF224、DEPDC1表達(dá)有助于臨床診治LUAD、評(píng)估LUAD患者預(yù)后。

綜上,LUAD組織中ZNF224、DEPDC1上調(diào),ZNF224與DEPDC1呈正相關(guān),且均與LUAD患者預(yù)后關(guān)系密切,有望作為評(píng)估LUAD患者預(yù)后的潛在標(biāo)志物。