姜虹羽, 莊秀娟, 蔡思銘, 岑紅霞

海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院兒科二區(qū),海南?？?70311

川崎病(Kawasaki disease,KD)又名皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征,在急性發(fā)作期體內(nèi)的免疫細(xì)胞被過度激活,形成炎癥因子風(fēng)暴,誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致心肌損傷,進(jìn)而引起心肌纖維化從而降低心肌順應(yīng)性[1-2]。辛伐他汀可以減輕缺血再灌注所引起的大鼠心肌細(xì)胞損傷,抑制心肌細(xì)胞凋亡,提升心肌細(xì)胞代謝活性從而改善心功能[3-4]。高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)被分泌到細(xì)胞外后可引起強(qiáng)烈的促炎作用,與組織細(xì)胞表面晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor of advanced glycation endproducts,RAGE)高親和力結(jié)合,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[5-6]。既往研究證實HMGB1的表達(dá)與心肌損傷密切相關(guān)[7]。然而,辛伐他汀是否對川崎病誘導(dǎo)的心肌損傷具有保護(hù)作用目前仍未可知。本研究探討辛伐他汀對川崎病大鼠心肌的影響及機(jī)制,為川崎病誘導(dǎo)的心肌損傷提供新的診療方案。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

干酪乳酸桿菌、細(xì)菌肉湯培養(yǎng)基購自上海微生物保種公司;SDS裂解液購自上海碧云天生物科技公司;RNA酶、DNA酶、蛋白酶抑制劑購自上海生工公司;肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB,CK-MB)、心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cardiac troponin Ⅰ,cTnI)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)試劑盒購自上海聯(lián)科生物科技公司;HE染色試劑盒購自上海碧云天生物科技公司;抗凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、促凋亡蛋白Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、促凋亡蛋白活化的Caspase-3(cleaved-Caspase-3)、HMGB1、RAGE、GAPDH抗體購自美國Abcam公司。

1.2 實驗動物及處理

4周齡SD雄性大鼠購自上海睿太莫斯生物科技有限公司;川崎病大鼠模型造模流程參考文獻(xiàn)[8]。在37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中使用肉湯培養(yǎng)基擴(kuò)增干酪乳酸桿菌菌種5天;培養(yǎng)基8 000 g離心30 min,取沉淀細(xì)菌組分,加入SDS裂解液過夜裂解。8 000 g離心裂解液15 min,洗滌3次,加入5 mL RNA酶(100 mg/L)及5 mL DNA酶(100 mg/L)混合于37 ℃過夜孵育。次日,離心棄上清,洗滌3次獲得細(xì)菌組分,將其置于超聲細(xì)胞破碎儀中,冰浴條件下破碎10 min,洗滌3遍,最后利用高速離心機(jī)12 000 g低溫離心2 h,棄去沉淀,所得上清即為川崎病大鼠模型造模溶液,將其稀釋至1 g/L造模備用。

將24只SD大鼠隨機(jī)均分為對照組、模型組和辛伐他汀組。對照組大鼠腹腔注射1 mL生理鹽水;模型組大鼠腹腔注射KD造模溶液1 mL;辛伐他汀組大鼠腹腔注射KD造模溶液1 mL和辛伐他汀溶液(100 mg/kg)。辛伐他汀給藥方式參照文獻(xiàn)[9]。每日監(jiān)測各組大鼠的存活情況。造模后28天結(jié)束動物實驗并取材,檢測相關(guān)指標(biāo)變化情況。造模后可通過心臟超聲及病理切片驗證川崎病誘導(dǎo)的心肌損傷程度。

1.3 大鼠心臟功能檢測

各組大鼠使用1.5%的異氟烷麻醉,仰臥位固定于小動物加熱儀器,用除毛膏將大鼠左側(cè)胸前毛發(fā)脫去,涂抹超聲耦合劑,將探頭放于左側(cè)胸前,在乳頭水平用M型取樣線檢測大鼠心率,并完整檢測多個心動周期,分別在收縮期與舒張期測量左室內(nèi)徑等心臟結(jié)構(gòu)參數(shù),計算左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)及左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)。

1.4 HE染色

取大鼠心肌組織于4%多聚甲醛中固定過夜,采用常規(guī)石蠟包埋切片,脫蠟復(fù)水方式進(jìn)行HE染色,光鏡下觀察心肌結(jié)構(gòu)和炎癥細(xì)胞浸潤情況。

1.5 血清心肌損傷標(biāo)志物檢測

各組大鼠取材后收集主動脈血1 mL,3 000 r/min離心10 min,棄去沉淀收集血清,按照ELISA試劑盒說明書步驟檢測血清中CK-MB及cTnI水平。

1.6 心肌組織炎癥因子檢測

取50 mg心肌組織放入研缽中,預(yù)冷的PBS清洗,加入ELISA實驗裂解液(質(zhì)量/體積比為1∶3),將心肌組織充分研磨15 min,12 000 g低溫下離心20 min,棄去沉淀并收集上清進(jìn)行后續(xù)檢測。按照ELISA試劑盒要求加入各種試劑,采用酶標(biāo)儀計算IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.7 免疫印跡法

每只大鼠取50 mg心肌組織放入離心管,加入SDS裂解液提取總蛋白并測定蛋白含量。按照免疫印跡法操作流程,10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離蛋白,半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,5%牛血清白蛋白溶液對膜進(jìn)行室溫封閉3 h。加入稀釋好的一抗Bcl-2、Bax、cleaved-Cpaspase-3、HMGB1、RAGE(1∶1 000),與膜在4 ℃共孵育16 h過夜。次日,加入稀釋好的二抗(1∶5 000)與膜共孵育1 h,后暗室顯影并用Image J軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度值定量分析。以目標(biāo)條帶和GAPDH內(nèi)參條帶的比值作為各組目標(biāo)條帶表達(dá)量,Image J分析灰度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。多組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用Dunnett檢驗。P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 辛伐他汀對各組大鼠心臟功能的影響

與對照組比較,模型組大鼠心肌損傷明顯,LVEF及LVFS水平明顯下降(P<0.05);與模型組比較,辛伐他汀組大鼠心臟情況明顯好轉(zhuǎn),LVEF及LVFS值恢復(fù)至正常水平(P<0.05;圖1)。

圖1 各組大鼠心臟超聲結(jié)果A、B、C分別為對照組、模型組、辛伐他汀組大鼠心臟彩超結(jié)果;D為各組川崎病大鼠LVEF、LVFS值的柱狀圖。a為P<0.05,與對照組比較;b為P<0.05,與模型組比較。

2.2 辛伐他汀對大鼠心肌損傷及炎癥水平的影響

HE染色結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組小鼠心肌組織可見心肌纖維斷裂、心肌纖維化和炎癥細(xì)胞浸潤,而給與辛伐他汀治療后心肌纖維斷裂、纖維化及炎癥細(xì)胞浸潤明顯減輕(圖2)。與對照組比較,模型組大鼠CK-MB、cTnI、IL-1β、IL-6及TNF-α水平顯著增高(P<0.05);與模型組比較,辛伐他汀組大鼠上述各指標(biāo)水平顯著降低(P<0.05;表1)。

表1 各組大鼠血清中CK-MB、cTnI及心肌組織中炎癥因子水平比較(n=8)

圖2 各組大鼠心肌組織HE染色結(jié)果(200×)A為對照組;B為模型組;C為辛伐他汀組。

2.3 辛伐他汀對各組大鼠心肌組織凋亡相關(guān)蛋白的影響

與對照組比較,模型組小鼠心肌組織中Bax、cleaved-Caspase-3表達(dá)明顯升高,Bcl-2表達(dá)顯著下降(P<0.05);與模型組比較,辛伐他汀組大鼠心肌組織Bax、cleaved-Caspase-3表達(dá)明顯下降,Bcl-2顯著升高(P<0.05,圖3)。

圖3 辛伐他汀對各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響1為對照組;2為模型組;3為辛伐他汀組。A為各組大鼠凋亡相關(guān)蛋白Western blotting結(jié)果;B為各組大鼠凋亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)水平的柱狀圖。a為P<0.05,與對照組比較;b為P<0.05,與模型組比較。

2.4 辛伐他汀對各組心肌組織HMGB1/RAGE信號通路相關(guān)蛋白的影響

模型組小鼠心肌組織HMGB1、RAGE表達(dá)較對照組明顯升高(P<0.05)。辛伐他汀組大鼠心肌組織HMGB1、RAGE表達(dá)較模型組明顯降低(P<0.05,圖4)。

圖4 辛伐他汀對各組心肌組織HMGB1/RAGE信號通路相關(guān)蛋白的影響1為對照組;2為模型組;3為辛伐他汀組。A為各組大鼠HMGB1及RAGEWestern blotting結(jié)果;B為各組大鼠HMGB1及RAGE蛋白相對表達(dá)水平的柱狀圖。a為P<0.05,與對照組比較;b為P<0.05,與模型組比較。

3 討 論

川崎病是兒童?；嫉囊环N出疹性急癥,為兒童免疫性疾病中的診療難點[10]。非特異性血管炎癥是川崎病的主要臨床病理特點,對冠狀動脈及其周圍心肌組織損害更為嚴(yán)重,最終將導(dǎo)致心功能下降和冠狀動脈瘤。本研究利用干酪乳酸桿菌提取物制備大鼠川崎病模型,通過觀察辛伐他汀對川崎病誘發(fā)的心肌損傷的影響及相關(guān)分子機(jī)制,證實辛伐他汀可明顯增強(qiáng)川崎病大鼠的心肌功能,提升LVEF與LVSF占比,同時抑制心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng),從而實現(xiàn)保護(hù)心肌的作用。

辛伐他汀能降低膽固醇及低密度脂蛋白水平[11],也可緩解脂多糖誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)[12]。在心肌肥厚、糖尿病心肌病或心肌缺血再灌注損傷中通過調(diào)控腺苷酸活化蛋白激酶、絲裂原活化蛋白激酶、核因子E2相關(guān)因子2等蛋白起到保護(hù)心肌的作用[13]。目前,辛伐他汀抑制炎癥的作用機(jī)制尚存在爭議。本研究結(jié)果顯示,辛伐他汀可以顯著抑制心肌細(xì)胞凋亡,同時也能減輕炎癥細(xì)胞浸潤和降低炎癥因子水平。Bax、Bcl-2及Caspase-3是經(jīng)典的線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白,反映細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。辛伐他汀可調(diào)控內(nèi)源性凋亡途徑抑制成骨細(xì)胞凋亡,促進(jìn)線粒體功能和成骨效果[14]。因此,線粒體凋亡途徑可能是辛伐他汀發(fā)揮生理作用的重要機(jī)制。

HMGB1是促炎關(guān)鍵蛋白,和其特異性受體RAGE結(jié)合后會開啟促炎信號通路,因此靶向二者的表達(dá)及結(jié)合能力為抗炎藥物開發(fā)提供了全新的有效位點。研究發(fā)現(xiàn),利用HMGB1的抗體可以有效緩解非酒精性脂肪肝中的肝臟炎癥反應(yīng)[15]。本研究結(jié)果顯示,辛伐他汀能顯著降低川崎病大鼠心肌組織中HMGB1及RAGE的表達(dá)量,降低炎癥因子的表達(dá)和減少心肌細(xì)胞凋亡;提示辛伐他汀對心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可能與抑制HMGB1/RAGE信號通路功能有關(guān)。

綜上所述,辛伐他汀可抑制川崎病導(dǎo)致的大鼠心肌損傷,其機(jī)制可能與抑制HMGB1/RAGE信號通路有關(guān)。