朱宇凝, 屈順林, 曹曉卉, 楊志慧, 孫桂鳳, 殷正進, 劉仕琦, 張纓

1.東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院秦淮醫(yī)療區(qū)病理科,江蘇南京210002;2.南華大學衡陽醫(yī)學院心血管疾病研究所,湖南衡陽421001

肺癌是惡性腫瘤的主要死亡原因,且在早期不易被發(fā)現(xiàn)[1]。根據(jù)組織學、臨床和神經(jīng)內(nèi)分泌特征,肺癌分為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)[2]。研究表明,肺癌中存在ALK融合基因變異現(xiàn)象[3-4]。ALK作為胰島素受體亞家族的受體酪氨酸激酶已被證實在各種癌癥中發(fā)揮重要作用,特別是間變性大細胞淋巴瘤(anaplastic large cell lymphoma,ALCL)、NSCLC和神經(jīng)母細胞瘤[1]。隨后,臨床實驗表明,針對ALK基因靶點的藥物克唑替尼,對于晚期ALK陽性的NSCLC患者治療療效顯著[5]。因此,尋找穩(wěn)定、準確、經(jīng)濟、快速的ALK基因融合狀態(tài)檢測手段迫在眉睫。本文對比分析免疫組化(immunohistochemistry,IHC)、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)、實時熒光定量PCR(real-time quantitative-PCR,qRT-PCR)檢測NSCLC ALK融合基因的情況。

1 材料和方法

1.1 標本來源

收集本院2018年12月—2022年12月通過HE染色法和IHC共同確診的453例NSCLC標本。標本來源包括細胞塊樣本(來自胸水)和組織樣本(經(jīng)皮肺穿刺、纖支鏡活檢獲取的小標本以及肺葉切除、轉(zhuǎn)移病灶切除獲取的手術切除大標本)。隨機選取IHC確診的ALK(-)、(+)、(2+)、(3+)標本各10例進行FISH、qRT-PCR驗證。

1.2 IHC法

1.2.1 組織標本制備 10%中性福爾馬林固定,自動脫水儀常規(guī)標準脫水,經(jīng)58～60 ℃熔點石蠟包埋后3 μm 厚切片備用。

1.2.2 細胞塊制備 新鮮胸水4 ℃冰箱靜置過夜后棄上清液,取底部沉淀于50 mL離心管2 500 r/min離心5 min;3%冰乙酸乙醇去紅細胞,30%乙醇去黏液;加入10%福爾馬林,振蕩均勻,2 500 r/min離心3 min,棄上清液;再加入95%乙醇10 mL,振蕩均勻,2 500 r/min離心3 min;棄上清液,收集底部沉淀轉(zhuǎn)移到擦鏡紙上,包好,和常規(guī)組織一起脫水,最后經(jīng)58～60 ℃熔點石蠟包埋。

1.2.3 IHC制片 從HE法中選取453例NSCLC標本,4 μm厚石蠟切片65 ℃烘箱烤片1 h,然后使用Ventana BenchMark GX全自動免疫組化染色儀進行檢測。所用試劑為羅氏抗ALK一抗(D5F3)和OptiView DAB免疫組化試劑盒以及增強擴增試劑盒。

1.2.4 IHC結果判定 ALK根據(jù)文獻[6]判定:>5%的腫瘤細胞呈現(xiàn)顆粒狀細胞質(zhì)強著色為(3+);>5%的腫瘤細胞呈現(xiàn)中度細胞質(zhì)著色為(2+);>5%的腫瘤細胞呈現(xiàn)微弱或模糊的細胞質(zhì)著色或≤5%的腫瘤細胞有任何程度的著色為(+);腫瘤細胞無著色為(-)。

1.3 FISH法

從IHC樣本中隨機選取ALK(-)、(+)、(2+)、(3+)各10例。所有標本用10%中性福爾馬林緩沖液固定,常規(guī)脫水、石蠟包埋,4 μm厚切片。常規(guī)脫蠟,75 ℃熱處理12 min,37 ℃預熱蛋白酶K消化15 min,緩沖液清洗,暗室內(nèi)滴加探針10 μL(美國Abbott公司),封片后放入雜交儀,75 ℃ 5 min變性,37 ℃過夜雜交。去除封片膠,將切片置于預加熱72 ℃洗液內(nèi)2 min,滴加10 μL DAPI、封片。選取單個視野50個腫瘤細胞,要求腫瘤細胞核輪廓及信號清晰,每個細胞核內(nèi)至少有一組紅、綠信號,如果紅綠信號分離(距離≥兩個信號直徑)或額外出現(xiàn)單獨的紅色信號數(shù)≥25個,或者不同視野的100個細胞內(nèi)合計≥15個存在分離信號或者綠色信號缺失視為陽性標本[6]。

1.4 qRT-PCR法

同1.3方法選取樣本共40例。組織樣本選用10%中性福爾馬林緩沖液固定,石蠟包埋樣本切片后立即檢測。手術標本切片厚度5 μm,5片;穿刺標本切片厚度5 μm,10片。樣品進行RAN和DNA分離,提取RNA和DNA,RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成單鏈cDNA,然后使用ALK融合基因檢測試劑盒進行qRT-PCR檢測。檢測流程嚴格按照說明書操作,操作中避免污染;最后使用SLAN全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)進行qRT-PCR檢測。根據(jù)試劑盒說明書判定結果:陽性對照曲線升起Ct值<24;若樣本融合基因FAM信號曲線升起Ct值<30,則為陽性;若樣本融合基因FAM信號無曲線升起或者Ct值≥30,則為陰性。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以例(%)表示,一致性檢驗采用Kappa檢驗或者Spearman相關性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 ALK融合基因的IHC檢測結果

453例經(jīng)HE和IHC共同確診為NSCLC標本。IHC樣本中379例ALK陰性、74例ALK陽性,其中(1+)12例、(2+)30例及(3+)32例。IHC ALK陽性率為16.3%(圖1)。NSCLC IHC ALK陽性細胞染色定位為細胞質(zhì)。

圖1 IHC法檢測NSCLC中ALK蛋白的表達(200×)A為ALK(-);B為ALK(+);C為ALK(2+);D為ALK(3+)。

2.2 ALK融合基因的FISH檢測結果

選取IHC樣本ALK(-)、(+)、(2+)、(3+)各10例,進行ALK熒光探針檢測,12例陽性,28例陰性(圖2)。

圖2 FISH法檢測NSCLC中ALK融合基因的表達(1 000×)A為ALK(-),紅綠信號融合;B為ALK(+),紅綠信號分離大于2個信號點。

2.3 ALK融合基因的qRT-PCR檢測結果

選取IHC樣本ALK(-)、(+)、(2+)、(3+)各10例,進行qRT-PCR檢測,13例陽性,27例陰性(圖3)。

圖3 qRT-PCR法檢測NSCLC中ALK融合基因的表達A為ALK(-),綠色曲線為陽性質(zhì)控,藍色樣本曲線無升起;B為ALK(+),綠色曲線為陽性質(zhì)控,藍色曲線樣本有明顯擴增。

2.4 IHC與FISH的一致性比較

Kappa檢驗結果顯示,在IHC判定為ALK(-)/(3+)的20例標本中,與FISH檢測結果一致率均為100%,具有高度一致性(P<0.05);在IHC判定為ALK(1+)/(2+)的20例標本中,與FISH檢測結果一致率分別為0%和20%,兩種方法AILK(1+)/(2+)標本檢測結果無一致性(χ2=0.474,P>0.05;表1)。Spearman相關性分析結果顯示,IHC和FISH檢測ALK具有一致性(r=0.781,P<0.05)。

表1 IHC和FISH檢測ALK結果的一致性(n=40) 例

2.5 IHC與qRT-PCR的一致性比較

Kappa檢驗結果顯示,在IHC判定為ALK(-)/(3+)的20例標本中,IHC與qRT-PCR檢測結果一致率均為100%,具有高度一致性(P<0.05);在IHC判定為ALK(1+)/(2+)的20例標本中,與qRT-PCR檢測結果一致率分別為10%和20%,兩種方法檢測結果無一致性(χ2=1,P>0.05;表2)。Spearman相關性分析結果顯示,IHC和qRT-PCR檢測ALK具有一致性(r=0.740,P<0.05)。

表2 IHC和qRT-PCR檢測ALK結果的一致性(n=40) 例

2.6 qRT-PCR與FISH的一致性比較

在40例已做IHC檢測樣本中,qRT-PCR與FISH檢測結果一致率為97.5%,兩種檢測方法結果具有高度一致性(r=0.943,P<0.05;表3)。

表3 qRT-PCR和FISH檢測ALK結果的一致性(n=40) 例

3 討 論

隨著精準醫(yī)療的不斷發(fā)展,個體化靶向藥物治療備受關注。研究表明,ALK融合基因的突變在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用;其基因靶向藥物克唑替尼對ALK陽性的肺癌患者治療效果顯著[7]。

ALK是肺癌較為常見的驅(qū)動基因[8]。目前,ALK融合基因的檢測方法主要有qRT-PCR、FISH、IHC法。qRT-PCR、FISH是經(jīng)典檢測方法,但費用較高;IHC法檢測ALK敏感性和染色強度較高,且費用相對較低。研究證明,檢測ALK所用的IHC、FISH、qRT-PCR法各有利弊[9]。

本文通過3種檢測方法比較,IHC作為初篩方法相對經(jīng)濟且便捷。因IHC人為因素影響較大,所以為確保實驗準確性,對實驗的每例標本均設置陽性對照,闌尾中的神經(jīng)節(jié)組織為已知陽性;另外,IHC可以檢測ALK的蛋白表達,但無法觀察到其基因變異和融合伴侶情況。FISH法檢測時間短,相對標準化,可以檢測到ALK的缺失、斷裂[10],但不能識別融合伴侶,可能會錯過罕見復雜的重排[11];并且判定者之間結果解釋會有較大區(qū)別[12]。qRT-PCR法檢測靈敏,特異性強,但在使用福爾馬林固定石蠟包埋的組織樣本時,需要多個引物集來檢測所有的ALK變異[13];qRT-PCR診斷的準確性在很大程度上取決于樣本RNA質(zhì)量,對樣本要求比較高[14],特別是交叉污染會出現(xiàn)假陽性結果。

綜上所述,IHC與FISH法判定相對主觀,結果可能存在較大差異,qRT-PCR法較客觀且更加靈敏。根據(jù)研究對比,qRT-PCR、FISH法在ALK融合基因的檢測結果與IHC法的一致性存在差別,IHC對于ALK融合基因表達的靈敏度更高。IHC檢測法經(jīng)濟且便捷,對病理科來說實驗過程可控,結果穩(wěn)定,重復性較好。因此,IHC可以作為ALK融合基因的初篩檢測方法,存疑樣本使用FISH、qRT-PCR檢測方法驗證,能夠檢測更全面的基因突變信息,為臨床病理診斷提供有效檢測輔助手段。