李媛, 苗曉紅

1.遵化市人民醫(yī)院婦科,河北唐山064200;2.唐山市婦幼保健院婦科,河北唐山063000

宮頸癌是婦科常見(jiàn)腫瘤,目前臨床常采用手術(shù)、放療、化療等治療,但患者生存率仍然較低[1],尋找宮頸癌早期分子標(biāo)志物及潛在治療靶點(diǎn)已成為研究熱點(diǎn)。JMJD2B是缺氧誘導(dǎo)因子-1α的下游靶基因,在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2-3],下調(diào)JMJD2B表達(dá)水平可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖[4]。HPIP是轉(zhuǎn)錄因子PBX的輔助抑制劑,參與器官形成和腫瘤發(fā)生[5],HPIP在宮頸鱗癌中表達(dá)上調(diào)[6],影響宮頸鱗癌發(fā)展進(jìn)程。而JMJD2B和HPIP與宮頸癌的關(guān)系目前少見(jiàn)報(bào)道,本文主要分析JMJD2B、HPIP對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,以期為宮頸癌基礎(chǔ)和臨床研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要儀器、試劑和細(xì)胞

CCK-8試劑盒購(gòu)于武漢純度生物科技有限公司;TRIzol試劑購(gòu)于上海文韌生物科技有限公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒、定量PCR試劑、酶標(biāo)儀購(gòu)于上海研卉生物科技有限公司;熒光定量PCR儀購(gòu)于上海佐明機(jī)械設(shè)備貿(mào)易有限公司;JMJD2B抗體、HPIP抗體購(gòu)于上海雅吉生物科技有限公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔、抗鼠二抗購(gòu)于上?？泼羯锟萍加邢薰?。攜帶JMJD2B基因片段si-JMJD2B、攜帶HPIP基因片段si-HPIP和無(wú)同源性陰性對(duì)照載體[si-NC-JMJD2B(si-NC-J)和si-NC-HPIP(si-NC-H)]購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司;si-JMJD2B序列為5′-UCUCCAUCACCUGCCUCAAGCACAA-3′,其si-NC序列為5′-CCUACAUCCCGAUCGAUGAUGUUGA-3′;si-HPIP序列為5′-CTGCTGGACAAGCTGGCCAAGGAGAACCA-3′,其si-NC序列為5′-CGGCAAGCUGACCCUGAAGTT-3′。

宮頸癌細(xì)胞系Hela和人正常宮頸上皮細(xì)胞(normal human cervical epithelial cells,HUCEC)購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

將Hela細(xì)胞和HUCEC置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng),并選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞分si-JMJD2B組、si-NC組、si-HPIP組,根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書,分別將si-JMJD2B、si-NC、si-HPIP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至si-JMJD2B組、si-NC組、si-HPIP組細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞,以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)JMJD2B和HPIP mRNA表達(dá)

采用TRIzol法提取細(xì)胞中總RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增,設(shè)置反應(yīng)條件以β-actin作為反應(yīng)內(nèi)參。采用2-ΔΔCT法計(jì)算目標(biāo)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列表

1.4 Western blotting檢測(cè)JMJD2B和HPIP蛋白水平

收集Hela、HUCEC、si-NC-J、si-JMJD2B、si-NC-H、si-HPIP組細(xì)胞加入裂解液提取總蛋白進(jìn)行電泳后轉(zhuǎn)膜,封閉1 h,加入JMJD2B、HPIP一抗(1∶2 000),4 ℃過(guò)夜孵育。添加相應(yīng)二抗(1∶3 000)室溫孵育2 h,洗滌。ECL化學(xué)發(fā)光液顯色,以β-actin為內(nèi)參,成像系統(tǒng)獲得蛋白質(zhì)條帶。

1.5 Hela細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

收集si-NC-J、si-JMJD2B、si-NC-H、si-HPIP組細(xì)胞(5×103個(gè)/孔)接種于96孔板中,將細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng),每孔加入10 μL CCK-8溶液,避光孵育2 h,于0、24、48、72、96、120 h時(shí)使用酶標(biāo)儀(λ=450 nm)檢測(cè)細(xì)胞光密度(optical density,OD),本實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。

1.6 Hela細(xì)胞Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

在24孔板中,將5×104個(gè)/mL細(xì)胞懸液接種于內(nèi)鋪Matrigel膠的Transwell小室中,于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)48 h。用棉簽擦去Transwell小室面上的細(xì)胞,固定結(jié)晶紫染色,隨機(jī)取5個(gè)視野于顯微鏡下拍照,計(jì)數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Hela細(xì)胞和HUCEC中JMJD2B、HPIP蛋白表達(dá)的比較

Western blotting結(jié)果顯示,宮頸癌Hela細(xì)胞JMJD2B、HPIP蛋白表達(dá)高于HUCEC(P<0.05;圖1)。

圖1 Hela細(xì)胞和HUCEC中JMJD2B、HPIP蛋白表達(dá)的比較a為P<0.05,與HUCEC比較。

2.2 si-JMJD2B或si-HPIP對(duì)Hela細(xì)胞JMJD2B、HPIP mRNA和蛋白表達(dá)的影響

qRT-PCR和Western blotting結(jié)果顯示,Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-JMJD2B、si-HPIP后,JMJD2B和HPIP的mRNA和蛋白表達(dá)均降低(P<0.05;圖2)。

圖2 si-JMJD2B、si-HPIP對(duì)Hela細(xì)胞JMJD2B、HPIP mRNA和蛋白表達(dá)的影響a為P<0.05,與si-NC-J組比較;b為P<0.05,與si-NC-H組比較。

2.3 si-JMJD2B、si-HPIP對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,si-JMJD2B組和si-HPIP組細(xì)胞增殖活力明顯小于si-NC-J組或si-NC-H組(P<0.05;圖3)。

圖3 si-JMJD2B和si-HPIP對(duì)Hela細(xì)胞增殖活力的影響a為P<0.05,與同時(shí)間si-NC-J組比較;b為P<0.05,與同時(shí)間si-NC-H組比較。

2.4 si-JMJD2B和si-HPIP對(duì)Hela細(xì)胞遷移和侵襲的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,si-JMJD2B組和si-HPIP組遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)量明顯低于si-NC-J組或si-NC-H組(P<0.05;圖4)。

3 討 論

宮頸癌是嚴(yán)重威脅全球女性生命健康的惡性疾病,近年來(lái),宮頸癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì),且患者年齡越來(lái)越小[7]。傳統(tǒng)宮頸癌治療以手術(shù)和放化療為主,但其治療效果及患者預(yù)后并不能達(dá)到理想狀態(tài)[8]。因此,尋找宮頸癌預(yù)防、診斷及治療的生物標(biāo)志物,對(duì)治療和控制患者疾病發(fā)展具有至關(guān)重要的意義。

本研究Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示,JMJD2B、HPIP在宮頸癌Hela細(xì)胞中蛋白表達(dá)高于HUCEC,推測(cè)JMJD2B和HPIP表達(dá)水平與宮頸癌發(fā)展進(jìn)程存在一定關(guān)聯(lián)。JMJD2B是組蛋白去甲基化酶JMJD2家族成員,能夠識(shí)別二甲基化和三甲基化H3K9、H3K36,引起組蛋白的去甲基化[9]。組蛋白修飾是表觀遺傳學(xué)機(jī)制之一,而組蛋白甲基化是組蛋白修飾的一種方式,組蛋白修飾與基因的失活、X染色體失活、基因印記等基因沉默現(xiàn)象以及DNA修復(fù)有關(guān)[10-11]。有研究顯示,HPIP蛋白高表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌發(fā)展進(jìn)程有關(guān)[12]。這些研究均表明JMJD2B和HPIP異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān),本研究結(jié)果顯示,JMJD2B和HPIP在宮頸癌細(xì)胞中高表達(dá),其異常表達(dá)可能與腫瘤惡性行為學(xué)有關(guān),與上述其他研究結(jié)果類似。

本文分別構(gòu)建干擾JMJD2B和HPIP基因表達(dá)模型,進(jìn)行一系列功能實(shí)驗(yàn)。本研究結(jié)果顯示,與si-NC-J組相比,si-JMJD2B組JMJD2B mRNA和蛋白表達(dá)水平降低;與si-NC-H組相比,si-HPIP組HPIP mRNA和蛋白表達(dá)水平降低,提示JMJD2B和HPIP細(xì)胞干擾模型構(gòu)建成功。本研究發(fā)現(xiàn),宮頸癌細(xì)胞干擾JMJD2B和HPIP基因表達(dá)后,細(xì)胞光密度、遷移和侵襲數(shù)量明顯下降。JMJD2B在干細(xì)胞分化、炎癥和多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的表觀遺傳學(xué)作用[13],既往研究顯示,下調(diào)JMJD2B表達(dá)可以抑制卵巢癌細(xì)胞增殖能力[2]。HPIP蛋白具有多種功能,是腫瘤發(fā)生過(guò)程中重要的分子生物標(biāo)志物[14]。研究顯示,HPIP蛋白異常表達(dá)與乳腺癌、肺癌和胃癌等多種腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)[15]。既往研究顯示,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1可以通過(guò)HPIP誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[16]。結(jié)合本研究結(jié)果表明,干擾JMJD2B和HPIP表達(dá),Hela細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力受到抑制,進(jìn)而抑制宮頸癌細(xì)胞的惡性行為學(xué),JMJD2B和HPIP差異表達(dá)均能影響宮頸癌細(xì)胞生理病理過(guò)程。

綜上所述,JMJD2B和HPIP基因在宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),干擾JMJD2B和HPIP基因表達(dá)可明顯削弱Hela細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力,影響宮頸癌發(fā)展進(jìn)程。對(duì)于MJD2B和HPIP基因之間是否存在關(guān)聯(lián)尚需進(jìn)一步分析,且本項(xiàng)研究缺乏臨床數(shù)據(jù)支持,今后需深入探究。