吳共發(fā), 曾宇婷, 劉鈺君, 姚雨江, 邱麗湞

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院 1.病理科,2.健康管理中心,廣東廣州511300

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是全球死亡率居第二的惡性腫瘤[1],導(dǎo)致其治療失敗的主要原因是轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)[2-3]。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSC)可導(dǎo)致惡性腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、異質(zhì)性、多藥耐藥和放射耐藥等。低氧被認(rèn)為是CSC形成和維持的關(guān)鍵成分[4]。已證明低氧通過(guò)上調(diào)某些因子的表達(dá)來(lái)促進(jìn)CRC的轉(zhuǎn)移[5]。結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(MACC1)是一個(gè)很強(qiáng)的預(yù)后生物標(biāo)志物和轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)物[6]。前期研究顯示CRC中MACC1高表達(dá)參與了其惡性進(jìn)展[7-9],抑制MACC1能阻遏CRC惡性行為[10]。有研究顯示MACC1通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)CRC的CSC樣特性[11]。然而,CRC中低氧微環(huán)境、MACC1和CSC樣特性之間的相互作用機(jī)制尚待闡明,本研究探討了低氧條件對(duì)MACC1功能及CRC細(xì)胞CSC樣特性的影響和機(jī)制,以期為尋找CRC新的治療策略提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑

人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù),液氮保存,使用時(shí)復(fù)蘇;MACC1基因過(guò)表達(dá)克隆慢病毒包裝服務(wù)委托廣州易錦生物技術(shù)有限公司完成;即用型抗體ki-67和抗體稀釋液購(gòu)自福州邁新;通用型二抗-HRP聚合物購(gòu)自Dako公司;Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司;AKT及Phospho-Akt(Thr308)抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司;CCK-8試劑盒、蛋白抽提試劑盒、蛋白水平檢測(cè)試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和ECL反應(yīng)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司;MACC1、CD133和CD44抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司,內(nèi)參β-actin抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;山羊抗兔二抗購(gòu)自中杉金橋公司,重組人表皮生長(zhǎng)因子購(gòu)自麥克林生化公司;人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子購(gòu)自艾德萊生物公司;PI3K激動(dòng)劑740 Y-P購(gòu)自Bio-Techne公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和處理

HCT116細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,放置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。待對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞鋪板生長(zhǎng)面積達(dá)到50%左右,按照慢病毒轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,以綠色熒光標(biāo)記的MACC1基因過(guò)表達(dá)克隆慢病毒顆粒(LV-MACC1)和空載體對(duì)照慢病毒顆粒(LV-Ctrl)分別感染HCT116細(xì)胞,分別作為實(shí)驗(yàn)組(LV-MACC1組)和過(guò)表達(dá)陰性對(duì)照組(LV-Ctrl組),2組常規(guī)培養(yǎng)。LV-MACC1組在低氧環(huán)境(1%O2、5%CO2和94%N2)培養(yǎng)設(shè)為L(zhǎng)V-MACC1+hypoxia組,激活PI3K活性實(shí)驗(yàn)用30 μmol/L 740 Y-P在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱下處理HCT116細(xì)胞24 h。

1.3 CCK-8和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將細(xì)胞(5×103個(gè)/孔)接種于96孔板中,每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。待各組細(xì)胞處理48 h后,每孔加入10 μL CCK-8液。隨后避光在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h,在450 nm處測(cè)定樣品的光密度(optical density,OD值),計(jì)算平均值。收集處理48 h的各組細(xì)胞制作細(xì)胞塊制成石蠟包埋細(xì)胞塊,方法按照前期研究[12],按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)ki-67的表達(dá)情況,高倍鏡下隨機(jī)進(jìn)行5個(gè)高倍視野拍照并計(jì)數(shù),取均值,ki-67陽(yáng)性指數(shù)(%)=ki-67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4 劃痕實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞接種到6孔板中,各組細(xì)胞處理后培養(yǎng)至100%融合。隨后用200 μL的無(wú)菌移液管尖端劃一個(gè)劃痕傷口,并使用PBS清除細(xì)胞碎片。細(xì)胞在添加了1%胎牛血清的RPMI-1640中孵育至處理時(shí)間達(dá)48 h。分別在孵育后0、48 h觀察劃痕傷口,每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。顯微鏡下隨機(jī)選擇的視野中捕獲圖像。

1.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

將各組細(xì)胞2×104個(gè)/孔和200 μL無(wú)血清基質(zhì)膠加入上腔,底部腔室添加500 μL RPMI-1640和10%胎牛血清。處理培養(yǎng)48 h后,用70%乙醇固定,0.1%結(jié)晶紫染色,用光學(xué)顯微鏡隨機(jī)拍照5個(gè)高倍視野和計(jì)數(shù)平均值。

1.6 腫瘤球形成試驗(yàn)

將各組細(xì)胞1×104個(gè)/孔在6孔的超低附著表面培養(yǎng)皿中培養(yǎng),分組按1.2,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞在無(wú)血清的DMEM/F12中培養(yǎng),添加20 μg/L重組人表皮生長(zhǎng)因子、10 μg/L人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和B27添加劑。細(xì)胞培養(yǎng)14天后,在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)>50 μm3的腫瘤球數(shù)。

1.7 Western blotting實(shí)驗(yàn)

按照蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)操作獲得細(xì)胞裂解液,按照蛋白水平檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定蛋白水平。隨后,用10%SDS-PAGE凝膠分離20 μg蛋白/通道,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在5%脫脂牛奶中密封2 h后,加一抗MACC1、CD133、CD44、和β-actin(1∶1 000)在4 ℃下過(guò)夜,然后與山羊抗兔二抗(1∶5 000)在室溫下孵育2 h,用ECL反應(yīng)檢測(cè)試劑盒觀察。內(nèi)參為β-actin,使用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度值量化分析,蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

GraphPad Prism 5.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組比較采用單因素方差分析。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)腸癌細(xì)胞中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)MACC1的效果

綠色熒光標(biāo)記的MACC1基因過(guò)表達(dá)克隆慢病毒顆粒感染HCT116細(xì)胞48 h,倒置熒光顯微鏡下觀察顯示接近100%的細(xì)胞有綠色熒光。蛋白印跡法條帶顯示LV-MACC1組的MACC1蛋白表達(dá)較LV-Ctrl組明顯增強(qiáng)(圖1)。

圖1 MACC1在慢病毒感染48 h后的表達(dá)水平A為感染MACC1慢病毒細(xì)胞在明場(chǎng)和熒光場(chǎng)下的圖像(200×);B為MACC1蛋白表達(dá)。

2.2 低氧及過(guò)表達(dá)MACC1對(duì)HCT116細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示,LV-MACC1組和LV-MACC1+hypoxia組OD值均高于LV-Ctrl組,LV-MACC1+hypoxia組細(xì)胞增殖OD值高于LV-MACC1組(P<0.05;圖2A)。細(xì)胞塊免疫細(xì)胞化學(xué)顯示,ki-67陽(yáng)性指數(shù)與CCK-8結(jié)果有同樣趨勢(shì)(圖2B)。

圖2 低氧及MACC1對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的影響A為CCK-8法測(cè)細(xì)胞增殖能力情況;B為免疫細(xì)胞化學(xué)ki-67檢測(cè)細(xì)胞增殖情況(400×)。a為P<0.05,與LV-ctrl組比較;b為P<0.05,與LV-MACC1組比較。

2.3 低氧及過(guò)表達(dá)MACC1對(duì)HCT16細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)MACC1能促進(jìn)HCT116細(xì)胞遷移能力,低氧微環(huán)境能進(jìn)一步增強(qiáng)MACC1促進(jìn)HCT116細(xì)胞的遷移能力(圖3)。

圖3 低氧及MACC1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移能力的影響

2.4 低氧及過(guò)表達(dá)MACC1對(duì)HCT16細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,LV-MACC1組和LV-MACC1+hypoxia組的細(xì)胞穿孔數(shù)均高于LV-Ctrl組,LV-MACC1+hypoxia組細(xì)胞穿孔數(shù)高于LV-MACC1組(P<0.05;圖4),提示過(guò)表達(dá)MACC1能促進(jìn)HCT116細(xì)胞侵襲能力,低氧微環(huán)境能進(jìn)一步增強(qiáng)MACC1促進(jìn)HCT116細(xì)胞的侵襲能力。

圖4 低氧及過(guò)表達(dá)MACC1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響A為光學(xué)顯微鏡下圖(結(jié)晶紫染色,500×);B為各組細(xì)胞穿孔數(shù)柱狀圖。a為P<0.05,與LV-Ctrl組比較;b為P<0.05,與LV-MACC1組比較。

2.5 低氧及過(guò)表達(dá)MACC1對(duì)腫瘤球形成的影響

各組細(xì)胞培養(yǎng)14天后計(jì)數(shù)>50 μm3的腫瘤球數(shù)量,LV-Ctrl組、LV-MACC1組和LV-MACC1+hypoxia組的腫瘤球數(shù)量分別是(43.8±2.1)個(gè)、(63.8±2.5)個(gè)和(82.2±2.7)個(gè)。腫瘤球數(shù)LV-MACC1+hypoxia組>LV-MACC1組>LV-Ctrl組(P<0.05;圖5)。

圖5 低氧及過(guò)表達(dá)MACC1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞腫瘤球形成的影響(200×)

2.6 低氧及過(guò)表達(dá)MACC1對(duì)CD44、CD133及AKT蛋白表達(dá)的影響

蛋白印跡法結(jié)果顯示,CD44、CD133和p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量LV-MACC1+hypoxia組>LV-MACC1組>LV-Ctrl組(P<0.05;圖6)。

圖6 低氧及過(guò)表達(dá)MACC1對(duì)CD44、CD133和AKT蛋白表達(dá)的影響1為L(zhǎng)V-Ctrl組;2為L(zhǎng)V-MACC1組;3為L(zhǎng)V-MACC1+hypoxia組。a為P<0.05,與LV-Ctrl組比較;b為P<0.05,與LV-MACC1組比較。

2.7 激活PI3K/AKT通路活性對(duì)干細(xì)胞標(biāo)記物的影響

740 Y-P激活細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路活性后,激活后的細(xì)胞CD44、CD133蛋白表達(dá)較對(duì)照組增加(P<0.05;圖7)。

圖7 激活PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)CD44、CD133蛋白表達(dá)的影響a為P<0.05,與對(duì)照組比較。

3 討 論

盡管外科技術(shù)、化療藥物和分子靶向藥物取得了新進(jìn)展,但CRC患者數(shù)量卻正在逐步增加[1]。至少有三分之一的CRC患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致死亡[3]。有研究證實(shí),MACC1可通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)CRC細(xì)胞進(jìn)展、耐藥,維持CSC特性[13-14]。本研究表明,在結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中過(guò)表達(dá)MACC1可誘導(dǎo)促進(jìn)CSC樣特性的發(fā)展。本研究結(jié)果表明,MACC1表達(dá)上調(diào)后,除了能促進(jìn)CRC惡性行為能力,還增強(qiáng)了CSC樣標(biāo)記物CD44、CD133的表達(dá)水平和增加了腫瘤球形成,同時(shí)PI3K/AKT通路參與了MACC1的上述對(duì)HCT116細(xì)胞的作用。然而,公認(rèn)為CRC發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多步驟多因素的復(fù)合作用下的不良事件,繼續(xù)尋找MACC1的協(xié)同因素對(duì)CRC進(jìn)展機(jī)制的闡明有重要意義。

低氧微環(huán)境是CSC形成和維持的關(guān)鍵成分,低氧微環(huán)境能誘導(dǎo)CD133等作為CSC的特異性生物標(biāo)志物的表達(dá)[4]。CSC具有3個(gè)獨(dú)特的特性:自我更新、顯示親代腫瘤癌細(xì)胞的所有特征、表達(dá)一組獨(dú)特的表面生物標(biāo)志物[15]。目前的抗腫瘤治療缺乏對(duì)CSC的靶向性,不能導(dǎo)致腫瘤的消退。本研究表明,低氧環(huán)境有進(jìn)一步協(xié)調(diào)加強(qiáng)MACC1誘導(dǎo)促進(jìn)CSC樣特性的作用和進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤增殖、遷移和侵襲能力,且PI3K/AKT通路參與其中。CSC是存在于特定的生態(tài)環(huán)境中的,目前針對(duì)CSC的研究,分離出來(lái)的CSC大多數(shù)脫離了微環(huán)境情況下的研究。這提示筆者結(jié)合微環(huán)境進(jìn)行CSC的研究可能是更加科學(xué)合理的一種方法。

目前CRC中關(guān)于低氧微環(huán)境與MACC1兩者如何相互作用促進(jìn)CSC樣特性的機(jī)制尚不明確。低氧微環(huán)境已被證實(shí)可通過(guò)激活PI3K/AKT通路調(diào)控誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞出現(xiàn)CSC樣特性[15-17]。這提示低氧微環(huán)境和MACC1可能通過(guò)某些相同通路共同促進(jìn)CRC的CSC樣特性。本研究結(jié)果表明,在MACC1過(guò)表達(dá)的CRC細(xì)胞中,p-AKT表達(dá)水平增高,表明PI3K/AKT的激活增強(qiáng)。隨后,740 Y-P處理的細(xì)胞的CSC標(biāo)記物表達(dá)明顯升高。這些結(jié)果表明,PI3K/AKT信號(hào)通路可能在低氧微環(huán)境和MACC1促進(jìn)結(jié)腸癌CSC樣特性中發(fā)揮關(guān)鍵作用;然而,這一過(guò)程具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述,MACC1過(guò)表達(dá)促進(jìn)CRC腫瘤干細(xì)胞樣特性出現(xiàn),并且低氧環(huán)境能促進(jìn)加強(qiáng)這種作用,其中機(jī)制通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)CRC細(xì)胞出現(xiàn)CSC樣特性。針對(duì)低氧微環(huán)境和MACC1的策略可能是CRC中消除CSC的潛在靶點(diǎn)。但需要進(jìn)一步的研究來(lái)確定低氧微環(huán)境和MACC1在腫瘤干細(xì)胞樣特性中的作用,并了解其潛在的機(jī)制。