白雪, 高福賢, 王春曉, 黃新瑞

滄州市人民醫(yī)院婦科一區(qū),河北滄州061000

宮頸癌(cervical cancer,CC)是女性常見婦科惡性腫瘤,人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)尤其是HPV-16和HPV-18的持續(xù)感染在宮頸癌發(fā)生中起著重要作用[1]。盡管隨著宮頸癌篩查和HPV疫苗普及,宮頸癌發(fā)病率略有下降,但近年宮頸癌發(fā)病有年輕化趨勢(shì),尤其對(duì)于無(wú)手術(shù)機(jī)會(huì)的晚期宮頸癌尚需要更有效的治療方案。近年來(lái),免疫治療的興起給晚期宮頸癌患者帶來(lái)了新的希望。F-box蛋白22(FBXO22)是F-box蛋白家族中的一員,FBXO22在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用,FBXO22可通過(guò)泛素化降解抑癌基因及其產(chǎn)物從而促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)程[2],如FBXO22通過(guò)泛素化降解核PTEN促結(jié)腸癌進(jìn)程[3];FBXO22通過(guò)多聚泛素化降解P21促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖,并引起肝癌患者不良預(yù)后[4];FBXO22還可促進(jìn)抑癌基因LKB1降解,下調(diào)其表達(dá)水平,促進(jìn)肺癌惡性進(jìn)程[5];FBXO22通過(guò)調(diào)控不同底物,促進(jìn)乳腺癌生長(zhǎng),增強(qiáng)[6]或抑制[7]其遷移和侵襲能力等。本研究初步通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn),FBXO22在宮頸癌患者中表達(dá)上調(diào),提示FBXO22可能與宮頸癌密切相關(guān),因此本研究旨在探討FBXO22表達(dá)對(duì)HPV陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,進(jìn)一步挖掘?qū)m頸癌免疫治療的新靶點(diǎn),為臨床研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

H8細(xì)胞(人宮頸上皮永生化細(xì)胞)、宮頸癌細(xì)胞株Hela(HPV-18+)、CaSki(HPV-16+)、SiHa(HPV-)(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù));FBXO22抗體(購(gòu)自美國(guó)Proteintech Group);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠源或兔源免疫球蛋白抗體(美國(guó)CST公司);Lipo2000(Life Technologies);DNA聚合酶(北京NEB生物技術(shù)有限公司);T4連接酶(Takara);Transwell小室(美國(guó)Corning);電泳儀(美國(guó)Bio-rad公司);PCR儀(瑞士Roche公司);流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

H8細(xì)胞和CaSki細(xì)胞使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,Hela細(xì)胞和SiHa細(xì)胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置于37 ℃ 5%CO2恒濕培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。Hela細(xì)胞和CaSki細(xì)胞均被分為空載體組(sh-NC組)和FBXO22敲低組(敲低組),或?qū)φ战M和FBXO22過(guò)表達(dá)組(過(guò)表達(dá)組)。

1.3 真核過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和shRNA質(zhì)粒的構(gòu)建

真核過(guò)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建:設(shè)計(jì)FBXO22引物序列(F:5′-CGGAGCACCTTCGTGTTGA-3′;R:5′-CACACACTCCCTCCATAAGCG-3′)并合成,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將FBXO22序列和過(guò)表達(dá)真核PBABE-Flag載體用T4 DNA ligase連接,轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α,加入抗性LB培養(yǎng)基,均勻涂布平板,倒置后37 ℃過(guò)夜。從每個(gè)轉(zhuǎn)化平板上分別挑取4個(gè)克隆,搖菌并提取質(zhì)粒,37 ℃酶切2 h。電泳并回收酶切的FBXO22片段,同時(shí)進(jìn)行質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證正確性。FBXO22敲除shRNA質(zhì)粒構(gòu)建:將特異靶向FBXO22的shRNA片段與線性化pSIREN Retro-Q載體連接,構(gòu)建特定基因的敲除質(zhì)粒。靶向shRNA片段的序列為shFBXO22-1(sh-1,GTGTGGTCCTTGTCTTTGGTT)和shFBXO22-2(sh-2,CGCATCTTACCACATACAGTT)。同時(shí),使用無(wú)靶向效應(yīng)的序列插入到pSIREN Retro-Q載體構(gòu)建空載體sh-NC組。

1.4 Hela、CaSki細(xì)胞過(guò)表達(dá)和沉默F(xiàn)BXO22基因的轉(zhuǎn)染

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后,調(diào)整細(xì)胞為1×105個(gè)/mL,分別將Hela和CaSki細(xì)胞接種于6孔板24 h后取出,分別用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌3次,放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)至60%～70%匯合時(shí)開始轉(zhuǎn)染。取200 μL無(wú)血清培養(yǎng)基,加入12 μL質(zhì)粒和12 μL轉(zhuǎn)染試劑,渦旋10 s后于室溫靜置15 min,緩慢滴入6孔板,輕柔搖晃混勻;6 h后細(xì)胞換液,繼續(xù)正常培養(yǎng)備用。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)

用TRIzol試劑提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR引物序列GAPDH:上游5′-GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC-3′,下游5′-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3′;FBXO22:上游5′-CGGAGCACCTTCGTGTTGA-3′,下游5′-CACACACTCCCTCCATAAGCG-3′。PCR反應(yīng)條件:94 ℃5 min,94 ℃40 s,53 ℃45 s,72 ℃80 s,28個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。采用2-ΔΔCT公式計(jì)算表達(dá)量。

1.6 Western blotting檢測(cè)

收集細(xì)胞后提取總蛋白,進(jìn)行BCA法蛋白定量,凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜3 h,封閉1 h。加入一抗,4 ℃過(guò)夜孵育,TBST洗膜3次,每次10 min。加入二抗孵育1 h,TBST洗膜3次,每次10 min。使用ECL發(fā)光試劑,進(jìn)行X片曝光、顯影、定影,檢測(cè)FBXO22表達(dá)。

1.7 MTT檢測(cè)

收集細(xì)胞懸液,每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,混勻后的細(xì)胞懸液每孔加入100 μL到96孔板。細(xì)胞貼壁5 h后更換為150 μL完全培養(yǎng)基,再加入20 μL 5 g/L MTT溶液,培養(yǎng)4 h;棄去上清,每孔加入150 μL DMSO溶液;常溫?fù)u床搖晃10～15 min。選擇490 nm波長(zhǎng),在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光密度值。重復(fù)檢測(cè)10天,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.8 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

收集細(xì)胞,使用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù)。各實(shí)驗(yàn)組接種細(xì)胞700個(gè)/孔于6孔板中,每3天換液并觀察細(xì)胞狀態(tài),培養(yǎng)14天。鏡下拍照,每孔用PBS洗滌1次,加入1 mL 4%多聚甲醛固定40 min,再用PBS洗滌1次,加入結(jié)晶紫染液1 mL,染色15 min。PBS洗滌細(xì)胞,晾干后對(duì)整板及每孔拍照,觀察克隆形成情況。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后,用4 ℃預(yù)冷PBS洗滌并重懸,1 500 r/min離心5 min,加入4 ℃預(yù)冷的70%乙醇吹打混勻,用封口膜封口后4 ℃冰箱過(guò)夜固定。檢測(cè)前將固定的細(xì)胞2 000 r/min離心4 min,用4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌2次,100 μL 100 mg/L RNase A和0.2% Triton X-100重懸細(xì)胞,37 ℃水浴30 min,加入1 g/L碘化丙啶50 μL混勻,室溫避光孵育30 min。在流式細(xì)胞儀檢測(cè)前用300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾,上機(jī)結(jié)束后用FlowJo軟件分析細(xì)胞周期時(shí)相分布。

1.10 劃痕實(shí)驗(yàn)

在6孔板中用間距0.5 cm橫線作標(biāo)記,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后接種入6孔板培養(yǎng)過(guò)夜,直至單層細(xì)胞覆蓋6孔板。用移液槍頭在6孔板上垂直畫一條直線,用PBS洗滌3次,使用無(wú)血清培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中培養(yǎng);在顯微鏡下定期觀察0、24 h,隨機(jī)采集3張以上視野圖像進(jìn)行觀察并測(cè)量劃痕寬度。

1.11 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

在Transwell小室涂布稀釋后的基質(zhì)膠,靜置成膜。每組細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,在小室上腔中接種100 μL細(xì)胞稀釋液,下腔中加入500 μL含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液。Transwell小室置于培養(yǎng)箱中36 h。擦去小室中上層細(xì)胞,加入4%多聚甲醛固定10 min后用0.1%結(jié)晶紫溶液染色。鏡下隨機(jī)選取4個(gè)高倍視野計(jì)數(shù),取4個(gè)視野均值作為穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞FBXO22表達(dá)水平的比較

FBXO22 mRNA和蛋白表達(dá)水平Hela、CaSki、SiHa細(xì)胞高于H8細(xì)胞,HPV陽(yáng)性的Hela和CaSki細(xì)胞高于HPV陰性的SiHa細(xì)胞(P<0.05;圖1)。提示FBXO22在宮頸癌細(xì)胞中呈現(xiàn)過(guò)表達(dá),且在HPV陽(yáng)性的宮頸癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)更為顯著,因此Hela和CaSki被選定用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 各組細(xì)胞FBXO22表達(dá)水平的比較A為Western blotting;B為qRT-PCR。a為P<0.05,與H8細(xì)胞比較;b為P<0.05,與SiHa細(xì)胞比較。

2.2 FBXO22穩(wěn)定敲低和過(guò)表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建

與sh-NC組比較,敲除質(zhì)粒(sh-1和sh-2)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后FBXO22 mRNA和蛋白表達(dá)均降低(P<0.05;圖2A),提示成功構(gòu)建穩(wěn)定敲低FBXO22基因的Hela和CaSki細(xì)胞,其中sh-1轉(zhuǎn)染效率較高,因此sh-1被選定為敲低組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。與對(duì)照組比較,過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后FBXO22 mRNA和蛋白表達(dá)均增加(P<0.05;圖2B),提示成功構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)FBXO22基因的Hela和CaSki細(xì)胞。

圖2 FBXO22穩(wěn)定敲低和過(guò)表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建A為敲低FBXO22時(shí)的Western blotting和qRT-PCR;B為過(guò)表達(dá)時(shí)的Western blotting和qRT-PCR。a為P<0.05,與sh-NC組比較;b為P<0.05,與對(duì)照組比較。

2.3 FBXO22穩(wěn)定敲低和過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在Hela細(xì)胞和CaSki細(xì)胞中,敲低組細(xì)胞增殖能力低于sh-NC組,過(guò)表達(dá)組細(xì)胞增殖能力高于對(duì)照組(P<0.05;圖3),提示FBXO22對(duì)Hela、CaSki細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用。

圖3 FBXO22穩(wěn)定敲低和過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響a為P<0.05,與sh-NC組比較;b為P<0.05,與對(duì)照組比較。

2.4 FBXO22穩(wěn)定敲低和過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn),敲低組G2/M細(xì)胞百分率高于sh-NC組,過(guò)表達(dá)組G2/M細(xì)胞百分率低于對(duì)照組(P<0.05;圖4),提示FBXO22能抑制Hela、CaSki細(xì)胞G2/M期阻滯,促進(jìn)細(xì)胞異常增殖。

圖4 FBXO22穩(wěn)定敲低和過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期的影響

2.5 FBXO22穩(wěn)定敲低和過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移的影響

24 h后劃痕寬度Hela細(xì)胞敲低組(59.2±0.68)μm大于sh-NC組(37.1±0.54)μm,CaSki細(xì)胞敲低組(57.6±0.64)μm大于sh-NC組(37.6±0.59)μm(P<0.05);Hela細(xì)胞過(guò)表達(dá)組(12.4±0.37)μm小于對(duì)照組(36.9±0.43)μm,CaSki細(xì)胞過(guò)表達(dá)組(14.5±0.67)μm小于對(duì)照組(35.2±0.68)μm(P<0.05;圖5),表明FBXO22可增強(qiáng)Hela、CaSki細(xì)胞的遷移能力。

圖5 FBXO22穩(wěn)定敲低和過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移的影響(100×)

2.6 FBXO22穩(wěn)定敲低和過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞侵襲的影響

穿膜細(xì)胞數(shù)Hela細(xì)胞敲低組(69±7.23)個(gè)低于sh-NC組(102±5.64)個(gè),CaSki細(xì)胞敲低組(65±6.44)個(gè)低于sh-NC組(101±4.59)個(gè)(P<0.05);Hela細(xì)胞過(guò)表達(dá)組(183±6.63)個(gè)高于對(duì)照組(102±5.64)個(gè),CaSki細(xì)胞過(guò)表達(dá)組(178±3.47)個(gè)高于對(duì)照組(101±4.59)個(gè)(P<0.05;圖6),提示FBXO22可增強(qiáng)Hela、CaSki細(xì)胞的侵襲能力。

圖6 FBXO22穩(wěn)定敲低和過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞侵襲的影響(200×)

3 討 論

世界衛(wèi)生組織調(diào)查報(bào)告顯示,2020年宮頸癌仍是女性常見的癌癥之一[8],由于宮頸癌惡性程度高、侵襲性強(qiáng)、治療方法局限、發(fā)病年輕化、預(yù)后較差、易復(fù)發(fā)[9-10]等特點(diǎn),其發(fā)病率和病死率仍居高不下。HPV是宮頸癌主要致病因素,在癌病理組織中檢出率達(dá)99%,HPV-16和HPV-18是高危人乳頭瘤病毒,占宮頸癌發(fā)病的70%。為了探索宮頸癌的病因,開發(fā)更高效的治療方法,進(jìn)行宮頸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為影響因素及機(jī)制的研究具有重要意義。

FBXO22第一次進(jìn)入人們視野是作為p53的靶向基因[11],參與p53誘導(dǎo)的特異性蛋白的降解[12]。有研究表明,FBXO22是原發(fā)性乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo),FBXO22過(guò)表達(dá)患者的總生存期和無(wú)病生存期明顯短于FBXO22低表達(dá)患者,敲除FBXO22抑制了裸鼠體外細(xì)胞生長(zhǎng)和腫瘤形成,而過(guò)表達(dá)FBXO22增加了細(xì)胞活力[13]。FBXO22通過(guò)缺氧誘導(dǎo)因子-1α/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子途徑抑制乳腺癌細(xì)胞[14]、黑素瘤細(xì)胞[15]遷移、侵襲和血管生成。lncRNA 0006282通過(guò)miR-155上調(diào)FBXO22表達(dá),促進(jìn)胃癌的發(fā)展[16]。FBXO22通過(guò)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9抑制人腎細(xì)胞癌遷移[17];lncRNA SNHG14通過(guò)miR-433-3p/FBXO22軸促進(jìn)骨肉瘤進(jìn)展[18]。FBXO22通過(guò)MAPK/ERK通路促進(jìn)上皮性卵巢癌的生長(zhǎng)和遷移并抑制自噬[19]。另一方面,FBXO22有時(shí)表現(xiàn)出腫瘤的抑制特性。在雌激素受體陽(yáng)性和人表皮生長(zhǎng)因子受體2型陰性乳腺癌患者中,FBXO22表達(dá)降低與預(yù)后不良緊密相關(guān)[20]。FBXO22低表達(dá)與乳腺癌患者低生存率有關(guān)[21]。同樣有研究者在腎細(xì)胞癌組織的免疫組化分析中發(fā)現(xiàn),與正常腎組織比較,腎細(xì)胞癌標(biāo)本中FBXO22的表達(dá)水平降低,FBXO22在腎細(xì)胞癌患者中的低表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期和生存率差異有關(guān)[17]。

盡管FBXO22與多種腫瘤的相關(guān)性已被證實(shí),FBXO22對(duì)于宮頸癌發(fā)生、發(fā)展和遷移的作用卻未見證實(shí)。因此,本研究設(shè)計(jì)并進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn),以期發(fā)現(xiàn)宮頸癌治療的新靶點(diǎn),為宮頸癌的個(gè)體化精準(zhǔn)治療提供理論基礎(chǔ)。本研究首先通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn),FBXO22在宮頸癌患者中表達(dá)上調(diào),隨后通過(guò)qRT-PCR和Western blotting驗(yàn)證了HPV陽(yáng)性Hela細(xì)胞和CaSki細(xì)胞的FBXO22表達(dá)水平較HPV陰性的SiHa細(xì)胞和H8細(xì)胞顯著上調(diào)。為了進(jìn)一步確定FBXO22在HPV陽(yáng)性宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用,本研究選擇了HPV陽(yáng)性的Hela和CaSki細(xì)胞,利用細(xì)胞功能缺失或獲得的方法,分別構(gòu)建了FBXO22敲除和過(guò)表達(dá)模型,檢測(cè)構(gòu)建模型后FBXO22的表達(dá)水平,進(jìn)行了一系列細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,FBXO22低表達(dá)下調(diào)了FBXO22 mRNA及蛋白的表達(dá)水平,抑制了HPV陽(yáng)性Hela和CaSki細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲功能,而FBXO22過(guò)表達(dá)則可上調(diào)FBXO22 mRNA及蛋白的表達(dá)水平,促進(jìn)HPV陽(yáng)性Hela和CaSki細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲功能。

綜上,本研究結(jié)果顯示,FBXO22對(duì)宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等惡性生物學(xué)行為均有明顯的促進(jìn)作用。但關(guān)于其調(diào)控宮頸癌細(xì)胞惡性行為的具體機(jī)制尚不明確,需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。